CN103131645A - 一株以葡萄糖为碳源合成2-苯乙醇的肠杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株以葡萄糖为碳源生产2-苯乙醇的肠杆菌。本发明还涉及使用所述肠杆菌合成2-苯乙醇的方法。具体地说，本发明提供了一株能够以葡萄糖为碳源合成2-苯乙醇的菌株，其具有很好的2-苯乙醇耐受性，可以用于生物合成2-苯乙醇。本发明的合成方法具有条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。

Description

一株以葡萄糖为碳源合成2-苯乙醇的肠杆菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株新分离的2-苯乙醇耐受性的肠杆菌，以及利用葡萄糖作为碳源通过生物法合成2-苯乙醇的方法。

背景技术

2-苯乙醇是当前第二大香料，具有淡雅、细腻而持久的玫瑰花香气，因此2-苯乙醇作为主香或底香在食用香精的生产中被广泛应用；2-苯乙醇在碱性条件下稳定使得在洗涤和化妆品行业中有着重要的应用价值。此外，2-苯乙醇也是重要的医药中间体，并可以通过脱水制取重要的化工原料苯乙烯。

当前2-苯乙醇主要是通过化工途径由2-苯乙烯及苯酚制取得到，合成转化率低、分离困难、污染严重。此外2-苯乙醇还可以直接从天然植物中提取，以及通过酵母菌对苯丙氨酸进行生物转化。植物中成分提取受原料来源及含量的限制，提取成本高，以此方法提取得到的产品仅仅在高档香料中有少量应用。生物法合成2-苯乙醇具有发酵周期短，可开发空间大的特点，具有极高的研究价值。

当前研究能够产2-苯乙醇的菌株主要集中在酵母菌(酿酒酵母、克鲁维酵母菌、异常汗逊酵母菌，土星汉逊酵母菌)以及植物中，细菌来源的苯乙醇相关报道也有发现，但是没有进一步的研究。国内学者也对生物法合成2-苯乙醇进行了研究，主要研究工作集中在以苯丙氨酸为原料通过酵母菌转化合成2-苯乙醇的研究上，并取得了一定的成果。

现有技术中尚未发现以葡萄糖为原料合成2-苯乙醇的耐受性菌株存在。

发明内容

本发明针对现有2-苯乙醇合成技术的不足，及目前市场对天然绿色2-苯乙醇产品的需求，以及生物法生产2-苯乙醇以苯丙氨酸为原料，原料成本高，缺乏以普通糖为原料的合成菌株，菌株对2-苯苯乙醇耐受性低等问题，提供了一株新分离的以葡萄糖为碳源合成2-苯乙醇的菌株及合成方法。

因此，本发明一方面涉及一种肠杆菌(Enterobacter sp.)，其于2011年07月18日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5087。

本发明的肠杆菌，具有如下生物学特征：菌株在LB固体平板培养基上菌落特点是表面光滑，蜡白色，边缘整齐，菌体大小0.3～0.5×1～2μm，单个排列，不形成芽孢。

本发明的肠杆菌可以用于合成2-苯乙醇。

本发明的肠杆菌在含有5g/l的2-苯乙醇的LB培养基中的生长抑制率在10％以下。

本发明还一方面涉及所述的肠杆菌用于合成2-苯乙醇的用途。

本发明又一方面涉及含有所述肠杆菌的培养物。所述培养物可以是用于生产2-苯乙醇过程中的培养物，其中含有2-苯乙醇。

本发明又一方面涉及一种组合物，其包含本发明的肠杆菌。这种组合物可以制备为便于储存和运输的产品。本发明的肠杆菌可以用作菌种。组合物可以用于生产2-苯乙醇。

本发明又一方面涉及一种合成2-苯乙醇的方法，包括培养本发明的肠杆菌的步骤。在本发明的方法中，使用葡萄糖作为碳源。

如上所述，本发明所涉及的肠杆菌(Enterobacter sp.)菌株(qibebt101)已于2011年07月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC No.5087。

本发明涉及的以葡萄糖为碳源合成2-苯乙醇的菌株-肠杆菌(Enterobacter sp.)是从染料废水处理好氧污泥中通过选择性培养基分离得到的。

本发明涉及的能够利用葡萄糖为碳源合成2-苯乙醇的肠杆菌具有如下生物学特征：

该菌株在LB固体平板培养基上菌落特点是表面光滑，蜡白色，边缘整齐。菌体大小0.3～0.5×1～2μm，单个排列，不形成芽孢。

上述肠杆菌菌株的经通用引物PCR获得16S rDNA序列与数据库中肠杆菌的16S rDNA序列(gb：GU339293.1)有99％的相似性但是不同。

其中上述PCR的引物为引物为fD1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；rP2：CGGCTACCTTGTTACGACTT。

本发明的肠杆菌能够在产2-苯乙醇培养基里快速生长产生2-苯乙醇，所述培养条件可由本领域技术人员确定，例如，培养时间可以为15～24小时，摇床转速可以为120～180转/分钟。本发明的肠杆菌对5g/l的2-苯乙醇具有耐受性。

可用于本发明的产2-苯乙醇肠杆菌培养基可由本领域技术人员根据现有技术充分公开的各种肠杆菌培养基根据常规实验进行选择，例如，所述培养基可以含有：牛肉膏1.5～2.5g/，蛋白胨6～8g/l，葡萄糖4～6g/l，氯化钠3～5g/l，琼脂13～16g/l，pH7.0～7.2。

如下文所详述的，本发明的产2-苯乙醇耐受性肠杆菌菌株能够在以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中生长，并产生2-苯乙醇。

本发明有益效果如下：

1)肠杆菌(Enterobacter)qibebt101能够在产2-苯乙醇的培养基上快速生长并产生2-苯乙醇。

2)肠杆菌(Enterobacter)能够以葡萄糖为碳源，氯化铵为氮源合成2-苯乙醇，比目前报道的苯丙氨酸转化合成2-苯乙醇具有更高的经济开发价值。

3)肠杆菌(Enterobacter)具有很好的2-苯乙醇耐受性，与目前报道的2-苯乙醇对细菌具有普遍的抑制作用相比，该菌株能够在含有2-苯乙醇的培养基中生长。

4)本发明提供的菌株生产的2-苯乙醇具有生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。

附图说明

图12-苯乙醇产物GC-MS气相图谱

图22-苯乙醇产物质谱图

图3M9培养基产2-苯乙醇验证气相图谱(122特征离子)

本发明涉及肠杆菌Enterobacter sp.，该菌株(qibebt101)已于2011年07月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC No.5087。

具体实施方式

培养基的配制：

LB培养基的配制：蛋白胨9～11g/l，酵母粉4.5～5.5g/l，酵母粉9～11g/l，氯化钠1～4g/l，pH7.0～7.5，112℃灭菌30分钟。

M9培养基的配制：1L烧杯中加入450ml蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH₄Cl 0.3～0.5g，Na₂HPO₄ 2～3g，KH₂PO₄ 1～2g用1M NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至494ml，后把液体倒入一个1L烧瓶C中，灭菌。制备以溶液各50ml，并放在有盖子的瓶子内：1M MgSO₄.7H₂O；20％(w/v)Dextrose(葡萄糖)；1M CaCl₂将上述所有溶液及A部份中的烧瓶A，B灭菌。制备下溶液各50ml，并放在有盖子的瓶子内：1M MgSO₄.7H₂O；20％(w/v)Dextrose(葡萄糖)；1M CaCl₂将上述所有溶液及A部份中的烧瓶A，B灭菌。在无菌情况下把1ml MgSO₄.7H₂O(1M)，5ml葡萄[20％(w/v)]及50ml的氯化钙(1M)加到烧瓶C中以制备M9培养基。M9培养基的灭菌条件为112℃灭菌30分钟。

实施例一：菌株筛选

1.培养基：

选择性筛选固体培养基：牛肉膏1.5～2.5g/l，蛋白胨6～8g/l，葡萄糖4～6g/l，氯化钠3～5g/l，琼脂13～16g/l，2-苯乙醇4.5～5.5g/l，pH7.0～7.2。

产2-苯乙醇液体培养基：牛肉膏1.5～2.5g/l，蛋白胨6～8g/l，葡萄糖4～6g/l，氯化钠3～5g/l，琼脂13～16g/l，pH7.0～7.2。

2.筛选方法：

取土样按照1g样品10ml水溶解，将水样置于室温24小时活化然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的土壤。

取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到含2-苯乙醇平板，培养72小时后挑取单菌落进行液体培养。液体培养12～24小时取培养菌液，离心去沉淀后进行200～600nm全波段扫描，选取在260～280nm吸光度变化较大的菌株进行GC-Ms检测，检测到一株能够产生2-苯乙醇的菌株。

实施例二：菌株16S rDNA鉴定

1.培养基及材料

LB培养基：蛋白胨9～11g/l，酵母粉4.5～5.5g/l，酵母粉9～11g/l，氯化钠1～4g/l，pH7.0～7.5，112℃灭菌30分钟。

LA培养基：在LB培养基中添加50μg到100μg氨苄青霉素。

LB/LA固体培养基：在上述LB/LA培养基中添加1.5％的琼脂。

TAE：50倍tris-acetate-EDTA(2M tris-acetate，0.05M EDTA，pH8.3).

琼脂糖电泳凝胶：1倍TAE电泳缓冲液添加0.8～1.2％的琼脂糖凝胶。

2.16S rDNA测定

基因组DNA的提取，在LB液体培养基中生长的菌体(约12～24小时)离心。提取基因组DNA，然后用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检测合格的DNA进行PCR基因扩增，PCR采用的引物为fD1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO：1)，rP2：CGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO：2)；PCR模板DNA添加0.5μl调节到合适浓度，引物浓度为0.4μM，dNTP浓度为0.2mM，DNA聚合酶大约2.5U，反应总体积50μl，变性温度为94℃，退火温度为55℃，延伸温度72℃，共30个循环。PCR产物约为1.5kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，经PCR扩增得到的DNA电泳检测后连接到PMD18-T转化大肠杆菌，转化的DH5α菌株经过添加LA(Luria-Bertani培养基添加50mg氨苄青霉素)培养基筛选后，提取质粒进行电泳验证，将正确质粒进行测序。

将本发明的菌株肠杆菌的16S rDNA序列(序列3，即SEQ ID NO：3)与GenBank中已登录(gb：GU339293.1)的16S rDNA序列进行同源比较，其16S rDNA序列与肠杆菌属几株菌的16S rDNA进行比对，发现相似性高达99％，但不完全相同。结合该菌的形态学观察：该菌在LB平板培养加上菌落特点是表面光滑，蜡白色，边缘整齐。菌体大小0.3～0.5×1～2μm，单个排列，不形成芽孢。该菌应属于肠杆菌属。

序列3

1    ACATGCAAGT CGAGCGGCAG CGGAAAGTAG CTTGCTACTT TGCCGGCGAG CGGCGGACGG

61   GTGAGTAATG TCTGGGAAAC TGCCTGATGG AGGGGGATAA CTACTGGAAA CGGTAGCTAA

121  TACCGCATAA CGTCGCAAGA CCAAAGAGGG GGACCTTCGG GCCTCTTGCC ATCAGATGTG

181  CCCAGATGGG ATTAGCTAGT AGGTGGGGTA ACGGCTCACC TAGGCGACGA TCCCTAGCTG

241  GTCTGAGAGG ATGACCAGCC ACACTGGAAC TGAGACACGG TCCAGACTCC TACGGGAGGC

301  AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGCA AGCCTGATGC AGCCATGCCG CGTGTATGAA

361  GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GTACTTTCAG CGGGGAGGAA GGCGCTGAGG CTAATAACCT

421  CAGCGATTGA CGTTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCTAACT CCGTGCCAGC AGCCGCGGTA

481  ATACGGAGGG TGCAAGCGTT AATCGGAATT ACTGGGCGTA AAGCGCACGC AGGCGGTCTG

541  TCAAGTCGGA TGTGAAATCC CCGGGCTCAA CCTGGGAACT GCATTCGAAA CTGGCAGGCT

601  AGAGTCTTGT AGAGGGGGGT AGAATTCCAG GTGTAGCGGT GAAATGCGTA GAGATCTGGA

661  GGAATACCGG TGGCGAAGGC GGCCCCCTGG ACAAAGACTG ACGCTCAGGT GCGAAAGCGT

721  GGGGAGCAAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGATGT CGACTTGGAG

781  GTTGTGCCCT TGAGGCGTGG CTTCCGGAGC TAACGCGTTA AGTCGACCGC CTGGGGAGTA

841  CGGCCGCAAG GTTAAAACTC AAATGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT

901  GGTTTAATTC GATGCAACGC GAAGAACCTT ACCTACTCTT GACATCCAGA GAACTTAGCA

961  GAGATGCTTT GGTGCCTTCG GGAACTCTGA GACAGGTGCT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG

1021 TGTTGTGAAA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTATCCTT TGTTGCCAGC

1081 GGTCCGGCCG GGAACTCAAA GGAGACTGCC AGTGATAAAC TGGAGGAAGG TGGGGATGAC

1141 GTCAAGTCAT CATGGCCCTT ACGAGTAGGG CTACACACGT GCTACAATGG CGCATACAAA

1201 GAGAAGCGAC CTCGCGAGAG CAAGCGGACC TCATAAAGTG CGTCGTAGTC CGGATTGGAG

1261 TCTGCAACTC GACTCCATGA AGTCGGAATC GCTAGTAATC GTAGATCAGA ATGCTACGGT

1321 GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG GTTGCAAAAG

1381 AAGTAGGTAG CTTAACCTTC GGGAGGGCGC TA

实施例三：产物鉴定

挑取单菌落接种于上述(实施例一)装有50ml的产2-苯乙醇液体培养基250ml摇瓶，35～39℃培养时间大约12～24小时，按照发酵液体积与正丁醇比例为5∶1进行抽提。抽提正丁醇相离心后经0.22μM膜过滤，GC-Ms检测，设对照和标准样品。

GC-Ms检测方法：柱子型号HP-INNOWax Polyethylene Glyco：1170.71016柱箱温度50℃保留1min然后10℃/min到240℃，维持时间20分钟，总运行时间40分钟，检测器温度260℃，汽化室温度240℃。经鉴定产物2-苯乙醇气相图谱如图1所示，质谱图谱如图2所示。

实施例四：肠杆菌2-苯乙醇耐受性的检测

接种肠杆菌于LB培养基中，以1g/l为梯度，通过过滤除菌分别添加1g/l到10g/l的2-苯乙醇，通过测定菌体在OD600吸光度的变化监测2-苯乙醇对肠杆菌生长的抑制作用。监测结果表明，在含有4g/l 2-苯乙醇培养基上本发明所涉及肠杆菌能够正常生长；在含有5g/l的2-苯乙醇的LB培养基中本发明所涉及肠杆菌生长抑制率约为8～10％(36小时OD600约1.6～1.9)；在含有6g/l的2-苯乙醇的LB培养基上本发明所涉及肠杆菌生长抑制率为40％～60％(36小时OD600约0.8～0.9)；在含有7g/l的2-苯乙醇的LB培养基上本发明所涉及肠杆菌生长抑制率为100％。

实施例五：以葡萄糖为原料合成2-苯乙醇的验证

将本发明所涉及肠杆菌菌株接种于M9培养基中，培养24h后按照发酵液体积与正丁醇比例为5∶1进行抽提。抽提正丁醇相离心后经0.22μM膜过滤，GC-Ms检测，设对照和标准样品。检测方法参照实施例三。经检测本发明所涉及肠杆菌能够在M9培养基上生长，并产生2-苯乙醇(图3所示)。

Claims (10)

1.一种肠杆菌，其于2011年07月18日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5087。

2.权利要求1所述的肠杆菌，具有如下生物学特征：菌株在LB固体平板培养基上菌落特点是表面光滑，蜡白色，边缘整齐，菌体大小0.3～0.5×1～2μm，单个排列，不形成芽孢。

3.权利要求1或2所述的肠杆菌，其用于合成2-苯乙醇。

4.权利要求1-3中任一项所述的肠杆菌，其在含有5g/l的2-苯乙醇的LB培养基中的生长抑制率在10％以下。

5.权利要求1-4中任一项所述的肠杆菌用于合成2-苯乙醇的用途。

6.含有权利要求1-4中任一项所述的肠杆菌的培养物。

7.权利要求6所述的培养物，其中含有2-苯乙醇。

8.一种组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的肠杆菌，优选地，所述肠杆菌用作菌种，优选地，所述组合物用于生产2-苯乙醇。

9.一种合成2-苯乙醇的方法，包括培养权利要求1-4中任一项所述的肠杆菌的步骤。

10.权利要求9所述的方法，其中使用葡萄糖作为碳源。

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