CN112063645A - 一种制备c14脂肪酸的方法 - Google Patents
一种制备c14脂肪酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112063645A CN112063645A CN202011026131.9A CN202011026131A CN112063645A CN 112063645 A CN112063645 A CN 112063645A CN 202011026131 A CN202011026131 A CN 202011026131A CN 112063645 A CN112063645 A CN 112063645A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- culture
- vector
- pet
- escherichia coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 21
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 23
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 101150046124 accA gene Proteins 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 13
- 101150097154 yneP gene Proteins 0.000 claims description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 12
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 8
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 241000023308 Acca Species 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 101100135734 Haloferax mediterranei (strain ATCC 33500 / DSM 1411 / JCM 8866 / NBRC 14739 / NCIMB 2177 / R-4) pccB gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150008263 accD gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 4
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 3
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 4
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
- C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
- C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种制备C14脂肪酸的方法。通过构建含有共同表达乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的重组表达载体的工程大肠杆菌中而获得。本发明所提供的高效产C14脂肪酸工程大肠杆菌是BL21(DE3)。该合成路径条件温和，产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件，同时不需要贵金属催化剂，有效的降低了生产成本，该方法为昆虫性信息素的生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备C14脂肪酸的方法，可作为生产斜纹夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期材料，以指导斜纹夜蛾性信息素的生物合成技术研究，提高田间防治效率，减少化学农药使用，保护环境，带来巨大的经济和社会收益。
技术背景
长期以来，农药特别是化学农药一直是斜纹夜蛾防治的主要手段。传统农用化学品带来的问题日益突出，易产生抗药性，难以降解并累积毒性甚至产生致癌性，影响农业生态安全、农产品质量、人体健康。
昆虫性信息素防治方法具有较强的特异性、灵敏度高、无污染、安全性高等优势。到目前为止，昆虫性信息素都是通过化学方法合成的，其反应条件苛刻(无水无氧反应)，催化剂和有机金属试剂昂贵，工艺路线长大规模生产难，稳定性差，直接限制了昆虫性信息素的工业化生产。目前通过研究基因工程技术、微生物法发酵、体外酶催化合成生产性信息素的方法微乎其微。
C：14脂肪酸是生物法合成斜纹夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期原料，然而来自植物和其他微生物生产宿主的脂肪酸的生物生产,在很大程度上依赖于操纵严格调节的脂肪酸生物合成途径，并且合成的脂肪酸是不同链长(C6-C24)的脂肪酸混杂在一起，C：14脂肪酸含量较低，较难分离。
本发明立足于江苏省农业科技自主创新资金项目，通过构建工程大肠杆菌的方法生产C：14脂肪酸，通过在关键技术上的创新，实现卡脖子技术的突破。本发明可减少传统农用化学品使用，保护环境，带来巨大的经济效益和社会收益。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备C14脂肪酸的方法，为斜纹夜蛾性信息素的生物合成技术提供一种必不可少的前期原料，可改善其化学合成法带来的大量问题。
本发明的技术方案为：一种制备C14脂肪酸的方法，其具体步骤为：
(1)提取并克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accA与硫脂酶基因yneP；
(2)将克隆的accA基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，yneP基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，将载体与基因片段按一定的比例连接，获得重组载体pET-accA与pET-TE；
(3)将构建好的重组载体pET-TE热击转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；
(4)再将pET-accA重组质粒热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大肠杆菌；冷冻保存该菌株；
(5)挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至含有抗生素的LB液体培养基发酵培养并诱导表达目的蛋白，培养至OD600为0.4-0.6时，再加入诱导剂至其在培养基中的终浓度为0.8-1mmol·L-1，继续培养8-24小时，培养液在8000—10000rpm条件下，离心5—10分钟，取培养液上清液；
(6)发酵培养上清液，萃取，减压浓缩，收集分析产物。
优选步骤(1)中所述accA基因来源于乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)基因组DNA，Genbank登录号为：2878570的序列。yneP基因来源于枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA，Genbank登录号为：2914242的序列。
优选步骤(2)中所述的accA基因与载体的酶切方法为NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与载体的酶切方法为NdeI/NotI双酶切。所述的载体为pET-30a或pQE80L，载体与基因片段按摩尔比为1∶(5—10)。
优选步骤(3)与步骤(4)中所述的热击转化温度均为35—45℃。优选保存温度为-80℃—-90℃。
优选步骤(5)中所述的菌体的体积接种量为0.5—1.5％；含有抗生素的LB液体培养基中的抗生素为卡那霉素或氨苄青霉素；含有抗生素的LB培养基中的抗生素浓度为30—50μg·mL-1。
优选步骤(5)中所述的发酵培养并诱导表达目的蛋白的培养条件、加入诱导剂后继续培养的培养条件和步骤(6)的发酵培养的培养条件均为：温度35—37℃，转速200—250rpm，pH6.5—7.5；优选步骤(6)中发酵培养上清液的时间为1.5～2.5小时。
优选步骤(5)中所述的诱导剂为IPTG。
优选步骤(6)中所述的萃取剂为氯仿和甲醇的混合液或正己烷，其中氯仿和甲醇的体积比为(3～4):2；发酵液和萃取剂的体积比为1∶(2—4)。
优选步骤(6)中所述分析方法为GC-MS法，色谱柱：CP-FFAP CB毛细管柱(25m*0.25mm*0.2μm)，升温程序：150℃保持1min，以10℃/min升至250℃，保持8min；载气N2；FID检测器。
有益效果：
该合成路径条件温和，产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件，同时不需要贵金属催化剂，有效的降低了生产成本，该方法为昆虫性信息素的生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
于细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA中提取乙酰辅酶A羧化酶基因accA(Gene ID：2878570)；以枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA为模板提取硫脂酶基因yneP(Gene ID：2914242)。将克隆的accA基因与pET-30a载体进行NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与pET-30a载体进行NdeI/NotI双酶切。载体与外源片段按摩尔比为1∶5，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA与pET-TE。将构建好的重组载体pET-TE45℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pET-accA重组质粒45℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌，-80℃保存该菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，将工程大肠杆菌按体积比0.5％的接种量接种到500mL内含50μg·mL-1的卡那霉素的LB液体培养液中，培养温度为35℃，转速为200rpm，pH为6.5的条件下进行培养至OD600为0.5时，再加入诱导剂IPTG至其在培养基中的终浓度为0.8mmol·L-1，同样条件下继续培养12小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000r条件下，离心8分钟，取上清液；发酵上清液，同样条件下(培养温度为35℃，转速为200rpm，pH为6.5)继续培养2小时，正己烷萃取，发酵液∶正己烷＝1∶2(V/V)，减压浓缩，收集产物。经GC-MS法检测，脂肪酸总产量达2.25g/L，短链脂肪酸比例为87.1％，C14脂肪酸204mg/L。
实施例2：
于细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA中提取乙酰辅酶A羧化酶基因accA(Gene ID：2878570)；以枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA为模板提取硫脂酶基因yneP(Gene ID：2914242)。将克隆的accA基因与pQE80L载体进行NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与pQE80L载体进行NdeI/NotI双酶切。载体与外源片段按摩尔比为1∶8，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA与pET-TE。将构建好的重组载体pET-TE40℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pET-accA重组质粒40℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌，-85℃保存该菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，将工程大肠杆菌按体积比1.0％的接种量接种到500mL内含40μg·mL-1的氨苄青霉素的LB液体培养液中，培养温度为36℃，转速为250rpm，pH为7.0的条件下进行培养至OD600为0.6时，再加入诱导剂IPTG至其在培养基中的终浓度为1.0mmol·L-1，继续培养24小时，诱导表达目的蛋白；培养液在10000r条件下，离心5分钟，取上清液；发酵上清液，同样条件下(培养温度为36℃，转速为250rpm，pH为7.0)继续培养1.5小时，剂氯仿和甲醇的混合液萃取，氯仿∶甲醇＝3∶2(V/V)，发酵液∶氯仿和甲醇的混合液＝1∶4(V/V)，减压浓缩，收集产物。经GC-MS法检测，脂肪酸总产量达2.45g/L，短链脂肪酸比例为88.1％，C14脂肪酸256mg/L。
实施例3：
于细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA中提取乙酰辅酶A羧化酶基因accA(Gene ID：2878570)；以枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA为模板提取硫脂酶基因yneP(Gene ID：2914242)。将克隆的accA基因与pET-30a载体进行NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与pET-30a载体进行NdeI/NotI双酶切。载体与外源片段按摩尔比为1∶10，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA与pET-TE。将构建好的重组载体pET-TE35℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pET-accA重组质粒35℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌，-90℃保存该菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，将工程大肠杆菌按体积比1.5％的接种量接种到500mL内含30μg·mL-1的卡那霉素的LB液体培养液中，培养温度为37℃，转速为250rpm，pH为7.5的条件下进行培养至OD600为0.4时，再加入诱导剂IPTG至其在培养基中的终浓度为0.8mmol·L-1，继续培养8小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000r条件下，离心10分钟，取上清液；发酵上清液，同样条件下(培养温度为37℃，转速为250rpm，pH为7.5)继续培养2.5小时，剂氯仿和甲醇的混合液萃取，氯仿∶甲醇＝4∶2(V/V)，发酵液∶氯仿和甲醇的混合液＝1∶3(V/V)，减压浓缩，收集产物。经GC-MS法检测，脂肪酸总产量达2.2g/L，短链脂肪酸比例为85.9％，C14脂肪酸235mg/L。
Claims (8)
1.一种制备C14脂肪酸的方法，其具体步骤为：
(1)提取并克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accA与硫脂酶基因yneP；
(2)将克隆的accA基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，yneP基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，将载体与基因片段按一定的比例连接，获得重组载体pET-accA与pET-TE；
(3)将构建好的重组载体pET-TE热击转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；
(4)再将pET-accA重组质粒热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大肠杆菌；冷冻保存该菌株；
(5)挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至含有抗生素的LB液体培养基发酵培养并诱导表达目的蛋白，培养至OD600为0.4～0.6时，再加入诱导剂至其在培养基中的终浓度为0.8～1mmol·L-1，继续培养8-24小时，培养液在8000～10000rpm条件下，离心5—10分钟，取培养液上清液；
(6)发酵培养上清液，萃取，减压浓缩，收集分析产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的accA基因与载体的酶切方法为NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与载体的酶切方法为NdeI/NotI双酶切。所述的载体为pET-30a或pQE80L，载体与基因片段按摩尔比为1∶(5～10)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)与步骤(4)中所述的热击转化温度均为35～45℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻保存温度为-80℃～-90℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的菌体的体积接种量为0.5～1.5％；含有抗生素的LB液体培养基中的抗生素为卡那霉素或氨苄青霉素；含有抗生素的LB培养基中的抗生素浓度为30～50μg·mL-1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的发酵培养并诱导表达目的蛋白的培养条件、加入诱导剂后继续培养的培养条件和步骤(6)的发酵培养的培养条件均为：温度35～37℃，转速200～250rpm，pH6.5～7.5；步骤(6)中发酵培养上清液的时间为1.5～2.5小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的诱导剂为IPTG。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的萃取剂为氯仿和甲醇的混合液或正己烷，其中氯仿和甲醇的体积比为(3～4):2；发酵液和萃取剂的体积比为1∶(2～4)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011026131.9A CN112063645A (zh) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | 一种制备c14脂肪酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011026131.9A CN112063645A (zh) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | 一种制备c14脂肪酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112063645A true CN112063645A (zh) | 2020-12-11 |
Family
ID=73683558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011026131.9A Pending CN112063645A (zh) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | 一种制备c14脂肪酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112063645A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101514351A (zh) * | 2008-02-20 | 2009-08-26 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法 |
| CN101899412A (zh) * | 2009-08-12 | 2010-12-01 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌 |
| CN101899411A (zh) * | 2009-08-12 | 2010-12-01 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌 |
| KR20120055169A (ko) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | 서강대학교산학협력단 | 말로닐?ＣｏＡ와 말로닐?［ａｃｐ］를 이용한 지방산 생합성 경로 과발현용 형질전환 대장균 및 그의 제조방법 |
| CN103958692A (zh) * | 2010-12-23 | 2014-07-30 | 艾克森美孚研究与工程公司 | 包含4-羟基苯甲酰基-coa硫酯酶的遗传改造的微生物以及使用其的方法 |
-
2020
- 2020-09-25 CN CN202011026131.9A patent/CN112063645A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101514351A (zh) * | 2008-02-20 | 2009-08-26 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法 |
| CN101899412A (zh) * | 2009-08-12 | 2010-12-01 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌 |
| CN101899411A (zh) * | 2009-08-12 | 2010-12-01 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌 |
| KR20120055169A (ko) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | 서강대학교산학협력단 | 말로닐?ＣｏＡ와 말로닐?［ａｃｐ］를 이용한 지방산 생합성 경로 과발현용 형질전환 대장균 및 그의 제조방법 |
| CN103958692A (zh) * | 2010-12-23 | 2014-07-30 | 艾克森美孚研究与工程公司 | 包含4-羟基苯甲酰基-coa硫酯酶的遗传改造的微生物以及使用其的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ZHU ET AL.: "Biosynthesis of the Nematode Attractant 2-Heptanone and Its Co-evolution Between the Pathogenic Bacterium Bacillus nematocida and Non-pathogenic Bacterium Bacillus subtilis", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 * |
| 李玲玲等: "利用工程大肠杆菌生产不同类型的游离脂肪酸", 《食品工业科技》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106957850B (zh) | 一株产磷脂酶d的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN113046283A (zh) | 一株通过还原tca途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法 | |
| CN113444713A (zh) | 一种L-赖氨酸脱羧酶SpLDC及其在产1，5-戊二胺上的应用 | |
| CN109679978A (zh) | 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用 | |
| CN103865959A (zh) | 一种生物法合成木糖酸的方法 | |
| CN112063645A (zh) | 一种制备c14脂肪酸的方法 | |
| CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN112143692B (zh) | 一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用 | |
| CN112226422B (zh) | 一种活性提高的EstWY酶突变体 | |
| US11760988B2 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof | |
| CN113025546B (zh) | 一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇的方法 | |
| CN115247144B (zh) | 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN113151204B (zh) | 邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用 | |
| CN114075526B (zh) | 一种高效生产(2s,3s)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN114381412B (zh) | 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN110964704B (zh) | 羟基氧化酶cyb5a突变体与环系列产品的制备方法 | |
| CN113755419B (zh) | 生产己二胺的重组质粒及其应用 | |
| RU2731289C2 (ru) | Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора | |
| CN101892228A (zh) | 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用 | |
| CN106191019B (zh) | 一种截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 | |
| CN106191020B (zh) | 一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 | |
| CN118755652A (zh) | 一种重组大肠杆菌及其合成1,5-戊二胺的方法 | |
| CN116904492A (zh) | 一种高产异戊二烯的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用 | |
| CN113897402A (zh) | 白皮衫醇的生物催化合成方法 | |
| CN113249281A (zh) | 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20201211 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |