CN105462874A - 一种丁酸梭菌及其在厌氧发酵产氢中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于生物工程技术领域的一种丁酸梭菌及其在厌氧发酵产氢中的应用。所述的丁酸梭菌的菌株为INET1，分类命名为Clostridium？butyricum，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC1.5199。所述的丁酸梭菌从经5kGy伽马辐照处理后的厌氧消化污泥中分离得到，是一株新的具有产氢能力的丁酸梭菌。所述的丁酸梭菌具有生长迅速，产氢效率高等优点；能以葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油等多种有机物为底物产氢，为利用实际有机废物高效产氢提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种丁酸梭菌及其在厌氧发酵产氢中的应用。
背景技术
氢气具有燃烧热值高，储存、运输方便，燃烧无污染和方便转化为电能等特点，不仅在工业中具有广泛的应用，也是一种高效、安全、环保的能源形式。氢气在未来社会的应用中颇具发展潜力。
目前，工业生产中用到的氢气90％以上来自传统的氢气制备方法，如碳氢化合物的蒸汽重组，化石燃料的非催化部分氧化，水的电解等。然而，这些方法耗能高、且高度依赖化石燃料。通过传统方法制备的氢气，很难满足我们对清洁能源的需求。为了最大程度发挥氢气的环境效益，生物发酵制氢法受到了人们的关注。生物发酵制氢法具有反应条件温和、耗能低、底物来源广等优点。将有机废物作为生物发酵产氢的底物，还可以实现有机废物资源化。
目前，生物发酵产氢存在产氢速率低、底物利用不彻底等问题，这些都限制了发酵制备氢气的工业化发展。为了提升产氢系统的产氢能力，很多研究主要从优化底物性质、改良发酵装置等方面着手。针对产氢微生物菌种改良与筛选的研究，还比较少见。暗发酵法生物制氢的主体是系统中的产氢微生物，常用的微生物菌群包括严格厌氧的梭菌属(Clostridium)，兼性厌氧的肠杆菌属(Enterobacter)和埃希氏菌属(Escherichia)等。其中，以梭菌的产氢能力最强，但报道中其可利用的底物局限性较大，难以适应对实际废物中各类复杂有机物的利用。因此，对新型梭菌的筛选和产氢优化的研究，是十分必要的。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的缺点，其目的在于提供一种丁酸梭菌及其在厌氧发酵产氢中的应用。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种丁酸梭菌，所述丁酸梭菌菌株为INET1，分类命名为Clostridiumbutyricum，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC1.5199。
所述丁酸梭菌的16SrDNA基因序列如SEQIDNo.1所示。
所述丁酸梭菌的生物学特性为：菌株在36℃厌氧条件下培养24h，菌株生长良好，可形成表面光滑、有凸起、边缘整齐的乳白色菌落，菌落直径为3-4mm；菌株革兰氏染色呈阳性、严格厌氧；显微镜下细胞形态呈梭形，两端钝圆、中部轻度膨胀，有芽孢，无鞭毛。
所述的丁酸梭菌在厌氧发酵产氢中的应用。
所述丁酸梭菌在厌氧条件下发酵产氢的步骤为：
将丁酸梭菌从分离培养基上接种至富集培养基中，在35-38℃，80-120r/min条件下厌氧培养至菌株生长的对数期；
将培养至生长对数期的丁酸梭菌以5-30％的接种比接入初始pH＝5-10的发酵培养基中，在温度25-40℃，80-120r/min条件下厌氧发酵20-48h产氢；
所述富集培养基的组分为：葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉0.5g/L，营养液10mL/100mL；
所述的分离培养基为含15％琼脂的发酵培养基；
所述发酵培养基的组分为：有机物5-20g/L，营养液10mL/100mL；
所述营养液的组分为：NaHCO340g/L，NH4Cl5g/L，NaH2PO4·2H2O5g/L，K2HPO4·3H2O5g/L，FeSO4·7H2O0.25g/L，MgCl2·6H2O0.085g/L，NiCl2·6H2O0.004g/L。
所述的有机物为葡萄糖、蔗糖、乳糖或甘油。
所述的丁酸梭菌以葡萄糖为底物时发酵产氢能力最强，随后依次是乳糖、蔗糖和甘油。
所述发酵培养基优选的初始pH＝7。
所述丁酸梭菌厌氧发酵产氢时优选的接种比为10％。
所述丁酸梭菌厌氧发酵产氢时优选的培养温度为35℃。
本发明的有益效果为：筛选出一株新的丁酸梭菌，所述丁酸梭菌具有生长迅速，产氢效率高等特点；同时可以利用多种有机物产氢，为利用实际有机废物高效产氢提供基础。
生物材料保藏说明
分类命名：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)；菌株编号：INET1
保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年5月20日
保藏中心登记入册编号：CGMCC1.5199。
附图说明
图1为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1的生长曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1的分离与菌株鉴定。
从北京市某市政污水处理厂的污泥初级消化池中取样，取得的厌氧消化污泥在室温状态下，经5kGy剂量的γ射线辐照，辐照源为60Co。辐照后的厌氧消化污泥在富集培养基中厌氧富集培养48h，再将菌液以一定比例稀释并涂布于分离培养基上，在36℃条件下经过24h厌氧培养，挑取分离得到的单菌落，将其接种于发酵培养基中，在36℃下发酵培养48h，采用气相色谱(112A，上海，热导检测器，填充柱TDX-013000*3mm，柱温160℃，检测器110℃，进样器180℃)检测发酵瓶中生成的气体组分，经过大量菌株的筛选过程，分离得到一株产氢能力最强的菌株。
对分离筛选得到的菌株，委托中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)进行菌种鉴定，根据菌种的细胞形态、生理生化特征和16SrDNA基因序列进行综合分析，鉴定菌株属于厚壁菌门(Firmicutes)，梭菌属(Clostridium)的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，命名为INET1，是一株新的产氢菌。
菌株INET1的生物学特性为：菌株在分离培养基上36℃厌氧条件下培养24h，菌株生长良好，可形成表面光滑、有凸起、边缘整齐的乳白色菌落，菌落直径为3-4mm；菌株革兰氏染色呈阳性、严格厌氧；显微镜下细胞形态呈梭形，两端钝圆、中部轻度膨胀，有芽孢，无鞭毛。
菌株INET1的生理生化特性鉴定结果如表1所示，16SrDNA序列长度为1344kp，全长序列如SEQIDNO.1所示。
表1生理生化特性鉴定结果
实施例2：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1生长曲线的绘制。
将丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1从分离培养基上接种1-3环到上述200mL的富集培养基中，在36℃，100r/min条件下恒温振荡培养，每隔2小时取样，在600nm处测量其吸光度值，绘制该菌株的生长曲线，如图1所示。
实施例3：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1以葡萄糖为唯一碳源的厌氧发酵产氢。
取处于对数生长期的菌株INET110mL，接种于100mL发酵培养基中，培养基以葡萄糖为唯一碳源，浓度为10gCOD/L，发酵培养基初始pH为7.0。在36℃，100r/min条件下恒温震荡反应。经过28h发酵反应后，溶液pH为4.6。得到氢气总产量为218mL。根据发酵过程对葡萄糖的利用情况，得到发酵产氢过程中的产氢效率为260.9mLH2/gCOD。
实施例4：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1以乳糖为唯一碳源的厌氧发酵产氢。
取处于对数生长期的菌株INET110mL，接种于100mL发酵培养基中，培养基以乳糖为唯一碳源，浓度为10gCOD/L，发酵培养基的初始pH为7.0。在36℃，100r/min条件下恒温震荡反应。经过44h发酵反应后，溶液pH为4.9。得到氢气总产量为178mL。根据发酵过程对乳糖的利用情况，得到发酵产氢过程中的产氢效率为213.4mLH2/gCOD。
实施例5：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1以蔗糖为唯一碳源的厌氧发酵产氢。
取处于对数生长期的菌株INET110mL，接种于100mL发酵培养基中，培养基以蔗糖为唯一碳源，浓度为10gCOD/L，发酵培养基的初始pH为7.0。在36℃，100r/min条件下恒温震荡反应。经过32h发酵反应后，溶液pH为5.42。得到氢气总产量为140mL。根据发酵过程对蔗糖的利用情况，得到发酵产氢过程中的产氢效率为167.8mLH2/gCOD。
实施例6：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)INET1以甘油为唯一碳源的厌氧发酵产氢。
取处于对数生长期的菌株INET110mL，接种于100mL发酵培养基中，培养基以甘油为唯一碳源，浓度为10gCOD/L，发酵培养基的初始pH为7.0。在36℃，100r/min条件下恒温震荡反应。经过36h发酵反应后，溶液pH为5.49。得到氢气总产量为68mL。根据发酵过程对甘油的利用情况，得到发酵产氢过程中的产氢效率为78.3mLH2/gCOD。
Claims (10)
1.一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌菌株为INET1，分类命名为Clostridiumbutyricum，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC1.5199。
2.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌的16SrDNA基因序列如SEQIDNo.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌的生物学特性为：菌株在36℃厌氧条件下培养24h，生长良好，可形成表面光滑、有凸起、边缘整齐的乳白色菌落，菌落直径为3-4mm；菌株革兰氏染色呈阳性、严格厌氧；显微镜下细胞形态呈梭形，两端钝圆、中部轻度膨胀，有芽孢，无鞭毛。
4.权利要求1-3任意一项所述的丁酸梭菌在厌氧发酵产氢中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌在厌氧条件下发酵产氢的步骤为：
将丁酸梭菌从分离培养基上接种至富集培养基中，于35-38℃，80-120r/min条件下厌氧培养至菌株生长的对数期；
将培养至生长对数期的丁酸梭菌以5-30％的接种比接入初始pH＝5-10的发酵培养基中，在温度25-40℃，80-120r/min条件下厌氧发酵20-48h产氢；
所述富集培养基的组分为：葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉0.5g/L，营养液10mL/100mL；
所述的分离培养基为含15％琼脂的发酵培养基；
所述发酵培养基的组分为：有机物5-20g/L，营养液10mL/100mL；
所述营养液的组分为：NaHCO340g/L，NH4Cl5g/L，NaH2PO4·2H2O5g/L，K2HPO4·3H2O5g/L，FeSO4·7H2O0.25g/L，MgCl2·6H2O0.085g/L，NiCl2·6H2O0.004g/L。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的有机物为葡萄糖、蔗糖、乳糖或甘油。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的丁酸梭菌以葡萄糖为底物时发酵产氢能力最强，随后依次是乳糖、蔗糖和甘油。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基优选的初始pH＝7。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌厌氧发酵产氢时优选的接种比为10％。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌厌氧发酵产氢时优选的培养温度为35℃。
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