CN103421714B

CN103421714B - 一种芽孢杆菌及其在发酵生产聚羟基丁酸酯中的应用

Info

Publication number: CN103421714B
Application number: CN201310334420.9A
Authority: CN
Inventors: 黄少斌; 刘勇
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: CN103421714A

Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌及其在发酵生产聚羟基丁酸酯中的应用，所述芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏编号是CGMCC No.7488，保藏日期为2013年04月18日。该芽孢杆菌对温度有一定的耐受程度，在25～50℃温度条件下，均具有一定的产聚羟基丁酸酯的能力，其中该菌最佳的生长温度及产聚羟基丁酸酯的最佳温度为45℃，用于工业发酵生产聚羟基丁酸酯时无需经过降温或者说降温耗能将大大减少，降低生产成本。生产的聚羟基丁酸酯可用于制备医疗器材。

Description

一种芽孢杆菌及其在发酵生产聚羟基丁酸酯中的应用

技术领域

本发明涉及一株具有产聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）性能的芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5菌株及其在中温条件下产PHB的应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，缩写为PHA）是微生物利用可再生资源（如碳水化合物、脂肪酸等）在体内合成的一类生物聚酯，它不仅具有与传统化学合成高分子（如聚丙烯）相似的材料性质，而且还具有一般传统塑料所没有的性质，如生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性等特殊性质，更重要的是可以通过可再生资源获得，因此被认为是传统石化类塑料的最佳替代品，具有巨大的经济价值。此外，由于PHA能够与哺乳动物的组织相容，并且缓慢降解，还可用作人工骨等具有特殊功能的医学材料。近年来，越来越多的学者致力于研究PHA在医药及组织工程等方面的应用。

随着石油资源的日益枯竭，聚羟基脂肪酸酯（PHA）的研究开发引起了世界各国科学界和产业界越来越多的重视。相对于常温微生物，嗜温或嗜热微生物在中温发酵生产PHA具有许多优良的性能，表现为：（1）中温条件下底物溶解度提高，酶催化反应的速率也随之加快，可以有效提高细菌的生长速度和PHA生产效率；（2）中温条件下可以抑制杂菌的生成，保证嗜热产PHA微生物成为优势菌种，使发酵合成PHA系统更易稳定运行；（3）微生物发酵的自发产热可以维持嗜热微生物生长的适宜温度，无需额外的冷却与加热装置，可有效降低成本；（4）对嗜热微生物PHA合成相关酶及其编码基因的耐热机制进行分析研究，可为PHA合成酶的定向进化提供理论参考，并且所分离的耐热PHA合成酶也可应用于PHA的体外合成。

发明内容

本发明之目的是提供一种可以在中温条件下具有合成聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）性能的芽孢杆菌。

本发明另一目的在于提供上述芽孢杆菌在发酵生产聚羟基丁酸酯中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种具有产聚羟基丁酸酯性能的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌（Bacillusshackletonii）K5，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No.7488，保藏日期为2013年04月18日。

中温条件下具有合成聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）的菌株是芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5，该菌株具有以下特征：（1）菌落特征：菌落表面干燥不透明，边缘不整齐；（2）细胞形态特征：细胞成杆状，菌体单个、成对或链关排列，芽孢成椭圆形，中生或偏端生，革兰氏染色阳性；（3）芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5的16S rDNA基因序列特征：其16S rDNA具有序列表所示的核苷酸序列，片段长度为1406bp，在GenBank中的登录号为JX437933，与GenBank数据库比对表明，该菌株与芽孢杆菌（Bacillusshackletonii）的同源性为98%,其中与模式菌株Bacillus shackletonii strain Ka18和Bacillus shackletonii strain LMG18435最相似，同源性都达到了98%。应用MEGA软件采用Neighbor-Joining法绘制16S rDNA系统发育树，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征，该菌株最有可能是芽孢杆菌属（Bacillus sp.），并命名为Bacillus shackletonii strain K5。

所述芽孢杆菌发酵生产聚羟基丁酸酯的pH为5.0～9.0，发酵培养时间为12～48h，温度为25～50℃。优选地，pH为7.0，发酵培养时间为28h，温度为45℃。

芽孢杆菌的发酵培养基为无机培养基MSN，其成分为g/L：Na₂HPO₄·12H₂O,9.0;KH₂PO₄,1.5;MgSO₄·7H₂O,0.2;NH₄Cl,1.0;CaCl₂·2H₂O,0.02;葡萄糖20；微量元素溶液1mL；pH7.0～7.5；所述微量元素溶液成份，g/L：EDTA50.0；ZnSO₄2.2；CaCl₂5.5；MnCl₂·4H₂O5.06；FeSO₄·7H₂O5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O1.1；CuSO₄·5H₂O1.57；CoCl₂·6H₂O1.61。

所述芽孢杆菌的应用，具体生产步骤如下：

将芽孢杆菌K5接入已灭菌的LB培养基中，恒温25～50℃，摇床转速180r/min进行菌株活化；活化12h后，以5%的接种量接到无机培养基MSN中，在气浴恒温摇床上以180r/min进行培养，最终得到聚羟基丁酸酯。

所述LB培养基，g/L：胰蛋白胨10；酵母膏5；NaCl5。

所述芽孢杆菌生产的聚羟基丁酸酯用于制备医疗器材。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明涉及的芽孢杆菌K5能在LB培养基上快速生长。接入到碳源过量的无机培养基中后能在体内积累一定量的PHB。摇瓶培养实验中芽孢杆菌K5能够积累占细胞干重约69.9%的PHB，约每升细胞液能产2.28gPHB。

（2）本发明涉及的芽孢杆菌K5对温度有一定的耐受程度，K5可在25～50℃条件下生长并积累PHB，K5的最佳生长及产PHB的温度在45℃，而一般微生物的最佳生长温度都在40℃以下，K5应用于工业发酵生产PHB时可以减少对系统的降温甚至无需降温就能保证系统的正常生产，可以降低运行成本。

（3）本发明涉及的芽孢杆菌K5是一株革兰氏阳性细菌，细胞壁中脂多糖（LPS）含量极少，而革兰氏阴性菌中含有很多的脂多糖，而脂多糖是一种类毒素，能够引起免疫反应。革兰氏阴性菌积累的PHB中往往含有脂多糖，当用这种PHB生产一些医疗器材（如移植器材）时，易引起人或动物的免疫反应。革兰氏阳性细菌生产的PHB中不含有脂多糖，它生产的PHB作为移植器材使用植入人或动物体内时不会引发免疫反应。

附图说明

图1是K5在无机培养基上培养24h小时后的荧光显微镜图，a为在不开荧光条件下观察到的细菌及其体内PHB颗粒的立体图，b为在开荧光的条件下观察到的细菌体内的PHB颗粒图。

图2是K5的扫描电镜图。

图3是K5所产聚合物的傅立叶红外光谱图。

图4是K5所产聚合物的氢核磁共振（¹H-NMR）图。

图5是K5在摇瓶培养中生长及积累PHB的曲线图。

图6是生物发酵设备图，电动机1、pH检测及控制装置2、加料口3、排气口4、搅拌器5、冷却水出口6、冷却水进口7、培养液8、无菌空气9、放料口10。

具体实施方式

面结合具体实例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

菌种的选育

1.产聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）的菌株的初筛

本研究的样品取自生物滴滤系统，在生物滴滤系统的反应器内取出一块长有生物膜的填料至装有50mL灭菌的生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡至生物膜脱落，取出填料，得到含有微生物的菌液。在LB培养基中，加入琼脂（终浓度：15g/L），尼罗红（终浓度：0.5μg/L），葡萄糖（终浓度：2%）配制尼罗红琼脂板；将上述菌液涂布于尼罗红琼脂板上，在45℃条件下培养2天，待长出菌落后紫外光照射下观察荧光。由于尼罗红可以与聚羟基脂肪酸酯结合，在紫外光照射下发出荧光，因此可以根据荧光强度筛选获得能在中温条件下合成聚羟基脂肪酸酯的嗜热微生物。

2.产聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）的菌株的复筛

将上述分离纯化后得到的纯菌种菌落，分别接种于装有100mL无机培养液的三角瓶中，并在每个三角瓶内加入几粒灭菌的玻璃珠（尽量减小厌氧微环境对实验结果的影响），用4层纱布包好瓶口，放入振荡培养箱，具体参数如下：温度45℃，转速180r/min，培养时间24h。然后测定PHB含量，并经尼罗红染色后在荧光显微镜下观看细菌体内形成的PHB，筛出1株产PHB能力较强的出发菌株，编号为K5并保藏。

实施例2

芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5在生产PHB中的应用

将甘油管封存的芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5接入已灭菌的含100mL LB培养基的300mL锥形瓶中。将锥形瓶置于恒温摇床，恒温保持45℃，摇床转速180r/min进行菌株活化。活化12h后，以5%的接种量接到装有100mL无机培养基MSN的300mL锥开瓶中进行产PHB性能测定。为保证锥形瓶中空气与外界气体的交换，以封口膜封口，同样在45℃、气浴恒温摇床上以180r/min进行摇瓶培养，pH为7.0，培养28h。为保证数据的准确性，取发酵液做三个平行样，取平均值为最终PHB产量。结果表明芽孢杆菌（Bacillusshackletonii）K5能够积累占细胞干重约69.9%的PHB，约每升细胞液能产2.28g PHB。K5的生长曲线及产PHB情况见图5。

LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10；酵母膏5；NaCl5。

无机培养基MSN（g/L）：Na₂HPO₄·12H₂O,9.0;KH₂PO₄,1.5;MgSO₄·7H₂O,0.2;NH₄Cl,1.0;CaCl₂·2H₂O,0.02;葡萄糖20；微量元素溶液1mL；pH7.0～7.5。

微量元素溶液成份(g/L)：EDTA50.0；ZnSO₄2.2；CaCl₂5.5；MnCl₂·4H₂O5.06；FeSO₄·7H₂O5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O1.1；CuSO₄·5H₂O1.57；CoCl₂·6H₂O1.61。

实施例3

经过培养基的优化之后，用批次培养的方式在发酵罐（结构图见图6）中进行K5产PHB的研究。将100mL的K5种子培养液接入已灭菌的含2L无机培养基的发酵罐中，控制温度在45℃，pH为7.0，发酵培养48h。每隔4h取样50mL，测定PHB的含量。K5在发酵罐批次培养条件下能积累占细胞干重（9.76g/L）约72.6%的PHB，约每升细胞液能产7.09gPHB。相对于摇瓶培养，其产量能到了大大的提升。

实施例4

产物的提取及表征分析

1.芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5发酵产物的提取

将实施例2中的发酵液经4000r/min离心20分钟，得到的菌体细胞沉淀用蒸馏水重悬，再经10000r/min离心5min，如此重复3次，得菌体。将菌体细胞在－20℃冰箱中冰冻20分钟，然后经冷冻干燥至恒重，使用量为1g细胞干品加入10mL氯仿，于专用的抽提瓶反应釜中，在100℃下密封加热4h，冷却后，使用抽滤的方法去掉细胞碎片，得到澄清的氯仿溶液，将氯仿溶液加入到10倍体积的冰冷乙醇中，得到PHB沉淀，抽滤收集沉淀（如果PHB沉淀不完全，可以在4℃低温下延长沉淀时间以提高PHB得率）。将PHB沉淀重新溶解于氯仿中，并且重复上述步骤，得到较纯PHB沉淀物，将收集的PHB沉淀物放至40℃真空干燥箱中干燥24h，待其溶剂挥发完全后，即可得到较纯的PHB样品。

2.芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5发酵产物的傅立叶红外光谱（FTIR）分析

称取烘干后的待测样品0.005g放入研钵中，加入0.5gKBr粉末混匀，倒入玛瑙研钵中研磨10min，过筛（2μm），之后压片。扫描之后得到的红外光谱图3所示，查阅相关书籍及文献可知，FTIR光谱显示在1,724和1,281cm^-1处有强烈的吸收峰，它们分别代表酯基团和–CH基团；在1,457cm^-1处出现的这个峰对应CH₂基团中非对称的C–H键，而1,382cm^-1处的这个峰则是代表CH₃基团中对称的C–H键。1,133和1,184cm^-1处的两个峰代表聚合物单体中非对称和对称的C-O-C官能团；位于1,000到1,300cm^-1之间的峰代表酯基中C-O键的拉伸；3,437cm^-1处的这个特殊峰代表末端O-H键或者样品中水的吸收峰。

3.芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5发酵产物的氢核磁共振（¹H-NMR）分析

核磁共振氢谱用氘代氯仿（CDCl₃）作溶剂在25℃条件下进行，把10mg提取的聚酯和1mL的溶剂放入外径5mm的玻璃管中，测量过程中旋转，使磁场作用均匀。产物的核磁共振氢谱如图4所示。

图中我们所能看到的峰代表PHB中不同类型的H原子。1.28ppm处的这个双峰对应于甲基（－CH₃）中的3个氢，而2.57ppm处的这个双峰则是代表亚甲基（－CH₂－）中的两年氢。5.26ppm处的这个多重峰则是代表了次甲基（－CH－）中的氢原子。图中的结果与类似文献中PHB的氢核磁共振图的结果也吻合。

通过对芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）K5发酵产物的傅立叶红外光谱（FTIR）及氢核磁共振（¹H-NMR）分析可知K5所产的聚合物就是PHB。

Claims

1.一种芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为Bacillus shackletonii K5，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏编号是CGMCC No.7488，保藏日期为2013年04月18日。

2.权利要求1所述芽孢杆菌在发酵生产聚羟基丁酸酯中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌发酵生产聚羟基丁酸酯的pH为5.0～9.0，发酵培养时间为12～48h，温度为25～50℃。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述pH为7.0，发酵培养时间为28h，温度为45℃。

5.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于，芽孢杆菌的发酵培养基为无机培养基MSN，其成分为：Na₂HPO₄·12H₂O,9.0；KH₂PO₄,1.5；MgSO₄·7H₂O,0.2；NH₄Cl,1.0；CaCl₂·2H₂O,0.02；葡萄糖20；微量元素溶液1mL；pH7.0～7.5；所述微量元素溶液成份为：EDTA 50.0；ZnSO₄2.2；CaCl₂5.5；MnCl₂·4H₂O 5.06；FeSO₄·7H₂O 5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O 1.1；CuSO₄·5H₂O 1.57；CoCl₂·6H₂O 1.61；上述单位均为g/L。

6.权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌生产的聚羟基丁酸酯用于制备医疗器材。

7.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌生产的聚羟基丁酸酯用于制备医疗器材。