CN101899411A - 一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌 - Google Patents
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Abstract
一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌和制备中碳脂肪醇的方法，该方法通过在大肠杆菌中过量表达硫脂酶基因，脂酰-CoA还原酶基因等，使大肠杆菌获得生产中碳脂肪醇的能力，结合过量表达乙酰-CoA羧化酶基因并敲除大肠杆菌的脂酰-CoA脱氢酶基因，进一步提高工程大肠杆菌的脂肪醇生产能力。该方法可用于重要化工原料中碳脂肪醇的生物合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌。
本发明还涉及一种用上述工程大肠杆菌制备中碳脂肪醇的方法。
背景技术
脂肪醇是合成表面活性剂、洗涤剂、增塑剂及其他多种精细化学用品的基础化工原料，广泛应用于纺织、日化、造纸、食品、医药、皮革等领域。其中，C12-C14链长的脂肪醇称作中碳脂肪醇，也称作洗涤剂醇，是表面活性剂的主要原料，中碳醇的产量占总醇产量的55％之多。其价格直接影响着脂肪醇的价格和利润，因此，中碳醇的生产具有重要的应用和市场前景。
目前，工业上生产的脂肪醇主要来自两个方面：
(1)合成脂肪醇：以化石能源-烯烃为原料合成脂肪醇，主要是通过羰基合成法和齐格勒合成法进行，前者的原料是α-烯烃或内烯烃，后者的原料为乙烯；
(2)天然脂肪醇：以天然油脂为原料生产天然脂肪醇，其主要工艺路线是在Cu-Cr或Cd-Cu-Cr等催化剂作用下，将脂肪酸甲酯或游离脂肪酸进行催化加氢得到脂肪醇(赵国志等，1994)。
随着石油资源的日益减少和价格的极不稳定，以烯烃为原料的合成脂肪醇产业正面临着很大的发展障碍。对于天然脂肪醇而言，国内天然脂肪醇的油脂原料主要从马来西亚、印度尼西亚和菲律宾等国家进口，其价格随石油和豆油价格涨价而猛涨，造成天然脂肪醇生产成本过高，这是引起国内天然脂肪醇价格居高不下的主要原因。因此，寻找合适、丰富的脂肪醇制备原料将是今后脂肪醇工业发展的重点方向。而利用微生物法合成脂肪醇可以很好的解决原料来源问题，并且和化学催化相比，微生物催化合成脂肪醇是一种更加绿色环保的方法，因此是今后脂肪醇工业发展的一个新的方向。
大肠杆菌具有遗传背景清楚，生长速度快，可实现高密度培养的优点，因此可以很好的用于代谢产物的生产。脂肪醇生产中很关键的一步是脂肪酸的生产，而乙酰-CoA(乙酰辅酶A)到丙二酰-CoA的转化，是脂肪酸生物合成中的限速酶。在大肠杆菌中过量表达乙酰-CoA羧化酶可以加快其脂肪酸合成的速率，从而使其积累更多的脂肪酸。
硫脂酶催化脂酰-ACP为游离脂肪酸，但是大肠杆菌自身的硫脂酶主要作用于C16和C18的脂酰-ACP，因此它主要积累C16和C18的脂肪酸。而据报道，U.californica，C.calophylla，C.hookeriana以及C.palustvis等生长的种子中积累癸酸和月桂酸等中短链脂肪酸(Voelker et al.，1992，Filichkin et al.，2005，Dehesh et al.，1996，Katayoon et al.，1996)。因此，在大肠杆菌中过量表达U.californica的硫脂酶基因BTE，或C.calophylla的Cc FatB2，或C.hookeriana的Ch FatB2，或C.palustvis的Cp FatB1等便可以获得中短链的脂肪酸。
游离脂肪酸在大肠杆菌脂酰-CoA合成酶(fadD)的作用下活化为脂酰-CoA，它可继续在脂酰-CoA脱氢酶(fadE)的作用下转化为烯酰-CoA，从而进入β-氧化途径。脂酰-CoA是脂肪醇生物合成途径的一个中间物，有必要阻止脂酰-CoA进入降解代谢途径以积累脂酰-CoA用于中碳脂肪醇的生物合成。
大肠杆菌自身并不能完成脂酰-CoA到脂肪醇的转化，但是来源于Arabidopsis thaliana和Simmondsia chinensis的脂酰-CoA还原酶具有将脂酰-CoA还原为脂肪醇的活性。因此，在大肠杆菌内过量表达A.thaliana的脂酰-CoA还原酶编码基因CER4或S.chinensis的脂酰-CoA还原酶编码基因FAR，就可以在大肠杆菌内实现脂酰-CoA到脂肪醇的转化。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌。
本发明的又一目的是提供利用上述工程大肠杆菌制备中碳脂肪醇的方法。
为实现上述目的，本发明中提供的用于制备中碳脂肪醇的，是通过以下方法构建而成：
通过PCR(聚合酶链式反应)扩增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因和脂酰-CoA还原酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为1-2∶4-5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4-7℃连接15-30小时，连接产物于38-42℃热击转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布平板培养15-30小时，PCR筛选阳性克隆。阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coli BL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。
本发明提供的利用上述工程大肠杆菌制备中碳脂肪醇的方法，是将工程大肠杆菌以1-2∶100-130(体积)的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，在35-37℃，225rpm条件下培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-0.2mmol·L-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入28-30℃，225rpm继续培养18-24小时；培养后的菌液离心取上清液，用等体积的正己烷萃取，制得中碳脂肪醇，所得脂肪醇通过GC-MS分析其组成及含量。正己烷减压蒸馏后回收使用。
本发明是在大肠杆菌中表达了调控脂肪酸生物合成以及控制脂肪酸链长以及还原脂肪酸的一系列关键酶基因。所获得的工程大肠杆菌可高密度培养，生长速度快，可很好的用于脂肪醇的生物合成。
附图说明
图1是在实施例1中构建pA-accABCD表达载体过程的示意图；
图2是在实施例1中构建pET-BTE/CER4表达载体过程的示意图。
具体实施方式
本发明通过在大肠杆菌中过量表达乙酰-CoA羧化酶、硫脂酶、脂酰-CoA还原酶，并失活大肠杆菌的脂酰-CoA脱氢酶，使大肠杆菌能够高效地将糖类转化为中碳脂肪醇。
本发明通过PCR扩增乙酰-CoA羧化酶基因，硫脂酶基因，脂酰-CoA还原酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为1∶5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4℃连接过夜，连接产物42℃热击转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布平板培养过夜，PCR筛选阳性克隆。阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coli BL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。
硫脂酶基因为来源于Umbellularia californica的BTE基因，或来源于Cuphea calophylla的Cc FatB2基因，或来源于Cuphea hookeriana的Ch FatB2基因，或来源于Cuphea palustvis的Cp FatB1基因，或同BTE，Cc FatB2，Ch FatB2和Cp FatB1同源性超过70％的DNA序列。
脂酰-CoA还原酶基因为来源于Arabidopsis thaliana的CER4基因，或来源于Simmondsia chinensis的FAR基因，或同CER4和FAR基因同源性超过70％的DNA序列。
乙酰-CoA羧化酶基因为来源于Acinetobacter calcoaceticus的accABCD基因，或来源于E.coli的accABCD基因，或来源于Corynebacteriumglutamicum的dtsR1-accBC基因，或同这些基因同源性超过70％的DNA序列。
脂酰-CoA脱氢酶基因为大肠杆菌的fadE基因。
构建好的工程大肠杆菌以1∶100的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，在37℃，225rpm条件下培养至OD600nm(需氧量)为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol·L-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入30℃，225rpm继续培养18-24小时。培养后的菌液12000g离心10分钟，取上清液，用等体积的正己烷萃取2-3次，减压蒸发除去正己烷后，制得中碳脂肪醇，所得脂肪醇通过GC-MS分析其组成及含量。正己烷减压蒸馏后回收使用。
以下举实施例并结合附图对本发明作详细描述。
实施例1
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，U.californica的BTE基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。
1.1)外源基因的克隆和表达载体的构建
1.1.1)外源基因的克隆
1.1.1.1)A.calcoaceticus乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆
提取A.calcoaceticus基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增下列基因：
accA：acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit)GeneID(NCBI)：2878570；
accBC(含accB和accC基因)：accB：biotin carboxyl carrier protein ofacetyl-CoA，GeneID(NCBI)：2878571；accC：acetyl-CoA carboxylase，GeneID(NCBI)：2878572；
accD：acetyl-CoA carboxylase，beta subunit，GeneID(NCBI)：2878573。
再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
1.1.1.2)硫脂酶基因的克隆
提取U.californica的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增克隆其硫脂酶基因BTE，GI(NCBI)：170555。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
1.1.1.3)脂酰-CoA还原酶基因的克隆
提取A.thaliana的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脂酰-CoA还原酶基因CER4，GI(NCBI)：240256152。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
1.1.2)表达载体的构建
1.1.2.1)pA-accABCD表达载体的构建(请参阅图1)
1.1.2.1.1)pA-accA载体的构建
将胶回收后的accA基因与pACYCDuet-1载体(Novagen)用BamH I和Sac I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accA后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.1.2)pA-accABC载体的构建
将胶回收后的accBC基因与pA-accA载体用Nde I和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accABC后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.1.3)pA-accD载体的构建
将胶回收后的accD基因与pACYCDuet-1载体(Novagen)用BamH I和Sac I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accD后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.1.4)pA-accABCD表达载体的构建
以pA-accD重组质粒为模板，扩增含有T7启动子的accD基因即T7-accD，用Sal I和Afl II分别双酶切T7-accD和pA-accABC，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accABCD后，再通过限制性酶切和测序鉴定pA-accABCD。
1.1.2.2)pET-BTE/CER4表达载体的构建(请参阅图2)
1.1.2.2.1)pET-BTE表达载体的构建
分别将胶回收后的BTE基因与pET-30a(+)载体用Nde I和Not I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-BTE后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-BTE。
1.1.2.2.2)pET-CER4表达载体的构建
分别将胶回收后的CER4基因和pET-30a(+)载体用Bgl II和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-CER4后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-CER4。
1.1.2.2.3)pET-BTE/CER4表达载体的构建
以pET-CER4为模板，PCR扩增含有T7启动子的CER4基因T7-CER4。然后分别将T7-CER4和载体pET-BTE用Not I和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coliDH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-BTE/CER4后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-BTE/CER4。
1.2)pA-accADBC和pET-BTE/CER4共同转化大肠杆菌
pET-BTE/CER4热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定；然后将pA-accADBC重组质粒热击转化含有pET-BTE/CER4的大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定。由此获得了含有pA-accADBC和pET-BTE/CER4两个表达载体的工程大肠杆菌。
1.3)大肠杆菌fadE基因的敲除
采用TargeTronTM基因敲除系统(Sigma-Aldrich)对大肠杆菌的fadE基因进行敲除。
1.4)SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的接种量接种到10mL LB液体培养液中(内含50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素)，37℃，225rpm振荡培养2h，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，然后转入30℃，225rpm继续培养3-4h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心2min，收集菌体，菌体细胞用0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，瞬时高速离心，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达。
1.5)工程大肠杆菌的培养
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到M9液体培养液中(内含50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素)，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养18-24h。
1.6)脂肪醇的提取
诱导培养后的菌液在12000g条件下，离心10min，收集上清液，并用等体积的正己烷萃取2-3次，旋转蒸发除去正己烷后即得中碳脂肪醇。正己烷回收利用。
1.7)脂肪醇组成及含量的测定
得到的脂肪醇通过GC-MS测定其组成及含量。
实施例2
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.calophylla的Cc FatB2基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例3
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.hookeriana的Ch FatB2基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例4
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.palustvis的Cp FatB1基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例5
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，U.californica的BTE基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例6
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.calophylla的Cc FatB2基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例7
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.hookeriana的Ch FatB2基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例8
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.palustvis的Cp FatB1基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例9
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，U.californica的BTE基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。
9.1)外源基因的克隆和表达载体的构建
9.1.1)外源基因的克隆
9.1.1.1)C.glutamicum乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆
提取C.glutamicum基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增下列基因：
dtsR1：acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit)，GeneID(NCBI)：3345446；
accBC：biotin carboxylase和biotin carboxyl carrier protein，GeneID(NCBI)：3343021；
再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
9.1.1.2)硫脂酶基因的克隆
提取U.californica的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增克隆其硫脂酶基因BTE，GI(NCBI)：170555。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
9.1.1.3)脂酰-CoA还原酶基因的克隆
提取A.thaliana的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脂酰-CoA还原酶基因CER4，GI(NCBI)：240256152。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
9.1.2)表达载体的构建
9.1.2.1)pA-dtsR1/accBC表达载体的构建
9.1.2.1.1)pA-dtsR1载体的构建
将胶回收后的dtsR1基因用Pag I和BamH I进行双酶切，载体pACYCDuet-1(Novagen)用Nco I和BamH I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-dtsR1后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
9.1.2.1.2)pA-dtsR1/accBC载体的构建
分别将胶回收后的accBC基因与pA-dtsR1载体用Mun I和Pac I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-dtsR1/accBC后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
9.1.2.2)pET-BTE/CER4表达载体的构建(附图2)
9.1.2.2.1)pET-BTE表达载体的构建
分别将胶回收后的BTE基因与pET-30a(+)载体用Nde I和Not I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-BTE后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-BTE。
9.1.2.2.2)pET-CER4表达载体的构建
分别将胶回收后的CER4基因和pET-30a(+)载体用Bgl II和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-CER4后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-CER4。
9.1.2.2.3)pET-BTE/CER4表达载体的构建
以pET-CER4为模板，PCR扩增含有T7启动子的CER4基因T7-CER4。然后分别将T7-CER4和载体pET-BTE用Not I和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coliDH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-BTE/CER4后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-BTE/CER4。
9.2)pA-dtsR1/accBC和pET-BTE/CER4共同转化大肠杆菌
pET-BTE/CER4热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定；然后将pA-dtsR1/accBC重组质粒热击转化含有pET-BTE/CER4的大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定。由此获得了含有pA-dtsR1/accBC和pET-BTE/CER4两个表达载体的工程大肠杆菌。
9.3)大肠杆菌fadE基因的敲除
采用TargeTronTM基因敲除系统(Sigma-Aldrich)对大肠杆菌的fadE基因进行敲除。
9.4)SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的接种量接种到10mL LB液体培养液中(内含50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素)，37℃，225rpm振荡培养2h，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，然后转入30℃，225rpm继续培养3-4h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心2min，收集菌体，菌体细胞用0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，瞬时高速离心，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达。
9.5)工程大肠杆菌的培养
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到M9液体培养液中(内含50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素)，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养18-24h。
9.6)脂肪醇的提取
诱导培养后的菌液在12000g条件下，离心10min，收集上清液，并用等体积的正己烷萃取2-3次，旋转蒸发除去正己烷后即得中碳脂肪醇。正己烷回收利用。
9.7)脂肪醇组成及含量的测定
得到的脂肪醇通过GC-MS测定其组成及含量。
实施例10
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.calophylla的Cc FatB2基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
实施例11
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.hookeriana的Ch FatB2基因和A.thaliana的CER4基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
实施例12
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.palustvis的Cp FatB1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
实施例13
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，U.californica的BTE基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例14
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.calophylla的Cc FatB2基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例15
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.hookeriana的Ch FatB2基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例16
通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.palustvis的Cp FatB1基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例17
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，U.californica的BTE基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例18
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.calophylla的Cc FatB2基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例19
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.hookeriana的Ch FatB2基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例20
通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.palustvis的Cp FatB1基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例1。
实施例21
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，U.californica的BTE基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
实施例22
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.calophylla的Cc FatB2基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
实施例23
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.hookeriana的Ch FatB2基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
实施例24
通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.palustvis的Cp FatB1基因和S.chinensis的FAR基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法过程同实施例9。
Claims (8)
1.一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌，通过下述方法得到：
通过聚合酶链式反应扩增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因和脂酰-CoA还原酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为1-2∶4-5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4-7℃连接15-30小时，连接产物于38-42℃热击转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布平板培养15-30小时，PCR筛选阳性克隆。阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coli BL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达硫脂酶。
3.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达脂酰-CoA还原酶。
4.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达乙酰-CoA羧化酶。
5.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，工程大肠杆菌通过摇瓶或发酵罐进行培养。
6.一种利用权利要求1所述工程大肠杆菌制备中碳脂肪醇的方法，将工程大肠杆菌以1-2∶100-130(v/v)的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，在35-37℃，225rpm条件下培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-0.2mmol·L-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入28-30℃，225rpm继续培养18-24小时；培养后的菌液离心取上清液，用等体积的正己烷萃取，减压蒸发除去正己烷后制得中碳脂肪醇。
7.根据权利要求6所述制备中碳脂肪醇的方法，其中，正己烷减压蒸馏后回收使用。
8.根据权利要求6所述制备中碳脂肪醇的方法，其中，所得脂肪醇通过GC-MS分析其组成及含量。
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