CN106635887B

CN106635887B - 一种嗜热解糖厌氧杆菌及其在生物制氢中的应用

Info

Publication number: CN106635887B
Application number: CN201611020566.6A
Authority: CN
Inventors: 朱明军; 胡彬彬
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2036-11-21
Also published as: CN106635887A

Abstract

本发明公开了一种嗜热解糖厌氧杆菌及其在生物制氢中的应用。该嗜热解糖厌氧杆菌的名称为嗜热解糖厌氧杆菌MJ1，保藏号为GDMCC No：60096，于2016年10月31日保藏于位于中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。该菌株具有如下优点：可以直接利用五碳糖和六碳糖；可以直接利用酸预处理液中的木糖，不需要额外的酸预处理液解毒过程；具有较高的氢气产量；具有较高的产氢效率。因此，该菌株在生物制氢中具有广阔的应用推广前景。

Description

一种嗜热解糖厌氧杆菌及其在生物制氢中的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵产氢技术领域，特别涉及一种嗜热解糖厌氧杆菌及其在生物制氢中的应用。

背景技术

随着人类社会的进步，能源的需求量也日益剧增。目前世界上的能源供应大部分都是化石能源，但是由于其不可再生、储量有限和环境污染等问题制约着人类社会的进步。能源和环境危机将生物质能源推向了研究热潮，希望其可以替代化石能源，支撑人类社会对能源的需求。生物质能源以可再生的木质纤维素为原料，利用微生物或者其他手段转化为可以直接利用的可再生能源，由于可再生性和环境友好性被人们寄予厚望，受到众多研究者的重视。

氢气作为一种燃料，产物为水，燃烧热值高、无环境污染问题，是一种替代传统化石燃料的洁净、高效、可再生的理想绿色燃料。氢气不是一种一次能源，需要从含氢的化合物中制取，目前全世界90％的氢气来源于化石燃烧，剩下的则为电解水制氢。以上无论哪一种方法均需要消耗大量的化石燃料，降低了氢气利用的价值。为解决上述困境，生物制氢技术应运而生。生物制氢利用产氢细菌的新陈代谢过程进行氢气的生产，是一种清洁、低成本的制氢方法。生物制氢原料来源广泛，而木质纤维素原料由于其廉价易得被认为是非常具有前景的原料。

木质纤维素可以通过多种手段进行预处理，以提高其生物降解性能，众多预处理手段中酸碱预处理简单容易操作，但是由于处理液中存在较多的抑制物，处理后的原料需要大量水进行洗涤，大大限制了工业化应用。稀酸预处理可以水解木质纤维素中的大部分半纤维素，因此酸预处理得到的预处理液中含有较高的木糖，但是由于糠醛、苯酚类抑制物含量较高，极难被直接利用，大部分被直接丢弃。因此筛选一种具有较好抑制物耐受性且可以将其能源化的菌株具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种嗜热解糖厌氧杆菌。该菌株可以直接利用甘蔗渣酸预处理液中的木糖，产氢效率高，且该过程不需要额外的酸预处理液解毒过程，很大程度节省了生产成本，同时可以解决酸预处理液对环境的污染问题。

本发明的另一目的在于提供所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种嗜热解糖厌氧杆菌，名称为嗜热解糖厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)MJ1，保藏号为GDMCC No：60096，于2016年10月31日保藏于位于中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用。

所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，包括如下步骤：

(1)种子液的制备：将嗜热解糖厌氧杆菌接种至种子培养基进行活化和放大培养，得到种子液；

(2)发酵产氢：将步骤(1)中得到的种子液接种至发酵培养基中进行厌氧发酵，得到氢气。

步骤(1)中所述的种子培养基为以木糖为碳源的培养基；

步骤(2)中所述的发酵培养基为以物质A为碳源的培养基，其中，物质A为五碳糖、六碳糖、纤维二糖或木质纤维素酸预处理液中的一种或至少两种。

所述的五碳糖优选为木糖。

所述的六碳糖优选为葡萄糖。

所述的木质纤维素酸预处理液优选通过如下方法得到：向木质纤维素原料中加入硫酸溶液进行反应，固液分离，取液体，得到木质纤维素酸预处理液。

所述的木质纤维素原料优选为甘蔗渣。

所述的甘蔗渣优选为干燥至恒重的甘蔗渣。

所述的硫酸溶液的浓度优选为质量体积百分比1％。

所述的木质纤维素原料的终浓度优选为质量体积百分比10％。质量为g时，体积为mL。

所述的反应的条件优选为121℃反应30min。

所述的固液分离的方式优选为抽滤，更优选为真空条件下进行抽滤。

所述的真空条件中的真空度优选为-0.08Mpa。

所述的发酵培养基的组成为：碳源、氯化铵1g/L、氯化钠1g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、半胱氨酸0.5g/L、六水合氯化镁0.5g/L、氯化钾0.2g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨2g/L、微量元素贮液1ml/L、维生素贮液1ml/L、浓度为0.01％(w/v)的刃天青1ml/L；

其中：碳源为5g/L葡萄糖、5g/L纤维二糖、2.5～10g/L木糖或20％～80％(v/v)的木质纤维素酸预处理液；

微量元素贮液组成为：氯化亚铁1.5g/L，四水合氯化锰0.1g/L，六水合氯化钴0.19g/L，氯化锌70mg/L，二水合氯化铜2mg/L，硼酸6mg/L，六水合氯化镍24mg/L，二水合钼酸钠36mg/L，二水合钨酸钠15mg/L，五水亚硒酸钠15mg/L；

维生素贮液组成为：硫辛酸50mg/L，生物素20mg/L，烟酸0.35g/L，盐酸硫胺素5mg/L，对氨基苯甲酸50mg/L，叶酸20mg/L，泛酸钙50mg/L，维生素B₁₂ 1mg/L，盐酸比多醇(维生素B₆)100mg/L。

所述的发酵培养基的pH值优选为6～8。

所述的种子培养基的组成为：5g/L木糖，氯化铵1g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，半胱氨酸0.5g/L，六水氯化镁0.5g/L，氯化钾0.2g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，微量元素贮液1ml/L，维生素贮液1ml/L，0.01％(w/v)刃天青1ml/L，其中，

维生素贮液组成为：硫辛酸50mg/L，生物素20mg/L，烟酸0.35g/L，盐酸硫胺素5mg/L，对氨基苯甲酸50mg/L，叶酸20mg/L，泛酸钙50mg/L，维生素B₁₂ 1mg/L，盐酸比多醇100mg/L。

步骤(1)中所述的活化的条件优选为：在西林瓶中加入种子培养基，再接种嗜热解糖厌氧杆菌，于55℃、150rpm振荡培养18h。

步骤(1)中所述的扩大培养优的条件优选为：在血清瓶中加入种子培养基，再接种活化后的嗜热解糖厌氧杆菌，于55℃、150rpm振荡培养18h。

步骤(2)中所述的厌氧发酵优选通过如下操作步骤实现：在能密封的发酵容器中加入发酵培养基，密封，抽真空，充惰性气体，灭菌，再接种嗜热解糖厌氧杆菌进行厌氧发酵。

所述的发酵的条件优选为：温度为55℃，摇床转速为150rpm。

所述的发酵的时间为6～96h，优选为24～48h，更优选为48h。

所述的能密封的容器优选为血清瓶。

所述的惰性气体优选为氮气。

所述的充惰性气体的具体操作优选为：充0.01MPa氮气三次。

所述的灭菌的条件优选为：115℃灭菌30min。

步骤(2)中所述的种子液按10％(v/v)的接种量进行接种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明分离的菌种可以直接利用五碳糖和六碳糖，可以应用于多种糖的发酵体系，具体较好的应用性。

(2)本发明分离的菌种具有较强的酸预处理液抑制物的耐受性，可以直接利用酸预处理液中的木糖，不需要额外的酸预处理液解毒过程，可以显著提高生产效率、降低生产成本和改善酸预处理液的环境污染问题，菌株可以广泛用于酸预处理液的转化体系，具有广阔的应用推广前景。目前，发明人尚未发现能直接以酸预处理液为原料的嗜热解糖厌氧杆菌。

(3)本发明分离的菌株具有较高的氢气产量，在多种底物中均可以高效产氢，且以酸预处理液为底物时的产氢量优于单独以木糖为底物的培养基，说明此菌株可以高效利用酸预处理液中的糖成分，酸预处理液可以作为一种优良的产氢原料。

(4)本发明分离的菌株具有较高的产氢效率，木糖的摩尔产氢量可以达到2.38mol，酸预处理液中的摩尔产氢量可以达到3.06摩尔，说明菌株可以很好的利用酸预处理液进行生长并发酵产氢，且产氢效率优于木糖。

附图说明

图1为本发明提供的嗜热解糖厌氧杆菌的形态图；其中，图A为单菌落形态图，图B为单个菌体在透射电镜下的形态图。

图2为本发明提供的嗜热解糖厌氧杆菌的16S进化树图。

图3为本发明提供的嗜热解糖厌氧杆菌的生长曲线图。

图4为本发明提供的嗜热解糖厌氧杆菌以不同碳源的产氢量结果图。

图5为本发明提供的嗜热解糖厌氧杆菌以不同浓度木糖的产氢量结果图。

图6为本发明提供的嗜热解糖厌氧杆菌以不同浓度酸预处理液的产氢量结果图。

图7为不同pH值对嗜热解糖厌氧杆菌产氢的影响结果图。

图8为嗜热解糖厌氧杆菌在60％酸预处理液下的产氢时间曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：嗜热解糖厌氧杆菌的分离鉴定：

(1)未知菌体稳定培养液的获得：将采取的造纸污泥(来源于广东省一造纸厂)在超净工作台内用无菌的50mM磷酸缓冲液制成10％(w/v)的悬液，以10％(v/v)的比例接种于碳源为5g/L木糖的木糖液体培养基中，置于55℃摇床中震荡培养120h，再以10％(v/v)的比例接种于新鲜的碳源为5g/L木糖的木糖液体培养基中，继续培养72h，重复转接培养10次，以期获得稳定的菌群分布，其中，木糖液体培养基主要成分为：木糖5g/L(碳源)，氯化铵1g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，半胱氨酸0.5g/L，六水氯化镁0.5g/L，氯化钾0.2g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，微量元素贮液1ml/L，维生素贮液1ml/L，0.01％刃天青1ml/L；

微量元素贮液组成为：氯化亚铁1.5g/L，四水氯化锰0.1g/L，六水氯化钴0.19g/L，氯化锌70mg/L，二水氯化铜2mg/L，硼酸6mg/L，六水氯化镍24mg/L，一水钼酸钠36mg/L，二水钨酸钠15mg/L，五水亚硒酸钠15mg/L；

维生素贮液组成为：硫辛酸50mg/L，生物素20mg/L，烟酸0.35g/L，盐酸硫胺素5mg/L，对氨基苯甲酸50mg/L，叶酸20mg/L，泛酸钙50mg/L，维生素B12 1mg/L，盐酸比多醇100mg/L。

(2)单菌落的分离：将转接培养后的菌液梯度稀释成不同浓度，与厌氧培养管中5ml的碳源为5g/L木糖的木糖固体培养基(木糖固体培养基是在木糖液体培养基中加入15g/L琼脂得到)混匀，在冰浴中进行滚管分离，55℃静止培养120h后可以看到明显的单菌落，将得到的单菌落继续重复3次分离纯化。菌体的形态如图1所示：菌落形态如图1A所示，菌落呈白色、圆形；菌体在原子力显微镜下的形态如图1B所示，呈杆状结构，生有鞭毛。

(3)单菌落的16S鉴定：将分离的单菌落接种于5ml的5g/L木糖液体培养基中，55℃震荡培养48h后8000rpm离心收集菌体，用OMEGA的细菌基因组提取试剂盒提取菌体的DNA，以提取的DNA模板在PCR仪(BIOER公司)进行PCR扩增，反应所用的引物、组分和扩增条件如下：

引物1：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`

引物2：5`-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3`；

PCR扩增体系(25μL)组成如下：

扩增条件：94℃变性5min，再用94℃1min、51℃1min、72℃2min进行30个循环，72℃10min，最后4℃保存。用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示扩增得到大小约1500bp的片段，用多功能DNA纯化回收试剂盒(离心柱型、OMEGA)进行回收，把回收片段亚克隆到pMD-18T(TaKaRa公司)中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体平板上过夜培养，挑取平板上生长的菌落，通过菌落PCR验证阳性克隆。将验证阳性的克隆子接入LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中过夜培养，用高纯质粒小量制备试剂盒(离心柱型、OMEGA)提取质粒，质粒上的16S序列进行测序(上海生工生物工程有限公司)。测序结果显示所扩增得到的片段大小为1481bp，其16S rRNA基因序列测定结果如下：

agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaacacatgcaagtcgagcgaagggagtactacggtacgaacttagcggcggacgggtgagtaacgcgtggacaatctaccctgtagaccgggataacactgcgaaagtggtgctaataccggataatgtcaagaagcggcatcgtttcttgaagaaaggagaaatccgctataggatgagtccgcgtcccattagctagttggcggggtaaaagcccaccaaggcgacgatgggtagccggcctgagagggtgaacggccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgtgcaatgggggaaaccctgacacagcgacgccgcgtgagcgaagaaggccttcgggtcgtaaagctcaatagtatgggaagaaataaatgacggtaccatacgaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagcacgtaggcggctataaaagtcagatgtgaaaaacctgggctcaaccgagggtatgcatctgaaactaaatagcttgagtcaaggagaggagagcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgtagagatcaggaagaataccagtggcgaaagcggctctctggacttgaactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatggatactaggtgtgggtgatgaatcatccgtgccggagttaacgcaataagtatcccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccagggcttgacatccacagaatcgggtagaaatacctgagtgccttctatgaaggagctgtgagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgttggtagttaccagcgtggaaagacggggactctaccgagactgccgtggagaacacggaggaaggcggggatgacgtcaaatcatcatgccctatatgccctgggctacacacgtgctacaatggcctgaacagagggcagcgaaggagcgatccggagcgaatcccagaaaacaggtcccagttcagattgcaggctgcaacccgcctgcatgaagacggagttgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagtcagtgacctaaccgaaagggaggagctgccgaaggtggggtaaatgattggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgt。

通过其编码的氨基酸序列在Genebank数据库中用Blast程序进行同源检索，检索结果表明分离的菌株为嗜热解糖厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)与已报道的Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumJCA-5637具体99％的相似性，系统进化树如图2所示。

(4)菌株生长曲线的测定：将步骤(2)得到的单菌落接种至上述木糖液体培养基中，55℃、150rpm振荡培养72h后得到分离单菌落的培养液。然后以10％(v/v)的接种量(即接种量为0.5mL)分别接种至不同碳源的培养基B中(培养基B与上述木糖培养基除了碳源不同，其余成分相同；其中培养基B的碳源分别为5g/L葡萄糖、5g/L纤维二糖、5g/L木糖和5g/L蔗糖)，每个西林瓶装有5mL培养基B，于55℃、150rpm进行培养，每隔一定的时间(前24h每隔2h测定OD值，24h至60h每隔4h测定OD值，60h至84h每隔6h测定OD值)测定菌体OD₆₀₀的变化。结果如图3所示，从图中可以看出分离的嗜热解糖厌氧杆菌可以有效的利用葡萄糖、纤维二糖和木糖，而不能够利用蔗糖。

实施例2：嗜热解糖厌氧杆菌以不同碳源产氢能力的测定

(1)嗜热解糖厌氧杆菌种子液的制备：将实施例1步骤(4)中得到的得到的分离单菌落的培养液先经10mL西林瓶(装有4.5mL种子培养基)于55℃、150rpm振荡培养18h进行活化，接着在100ml的血清瓶(装有45mL种子培养基)于55℃、150rpm振荡培养18h进行放大，得到种子液，其中，种子培养基是5g/L的木糖培养基(同实施例1中的木糖培养基)。

(2)不同碳源发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基采用三种碳源，分别为5g/L葡萄糖、5g/L纤维二糖和5g/L木糖，除碳源外其他成分与上述种子培养基相同，将27ml发酵培养基装入100ml血清瓶中，用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.01MPa的氮气3次，最后在115℃下灭菌30min，得到发酵培养基。

(3)嗜热解糖厌氧杆菌发酵产氢：将制备好的种子液按10％(v/v)的接种量注射入上述发酵培养基中，发酵温度为55℃，摇床转速为150rpm，发酵48h后终止发酵。结果如图4所示，测定氢气的产量分别为77.75mM、84.88mM和71.57mM，转化为底物的摩尔产氢量分别为：2.81mol、5.81mol和2.15mol，说明分离的嗜热解糖厌氧杆菌可以很好的利用上述三种糖进行产氢，产氢效率均具有较好的水平。

实施例3：嗜热解糖厌氧杆菌以不同浓度木糖产氢能力的测定

(1)种子液的制备同实施例2。

(2)发酵培养基的制备及灭菌同实施例2，只是发酵培养基的碳源分别为2.5g/L、5g/L、7.5g/L和10g/L的木糖。

(3)嗜热解糖厌氧杆菌发酵产氢同实施例2，结果如图5所示，发酵结束后氢气的产量分别为：39.64mM、71.57mM、71.25mM、60.38mM，转化为底物的摩尔产氢量分别为：2.38mol、2.15mol、1.43mol和0.91mol，说明分离的嗜热解糖厌氧杆菌的产氢效率随着木糖浓度的提高而有所降低，测定发酵液中残余木糖发现，木糖高于5g/L后，发酵液中残余的木糖较多，说明菌体在5g/L以下的木糖中具体较好的转化率。

实施例4：嗜热解糖厌氧杆菌利用酸预处理液的产氢能力：

(1)种子液的制备同实施例2。

(2)发酵培养基的制备及灭菌同实施例2，只是发酵培养基的碳源为20％、40％、60％和80％(v/v)的酸预处理液，其中，酸预处理液是将干燥至恒重的甘蔗渣用1％(w/v)的硫酸配成10％(w/v)的溶液(即100g的甘蔗渣，用浓度为1％的硫酸溶液定容到1L)，121℃保温30min后真空(-0.08MPa)抽滤进行固液分离，得到的液体即为甘蔗渣酸预处理液。酸预处理液发酵培养基的配制方法为：将除酸预处理液的发酵培养基的其它成分配制成10倍浓度的浓缩液，然后取10％(v/v)的浓缩液，添加20-80％(v/v)的酸预处理液后再用蒸馏水补足至100％(如，配制碳源为20％(v/v)的酸预处理液发酵培养基：取20ml的浓缩液和40ml的上述得到的酸预处理液，再加入蒸馏水(140ml)补足至200ml；再以相同的方法，配制碳源为40％、60％和80％(v/v)的酸预处理液发酵培养基)。

(3)嗜热解糖厌氧杆菌发酵产氢同实施例2。结果如图6所示，发酵结束后氢气的产量分别为：54.09mM、105.42mM、111.75mM、110.44mM，转化为底物的摩尔产氢量分别为：3.06mol、2.98mol、2.11mol和1.56mol，说明分离的嗜热解糖厌氧杆菌的产氢效率随着水解液浓度的提高而降低，但是由于高含量的水解液发酵结束后残余较多的糖，也说明菌体利用40％左右酸预处理液就已经足够，正好与实施例3中菌体利用5g/L以下的木糖一致。

实施例5：pH对嗜热解糖厌氧杆菌产氢的影响：

(1)种子液的制备同实施例2。

(2)发酵培养基的制备及灭菌同实施例2，只是发酵培养基的碳源为60％(v/v)的酸预处理液，调节发酵培养基的初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。

(3)嗜热解糖厌氧杆菌发酵产氢同实施例2。结果如图7所示，发酵结束后氢气的产量分别为：93.92mM、118.04mM、110.81mM、118.92mM和112.84mM，结果表明新分离的嗜热解糖厌氧杆菌具有较广泛的pH值适应能力，且在pH 6-8之间均具有较好的氢气产量，具有良好的工业应用价值。

实施例6：嗜热解糖厌氧杆菌在60％酸预处理液下的产氢时间曲线：

(1)种子液的制备同实施例2。

(2)发酵培养基的制备及灭菌同实施例2，只是发酵培养基的碳源为60％(v/v)的酸预处理液，调节发酵培养基的初始pH值为7.5。

(3)嗜热解糖厌氧杆菌发酵产氢同实施例2，每隔一定的时间进行取样，测定菌体在不同时期的氢气产量，取样时间点为：6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h和96h。结果如图8所示，氢气产量在不同时间点分别为：31.20mM、78.66mM、90.58mM、97.91mM、99.25mM和92.83mM、100.36mM和111.71mM。结果表明新分离的嗜热解糖厌氧杆菌的产氢速率较高，发酵24h即可达到一个相对较高的氢气产量，之后氢气的产量虽然有一定程度的提升，但是提升幅度不大，说明新分离的菌株具有较高的生产效率，在工业应用中前景广阔。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 一种嗜热解糖厌氧杆菌及其在生物制氢中的应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1481

<212> DNA

<213> 嗜热解糖厌氧杆菌MJ1

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgagc 60

gaagggagta ctacggtacg aacttagcgg cggacgggtg agtaacgcgt ggacaatcta 120

ccctgtagac cgggataaca ctgcgaaagt ggtgctaata ccggataatg tcaagaagcg 180

gcatcgtttc ttgaagaaag gagaaatccg ctataggatg agtccgcgtc ccattagcta 240

gttggcgggg taaaagccca ccaaggcgac gatgggtagc cggcctgaga gggtgaacgg 300

ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgt 360

gcaatggggg aaaccctgac acagcgacgc cgcgtgagcg aagaaggcct tcgggtcgta 420

aagctcaata gtatgggaag aaataaatga cggtaccata cgaaagcccc ggctaactac 480

gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggggg cgagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa 540

gagcacgtag gcggctataa aagtcagatg tgaaaaacct gggctcaacc gagggtatgc 600

atctgaaact aaatagcttg agtcaaggag aggagagcgg aattcctggt gtagcggtga 660

aatgcgtaga gatcaggaag aataccagtg gcgaaagcgg ctctctggac ttgaactgac 720

gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatggat actaggtgtg ggtgatgaat catccgtgcc ggagttaacg caataagtat 840

cccgcctggg gagtacggcc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcagcggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag ggcttgacat 960

ccacagaatc gggtagaaat acctgagtgc cttctatgaa ggagctgtga gacaggtggt 1020

gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080

ccctgttggt agttaccagc gtggaaagac ggggactcta ccgagactgc cgtggagaac 1140

acggaggaag gcggggatga cgtcaaatca tcatgcccta tatgccctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg gcctgaacag agggcagcga aggagcgatc cggagcgaat cccagaaaac 1260

aggtcccagt tcagattgca ggctgcaacc cgcctgcatg aagacggagt tgctagtaat 1320

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Claims

1.一种嗜热解糖厌氧杆菌，其特征在于：名称为嗜热解糖厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）MJ1，保藏号为GDMCC No：60096，于2016年10月31日保藏于位于中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

2.权利要求1所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用。

3.根据权利要求2所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子液的制备：将嗜热解糖厌氧杆菌接种至种子培养基进行活化和放大培养，得到种子液；

（2）发酵产氢：将步骤（1）中得到的种子液接种至发酵培养基中进行厌氧发酵，得到氢气；

步骤（1）中所述的种子培养基为以木糖为碳源的培养基；

步骤（2）中所述的发酵培养基为以物质A为碳源的培养基，其中，物质A为五碳糖、六碳糖、纤维二糖或木质纤维素酸预处理液中的一种或至少两种。

4.根据权利要求3所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：所述的五碳糖为木糖；

所述的六碳糖为葡萄糖；

所述的木质纤维素酸预处理液通过如下方法得到：向木质纤维素原料中加入硫酸溶液进行反应，固液分离，取液体，得到木质纤维素酸预处理液。

5.根据权利要求4所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：所述的木质纤维素原料为甘蔗渣；

所述的硫酸溶液的浓度为质量体积百分比1%。

6.根据权利要求4或5所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：所述的木质纤维素原料的终浓度为质量体积比10%。

7.根据权利要求4所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：

所述的反应的条件为121℃反应30min；

所述的固液分离的方式为抽滤。

8.根据权利要求3所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：

所述的种子培养基的组成为：5 g/L木糖，氯化铵1g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，半胱氨酸0.5 g/L，六水氯化镁0.5 g/L，氯化钾0.2 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，微量元素贮液1 ml/L，维生素贮液1ml/L，0.01%（w/v）刃天青1 ml/L；

所述的发酵培养基的组成为：碳源、氯化铵1g/L、氯化钠1g/L、磷酸氢二钾1 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、六水合氯化镁0.5 g/L、氯化钾0.2 g/L、酵母粉2 g/L、蛋白胨2 g/L、微量元素贮液1 ml/L、维生素贮液1ml/L、浓度为0.01%（w/v）的刃天青1 ml/L；其中：碳源为5 g/L葡萄糖、5 g/L纤维二糖、2.5～10 g/L木糖或20%～80%（v/v）的木质纤维素酸预处理液；

微量元素贮液组成为：氯化亚铁1.5 g/L，四水合氯化锰0.1 g/L，六水合氯化钴0.19g/L，氯化锌70mg/L，二水合氯化铜2 mg/L，硼酸6 mg/L，六水合氯化镍24 mg/L，二水合钼酸钠36 mg/L，二水合钨酸钠15 mg/L，五水亚硒酸钠15 mg/L；

维生素贮液组成为：硫辛酸50 mg/L，生物素20 mg/L，烟酸0.35g/L，盐酸硫胺素5 mg/L，对氨基苯甲酸50 mg/L，叶酸20 mg/L，泛酸钙50 mg/L，维生素B₁₂ 1 mg/L，盐酸比多醇100mg/L。

9.根据权利要求3所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：

步骤（1）中所述的活化的条件为：在西林瓶中加入种子培养基，再接种嗜热解糖厌氧杆菌，于55℃、150rpm振荡培养18h；

步骤（1）中所述的放大培养的条件为：在血清瓶中加入种子培养基，再接种活化后的嗜热解糖厌氧杆菌，于55℃、150rpm振荡培养18h；

步骤（2）中所述的厌氧发酵通过如下操作步骤实现：在能密封的发酵容器中加入发酵培养基，密封，抽真空，充惰性气体，灭菌，再接种嗜热解糖厌氧杆菌进行厌氧发酵。

10.根据权利要求9所述的嗜热解糖厌氧杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于：

所述的厌氧发酵的条件为：温度为55℃，摇床转速为150 rpm；

所述的厌氧发酵的时间为6～96 h；

所述的能密封的发酵容器为血清瓶；

所述的惰性气体为氮气；

所述的灭菌的条件为：115℃灭菌30min。