CN101824445B - 一种13c稳定性同位素标记纤维素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)选用细菌纤维素高产木醋杆菌为出发菌株；(2)13C6葡萄糖-M9培养基用作发酵培养基；(3)30℃左右静置培养30d；(4)80℃左右酸碱交替洗涤、分离提纯细菌纤维素，最后经冷冻干燥得到13C稳定性同位素标记纤维素。本发明工艺简单，设备要求不高，方便在实验室条件下制备13C高丰度的13C稳定性同位素标记纤维素产品。

Description

一种13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法
技术领域
本发明涉及稳定性同位素标记化合物生产领域，尤其涉及采用微生物发酵制备13C稳定性同位素标记纤维素高分子聚合物的方法。
背景技术
自然界的纤维素绝大部分是由植物产生的，少数微生物也能合成纤维素，微生物合成的纤维素与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的高分子化合物。能够合成纤维素的微生物种类很多，主要有：醋酸杆菌属(Acetobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、八叠球菌属(Sarcina)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)和气杆菌属(Aerobacter)。其中比较典型的是醋酸杆菌属中的木醋杆菌(Acetobacter xylinus)，它具有很高的纤维素生产能力。
通常采用化学方法合成稳定性同位素标记的化合物，利用生物法合成稳定性同位素标记化合物的报道较少，中国专利公开了一种利用生物发酵法合成15N稳定性同位素标记精氨酸(CN 1869244A)、15N标记亮氨酸(CN 101235402A)的方法等。但是，还未见有利用微生物发酵合成并有效制备13C稳定性同位素标记纤维素的专利报道。利用微生物合成13C稳定性同位素标记纤维素，13C容易标记且丰度高，工艺简单，制备方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物发酵合成并制备13C稳定性同位素标记纤维素的方法。
本发明所述的13C稳定性同位素标记纤维素的生产制备方法如下：
(1)选用菌株
选取适用发酵生产细菌纤维素的醋酸杆菌属，以木醋杆菌(Acetobacter xylinus)为代表。
(2)发酵培养基
以13C6葡萄糖为唯一碳源的M9基本培养基，其配方为：磷酸氢二钠5.0～7.0g/l，磷酸二氢钾2.0～4.0g/l，氯化钠0.5～1.0g/l，氯化铵1.0～2.0g/l，MgSO4·7H2O 0.4～0.5g/l，CaCl2·2H2O10～15mg/l，13C6葡萄糖10～30g/l。
(3)静置培养
取1环活化好的斜面种子接入液体活化培养基，30℃振荡培养24～36h，摇床转速为160rpm，作为预培养的种子。
静置培养前的预培养：将上述种子接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6～8％，28℃～30℃振荡培养24～36h，摇床转速为160～180rpm，作为静置培养的种子。
静置培养：将13C6葡萄糖-M9液体培养基活化的种子，接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6～8％，28℃～30℃静置培养30d左右。静置培养采用浅层培养的方法，95mm直径的灭菌扁烧杯盛有50～80ml 13C6葡萄糖-M9液体培养基，可换气的培养用膜封口。
(4)分离提纯
将静置培养获得的13C稳定性同位素标记纤维素置于已预热至60℃～80℃的蒸馏水中，60℃～80℃振荡洗涤20min～30min，摇床转速为150～250rpm；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至60℃～80℃的1mol/l的NaOH溶液中，60℃～80℃振荡洗涤20min～30min，摇床转速为150～250rpm；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至60℃～80℃的1mol/l的HAC溶液中，60℃～80℃振荡洗涤20min～30min，摇床转速为150～250rpm，重复三次；最后用双蒸水冲洗13C稳定性同位素标记纤维素，冷冻真空干燥获得产品。
所述步骤(3)斜面培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氢二钠10g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15g/l，HAC调pH 6.0。
所述液体活化培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氢二钠10g/l，葡萄糖20g/l，HAC调pH 6.0。
具体实施方式
以下将结合具体实施例，对本发明作进一步说明，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：
使用木醋杆菌(Acetobacter xylinus)为出发菌株，使用的培养基包括斜面培养基、液体活化培养基、13C6葡萄糖-M9液体培养基。各培养基的配方如下：
斜面培养基：蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氢二钠10g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15g/l，HAC调pH 6.0。
液体活化培养基：蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氢二钠10g/l，葡萄糖20g/l，HAC调pH 6.0。
13C6葡萄糖-M9培养基：磷酸氢二钠6.8g/l，磷酸二氢钾3.0g/l，氯化钠0.5g/l，氯化铵1.0g/l，MgSO4·7H2O 0.4～0.5g/l，CaCl2·2H2O 10～15mg/l，13C6葡萄糖20g/l。
取1环活化好的斜面种子接入液体活化培养基，30℃振荡培养24～36h，摇床转速为160rpm，作为预培养的种子。将上述种子接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6％，30℃振荡培养24～36h，摇床转速为160rpm，作为静置培养的种子。将13C6葡萄糖-M9液体培养基活化的种子，接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6％，30℃静置培养30d。静置培养采用浅层培养的方法，95mm直径的灭菌扁烧杯盛有80ml 13C6葡萄糖-M9液体培养基，可换气的培养用膜封口。培养过程中，当细菌纤维素膜厚度达5mm左右时，适度摇动培养基，使细菌纤维素膜微浸入液体培养基中，继续静置培养。
将静置培养获得的13C稳定性同位素标记纤维素置于已预热至70℃的蒸馏水中，70℃振荡洗涤20min，摇床转速为160rpm；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至70℃的1mol/l的NaOH溶液中，70℃振荡洗涤20min，摇床转速为160rpm；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至70℃的1mol/l的HAC溶液中，70℃振荡洗涤20min，摇床转速为160rpm，重复三次；最后用双蒸水冲洗13C稳定性同位素标记纤维素，冷冻真空干燥获得产品。经同位素比率质谱仪分析得到的13C稳定性同位素标记纤维素产品，13C的丰度达99％。
实施例2：
使用的菌种、培养基培养方式基本同实施例1。静置培养采用浅层培养的方法，95mm直径的灭菌扁烧杯盛有50ml 13C6葡萄糖-M9液体培养基，可换气的培养用膜封口。培养过程中保持静置培养状态不变。将静置培养获得的13C稳定性同位素标记纤维素置于已预热至80℃的蒸馏水中，80℃振荡洗涤30min，摇床转速为220rpm；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至80℃的1mol/l的NaOH溶液中，80℃振荡洗涤30min，摇床转速为220rpm；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至80℃的1mol/l的HAC溶液中，80℃振荡洗涤30min，摇床转速为220rpm，重复三次；最后用双蒸水冲洗13C稳定性同位素标记纤维素，冷冻真空干燥获得产品。经同位素比率质谱仪分析得到的13C稳定性同位素标记纤维素产品，13C的丰度达99％。

Claims (1)

1.一种13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，其特征在于，利用微生物发酵合成并制备13C稳定性同位素标记纤维素的方法，具体步骤包括：
(1)培养基配制：13C6葡萄糖-M9培养基：磷酸氢二钠5.0～7.0g/l，磷酸二氢钾2.0～4.0g/l，氯化钠0.5～1.0g/l，氯化铵1.0～2.0g/l，MgSO4·7H2O 0.4～0.5g/l，CaCl2·2H2O 10～15mg/l，13C6葡萄糖10～30g/l；
(2)发酵培养：将木醋杆菌(Acetobacter xylinus)接种步骤(1)所述培养基中，28℃～30℃条件下静置培养30d，培养过程中，当细菌纤维素膜5mm左右厚时，适度摇动培养基，使细菌纤维素膜微浸入液体培养基；静置培养的种子需要经过13C6葡萄糖-M9液体培养基活化预培养，培养温度28℃～30℃；
(3)产品制备：60℃～80℃酸碱交替洗涤，每次作用20min～30min，摇床转速为150～250rpm；提纯的13C稳定性同位素标记纤维素经冷冻干燥得到最终产品。
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