CN112063645A - 一种制备c14脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备C14脂肪酸的方法。通过构建含有共同表达乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的重组表达载体的工程大肠杆菌中而获得。本发明所提供的高效产C14脂肪酸工程大肠杆菌是BL21(DE3)。该合成路径条件温和，产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件，同时不需要贵金属催化剂，有效的降低了生产成本，该方法为昆虫性信息素的生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备C14脂肪酸的方法，可作为生产斜纹夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期材料，以指导斜纹夜蛾性信息素的生物合成技术研究，提高田间防治效率，减少化学农药使用，保护环境，带来巨大的经济和社会收益。
技术背景
长期以来，农药特别是化学农药一直是斜纹夜蛾防治的主要手段。传统农用化学品带来的问题日益突出，易产生抗药性，难以降解并累积毒性甚至产生致癌性，影响农业生态安全、农产品质量、人体健康。
昆虫性信息素防治方法具有较强的特异性、灵敏度高、无污染、安全性高等优势。到目前为止，昆虫性信息素都是通过化学方法合成的，其反应条件苛刻(无水无氧反应)，催化剂和有机金属试剂昂贵，工艺路线长大规模生产难，稳定性差，直接限制了昆虫性信息素的工业化生产。目前通过研究基因工程技术、微生物法发酵、体外酶催化合成生产性信息素的方法微乎其微。
C：14脂肪酸是生物法合成斜纹夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期原料，然而来自植物和其他微生物生产宿主的脂肪酸的生物生产,在很大程度上依赖于操纵严格调节的脂肪酸生物合成途径，并且合成的脂肪酸是不同链长(C6-C24)的脂肪酸混杂在一起，C：14脂肪酸含量较低，较难分离。
本发明立足于江苏省农业科技自主创新资金项目，通过构建工程大肠杆菌的方法生产C：14脂肪酸，通过在关键技术上的创新，实现卡脖子技术的突破。本发明可减少传统农用化学品使用，保护环境，带来巨大的经济效益和社会收益。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备C14脂肪酸的方法，为斜纹夜蛾性信息素的生物合成技术提供一种必不可少的前期原料，可改善其化学合成法带来的大量问题。
本发明的技术方案为：一种制备C14脂肪酸的方法，其具体步骤为：
(1)提取并克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accA与硫脂酶基因yneP；
(2)将克隆的accA基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，yneP基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，将载体与基因片段按一定的比例连接，获得重组载体pET-accA与pET-TE；
(3)将构建好的重组载体pET-TE热击转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；
(4)再将pET-accA重组质粒热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大肠杆菌；冷冻保存该菌株；
(5)挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至含有抗生素的LB液体培养基发酵培养并诱导表达目的蛋白，培养至OD600为0.4-0.6时，再加入诱导剂至其在培养基中的终浓度为0.8-1mmol·L-1，继续培养8-24小时，培养液在8000—10000rpm条件下，离心5—10分钟，取培养液上清液；
(6)发酵培养上清液，萃取，减压浓缩，收集分析产物。
优选步骤(1)中所述accA基因来源于乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)基因组DNA，Genbank登录号为：2878570的序列。yneP基因来源于枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA，Genbank登录号为：2914242的序列。
优选步骤(2)中所述的accA基因与载体的酶切方法为NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与载体的酶切方法为NdeI/NotI双酶切。所述的载体为pET-30a或pQE80L，载体与基因片段按摩尔比为1∶(5—10)。
优选步骤(3)与步骤(4)中所述的热击转化温度均为35—45℃。优选保存温度为-80℃—-90℃。
优选步骤(5)中所述的菌体的体积接种量为0.5—1.5％；含有抗生素的LB液体培养基中的抗生素为卡那霉素或氨苄青霉素；含有抗生素的LB培养基中的抗生素浓度为30—50μg·mL-1。
优选步骤(5)中所述的发酵培养并诱导表达目的蛋白的培养条件、加入诱导剂后继续培养的培养条件和步骤(6)的发酵培养的培养条件均为：温度35—37℃，转速200—250rpm，pH6.5—7.5；优选步骤(6)中发酵培养上清液的时间为1.5～2.5小时。
优选步骤(5)中所述的诱导剂为IPTG。
优选步骤(6)中所述的萃取剂为氯仿和甲醇的混合液或正己烷，其中氯仿和甲醇的体积比为(3～4):2；发酵液和萃取剂的体积比为1∶(2—4)。
优选步骤(6)中所述分析方法为GC-MS法，色谱柱：CP-FFAP CB毛细管柱(25m*0.25mm*0.2μm)，升温程序：150℃保持1min，以10℃/min升至250℃，保持8min；载气N2；FID检测器。
有益效果：
该合成路径条件温和，产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件，同时不需要贵金属催化剂，有效的降低了生产成本，该方法为昆虫性信息素的生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
于细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA中提取乙酰辅酶A羧化酶基因accA(Gene ID：2878570)；以枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA为模板提取硫脂酶基因yneP(Gene ID：2914242)。将克隆的accA基因与pET-30a载体进行NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与pET-30a载体进行NdeI/NotI双酶切。载体与外源片段按摩尔比为1∶5，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA与pET-TE。将构建好的重组载体pET-TE45℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pET-accA重组质粒45℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌，-80℃保存该菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，将工程大肠杆菌按体积比0.5％的接种量接种到500mL内含50μg·mL-1的卡那霉素的LB液体培养液中，培养温度为35℃，转速为200rpm，pH为6.5的条件下进行培养至OD600为0.5时，再加入诱导剂IPTG至其在培养基中的终浓度为0.8mmol·L-1，同样条件下继续培养12小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000r条件下，离心8分钟，取上清液；发酵上清液，同样条件下(培养温度为35℃，转速为200rpm，pH为6.5)继续培养2小时，正己烷萃取，发酵液∶正己烷＝1∶2(V/V)，减压浓缩，收集产物。经GC-MS法检测，脂肪酸总产量达2.25g/L，短链脂肪酸比例为87.1％，C14脂肪酸204mg/L。
实施例2：
于细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA中提取乙酰辅酶A羧化酶基因accA(Gene ID：2878570)；以枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA为模板提取硫脂酶基因yneP(Gene ID：2914242)。将克隆的accA基因与pQE80L载体进行NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与pQE80L载体进行NdeI/NotI双酶切。载体与外源片段按摩尔比为1∶8，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA与pET-TE。将构建好的重组载体pET-TE40℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pET-accA重组质粒40℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌，-85℃保存该菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，将工程大肠杆菌按体积比1.0％的接种量接种到500mL内含40μg·mL-1的氨苄青霉素的LB液体培养液中，培养温度为36℃，转速为250rpm，pH为7.0的条件下进行培养至OD600为0.6时，再加入诱导剂IPTG至其在培养基中的终浓度为1.0mmol·L-1，继续培养24小时，诱导表达目的蛋白；培养液在10000r条件下，离心5分钟，取上清液；发酵上清液，同样条件下(培养温度为36℃，转速为250rpm，pH为7.0)继续培养1.5小时，剂氯仿和甲醇的混合液萃取，氯仿∶甲醇＝3∶2(V/V)，发酵液∶氯仿和甲醇的混合液＝1∶4(V/V)，减压浓缩，收集产物。经GC-MS法检测，脂肪酸总产量达2.45g/L，短链脂肪酸比例为88.1％，C14脂肪酸256mg/L。
实施例3：
于细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA中提取乙酰辅酶A羧化酶基因accA(Gene ID：2878570)；以枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA为模板提取硫脂酶基因yneP(Gene ID：2914242)。将克隆的accA基因与pET-30a载体进行NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与pET-30a载体进行NdeI/NotI双酶切。载体与外源片段按摩尔比为1∶10，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA与pET-TE。将构建好的重组载体pET-TE35℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pET-accA重组质粒35℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌，-90℃保存该菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，将工程大肠杆菌按体积比1.5％的接种量接种到500mL内含30μg·mL-1的卡那霉素的LB液体培养液中，培养温度为37℃，转速为250rpm，pH为7.5的条件下进行培养至OD600为0.4时，再加入诱导剂IPTG至其在培养基中的终浓度为0.8mmol·L-1，继续培养8小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000r条件下，离心10分钟，取上清液；发酵上清液，同样条件下(培养温度为37℃，转速为250rpm，pH为7.5)继续培养2.5小时，剂氯仿和甲醇的混合液萃取，氯仿∶甲醇＝4∶2(V/V)，发酵液∶氯仿和甲醇的混合液＝1∶3(V/V)，减压浓缩，收集产物。经GC-MS法检测，脂肪酸总产量达2.2g/L，短链脂肪酸比例为85.9％，C14脂肪酸235mg/L。
Claims (8)
1.一种制备C14脂肪酸的方法，其具体步骤为：
(1)提取并克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accA与硫脂酶基因yneP；
(2)将克隆的accA基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，yneP基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，将载体与基因片段按一定的比例连接，获得重组载体pET-accA与pET-TE；
(3)将构建好的重组载体pET-TE热击转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；
(4)再将pET-accA重组质粒热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大肠杆菌；冷冻保存该菌株；
(5)挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至含有抗生素的LB液体培养基发酵培养并诱导表达目的蛋白，培养至OD600为0.4～0.6时，再加入诱导剂至其在培养基中的终浓度为0.8～1mmol·L-1，继续培养8-24小时，培养液在8000～10000rpm条件下，离心5—10分钟，取培养液上清液；
(6)发酵培养上清液，萃取，减压浓缩，收集分析产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的accA基因与载体的酶切方法为NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与载体的酶切方法为NdeI/NotI双酶切。所述的载体为pET-30a或pQE80L，载体与基因片段按摩尔比为1∶(5～10)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)与步骤(4)中所述的热击转化温度均为35～45℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻保存温度为-80℃～-90℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的菌体的体积接种量为0.5～1.5％；含有抗生素的LB液体培养基中的抗生素为卡那霉素或氨苄青霉素；含有抗生素的LB培养基中的抗生素浓度为30～50μg·mL-1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的发酵培养并诱导表达目的蛋白的培养条件、加入诱导剂后继续培养的培养条件和步骤(6)的发酵培养的培养条件均为：温度35～37℃，转速200～250rpm，pH6.5～7.5；步骤(6)中发酵培养上清液的时间为1.5～2.5小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的诱导剂为IPTG。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的萃取剂为氯仿和甲醇的混合液或正己烷，其中氯仿和甲醇的体积比为(3～4):2；发酵液和萃取剂的体积比为1∶(2～4)。
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