CN115247144B - 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents

生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。为了解决利用现有酶法或全细胞催化法生产L‑THA需要外加昂贵底物导致生产成本高的问题，本发明提供了一种低成本且可高效生产L‑THA的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌，沉默表达天冬氨酸激酶III基因lysC，并过表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬酰胺加氧酶基因asnO和天冬氨酸氨解酶基因aspA。利用该基因工程菌，以葡萄糖为碳源进行发酵就可以达到高效生产L‑THA的目的，对于实现L‑THA的低成本绿色合成具有重要意义。

Description

生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用。
背景技术
L-苏式-3-羟基天冬氨酸(L-threo-3-hydroxyaspartic acid，L-THA)作为羟基氨基酸的一种，其合成方法和生物学特性受到研究者的关注。L-THA可以作为抗各种微生物的抗菌剂，作为谷氨酸转运蛋白的抑制剂，也是聚甲基丙烯酰胺聚合物的官能部分。L-THA由于其广泛的临床和材料用途，对化学家和生物学家很有吸引力。目前L-THA的合成主要依赖于化学方法，然而这些方法合成L-THA会伴随着立体异构体的生成，例如D-THA，因此往往需要复杂的纯化工艺才能获得L-THA。与化学合成相反，生物酶具有出色的化学区域和立体选择性，使得生物酶催化成为手性化合物合成领域的研究热点和有效途径。
目前利用微生物代谢工程技术或酶工程技术合成L-THA的方法较少，主要集中在两个酶催化转化途径：一是利用天冬酰胺加氧酶突变体(AsnO-D241N)或其同源酶(SCO2693-D246N)用于L-天冬氨酸的直接羟基化(如专利US20100184189A1和公开于2008年9月题为Non-Heme Hydroxylase Engineering For Simple Enzymatic Synthesis of l-threo-Hydroxyaspartic Acid记载)；二是构建了过表达野生型天冬酰胺加氧酶AsnO或SCO2693，并敲除天冬酰胺酶I的基因工程菌，以L-天冬酰胺为底物合成L-苏式-3-羟基天冬酰胺，然后通过天冬酰胺酶II水解得到L-THA，实现了L-THA的生物合成途径(如公开于2005年6月题为One-Pot Production of L-threo-3-Hydroxyaspartic Acid UsingAsparaginase-Deficient Escherichia coli Expressing Asparagine Hydroxylase ofStreptomyces coelicolor A3(2)的文章记载)。以上所述方法采用酶或全细胞催化法实现L-THA的生物合成，但由于产量较低并且其反应体系需要外加底物L-天冬酰胺和共底物α-酮戊二酸等，导致生产成本很高，难以用于工业生产。
综上，找到一种产率高、成本低适用于工业生产的L-苏式-3-羟基天冬氨酸的生产方法变得尤为重要。
发明内容
针对利用现有酶法或全细胞催化法生产L-THA存在的产量低且需要外加昂贵底物导致生产成本高的问题，本发明提供了一种以葡萄糖为底物，能够高效生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌为沉默表达天冬氨酸激酶III基因lysC，并过表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬酰胺加氧酶基因asnO和天冬氨酸氨解酶基因aspA的大肠杆菌。
在本发明的一个实施方式中，天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬氨酸氨解酶基因aspA和天冬氨酸激酶III基因lysC均来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，天冬氨酸转氨酶基因aspC的Gene ID为945553，天冬酰胺合成酶基因asnB的Gene ID为945281，天冬氨酸氨解酶基因aspA的Gene ID为948658，天冬氨酸激酶III基因lysC的Gene ID为948531。
在本发明的一个实施方式中，天冬酰胺加氧酶基因asnO来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一个实施方式中，以pET28a(+)质粒表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬酰胺加氧酶基因asnO；以pACYCDuet-1质粒表达天冬氨酸氨解酶基因aspA。
本发明还提供了一种微生物发酵法转化生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的方法，该方法以葡萄糖为底物，利用上述的基因工程菌发酵生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸。
在本发明的一个实施方式中，所述方法为将所述基因工程菌接种于种子培养基，经培养后获得种子液，再将种子液接种于发酵培养基，经诱导后，获得发酵液。
在本发明的一个实施方式中，种子培养基为液体LB培养基，种子培养的条件为35℃～37℃，200rpm～250rpm，摇瓶培养10h～14h。
在本发明的一个实施方式中，发酵培养基为M9培养基，种子液的接种量为1％～2％(v/v)。
在本发明的一个实施方式中，发酵液的具体制备方法为接入种子液后于35℃～37℃的条件下，培养至OD600为0.6～0.8，然后加入0.2mM IPTG，28℃～32℃诱导3h～4h，再加入终浓度为1mM的L-谷氨酰胺，0.5mM FeSO4·7H2O和1mM抗坏血酸，于28℃～32℃、150rpm～200rpm的条件下继续培养20h～28h，结束发酵过程。
本发明还提供了上述基因工程菌或上述微生物发酵法转化生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的方法在生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸中的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用代谢工程手段在大肠杆菌体内重构L-THA代谢网络，所得基因工程菌株直接发酵葡萄糖即可高效生产L-THA，对于实现L-THA的低成本绿色合成具有重要意义。
在相同发酵培养条件下，过表达天冬酰胺加氧酶基因asnO、天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬氨酸氨解酶基因aspA并敲除天冬氨酸激酶III基因lysC的重组菌株L-THA产量可达280.80mg/L，与只表达天冬酰胺加氧酶基因asnO的重组菌株相比，L-THA产量提高了约4.6倍；与只表达基因asnO和aspC、或只表达基因asnO和asnB的两种重组菌种相比，L-THA产量提高了约4倍；与只表达基因aspC、asnB和asnO的重组菌株相比，L-THA产量提高了约2倍；与表达基因aspC、asnB、asnO和aspA的重组菌株相比，L-THA产量提高了约30％。
附图说明
图1为pCBO重组质粒结构示意图；
图2为pACY-aspA重组质粒结构示意图；
图3为FDAA衍生化法检测发酵产物及L-THA标准品的HPLC结果图。
具体实施方式
本发明中使用的缩写或简称如下：
L-苏式-3-羟基天冬氨酸(L-threo-3-hydroxyaspartic acid)：L-THA
异丙基硫代半乳糖苷：IPTG
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli
本发明设计的培养基及其配方如下：
种子培养基(LB液体培养基)：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，余量为水，添加终浓度为50μg/mL卡那霉素和终浓度为25μg/mL的氯霉素。
M9培养基：15.2g/L Na2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl,0.24g/L MgSO4·7H2O，20g/L葡萄糖，余量为水；发酵液中卡那霉素和氯霉素终浓度分别为50μg/mL和25μg/mL；发酵培养基pH7.0。
发酵液中L-THA含量的检测方法：
采用柱前衍生法测定各基因工程菌发酵液中的L-THA含量，具体步骤为：
将发酵液于10000rpm的条件离心10min，获得上清液，再取400μL上清液，加入终浓度5mM FDAA和30mM NaHCO3，37℃反应2h，然后取出冷却至室温，加1M HCl 20μL，终止反应；过0.22μm有机滤膜，采用HPLC检测L-THA的产量。
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：基因工程菌的构建
本实施例中的引物序列见表1
(一)重组质粒pO、pCO、pCBO和pBO的构建
(1)构建重组质粒pO
将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的天冬酰胺加氧酶基因asnO按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，委托基因合成公司合成基因，所得基因asnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将获得的基因asnO克隆至pET28a(+)质粒，使用酶切位点为BamHI和Hind III，得到重组质粒pET28a-asnO，命名为pO。
(2)重组质粒pCO的构建
以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以aspC-F和aspC-R为引物，PCR扩增天冬氨酸转氨酶基因aspC基因片段(所述aspC基因的Gene ID为945553)。使用限制性内切酶Not I和XhoI对所得的aspC基因片段和步骤1)得到的pO质粒进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析，构建成功的重组质粒为pET28a-asnO-aspC，命名为pCO。
(3)重组质粒pCBO的构建
以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以asnB-F和asnB-R为引物PCR扩增asnB天冬酰胺合成酶基因片段(所述asnB基因的Gene ID为945281)，使用限制性内切酶Not I和Hind III对所得asnB基因和步骤2)所得pCO质粒进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析进行确认，构建成功的重组质粒为pET28a-aspC-asnB-asnO，命名为pCBO，其结构示意图如图1所示。
(4)重组质粒pBO的构建
以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以asnB-F和asnB-R为引物PCR扩增asnB天冬酰胺合成酶基因片段(所述asnB基因的Gene ID为945281)，使用限制性内切酶Not I和Hind III对所得asnB基因和步骤1)所得pO质粒进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析进行确认，构建成功的重组质粒为pET28a-asnO-asnB，命名为pBO。
(二)重组质粒pACY-aspA的构建
以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以aspA-F和aspA-R为引物PCR扩增天冬氨酸氨解酶基因aspA基因片段(所述aspA基因的Gene ID为948658)，使用限制性内切酶EcoR V和NdeI对所得aspA基因和质粒pACYCDuet-1进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析进行确认，构建成功的重组质粒为pACY-aspA，其结构示意图如图2所示。
(三)宿主菌的基因敲除
采用P1噬菌体转导技术敲除宿主菌BL21(DE3)基因组上的lysC基因(所述lysC基因的Gene ID为948531)。以lysC-outup和kan-3’为引物，对lysC敲除菌进行菌落PCR验证，筛选阳性菌株。使用温敏型质粒Pcp20对敲除成功的阳性菌株进行卡那霉素抗性基因片段的消除，以lysC-outup和lysC-outdown为引物对消抗成功的lysC基因敲除菌进行PCR菌落验证和DNA测序分析，验证正确的重组宿主菌为BL21(DE3)ΔlysC。
(四)生产L-THA的基因工程菌的构建
将重组质粒pO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA02；将重组质粒pCO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA03；将重组质粒pBO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA04；将重组质粒pCBO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA05；将重组质粒pCBO和重组质粒pACY-aspA共同转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CC02；将重组质粒pCBO和重组质粒pACY-aspA共同转化至敲除lysC的重组宿主菌BL21(DE3)ΔlysC中，得到重组菌株CC03，其中重组菌株CC03为可高效生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌。FDAA衍生化法检测利用重组菌株CC03发酵所得产物及L-THA标准品的HPLC结果如图3。
表1.相关引物序列
Figure BDA0003040713280000051
实施例2：基因工程菌在生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸中的应用
将实施例1所得基因工程菌CA02、CA03、CA04、CA05、CC02和CC03分别接种于种子培养基(LB液体培养基)，37℃，220rpm摇瓶过夜培养；以1％的接种量(体积比)将种子液转接于M9培养基，37℃培养至OD600为0.6时加入终浓度0.2mM IPTG诱导，培养温度为30℃，诱导4h后加入终浓度1mM L-谷氨酰胺，0.5mM FeSO4·7H2O和1mM抗坏血酸，于30℃、180rpm继续培养24h，发酵结束取发酵液样品进行离心，取上清液，采用柱前衍生法测定各基因工程菌发酵液中的L-THA含量，检测结果如表2所示。
结果显示，过表达天冬酰胺加氧酶基因asnO、天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬氨酸氨解酶基因aspA并敲除天冬氨酸激酶III基因lysC的重组菌株CC03的L-THA产量最高，达到280.80mg/L，而只表达天冬酰胺加氧酶基因asnO的重组菌株CA02的L-THA产量为49.80mg/L，即在相同发酵培养条件下，含有两种重组质粒pCBO和pACY-aspA并且敲除lysC基因的重组菌株CC03比含有单质粒pO的重组菌株L-THA产量提高了约4.6倍；与只含有pCO或pBO的两种重组菌种相比，L-THA产量提高了约4倍；与只含有pET28a-aspC-asnB-asnO的重组菌株CA05相比，L-THA产量提高了约2倍；与含有质粒pET28a-aspC-asnB-asnO和pACY-aspA的重组菌株CC02相比，L-THA产量提高了约30％。
表2.各基因工程菌对应的L-THA产量
Figure BDA0003040713280000061
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究
<120> 生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 1
atggcggcga atgcagcagg tcctgcgagc cgttatgatg tgaccctgga tcagagcgat 60
gcggaactgg tggaagaaat tgcgtggaaa ctggcgactc aagcgaccgg tcgtcctgat 120
gatgcggaat gggttgaagc agcgcgtaat gcgtggcatg cgtggcctgc aaccttacgt 180
cgtgatctgg cgggttttcg tcgtgatagc ggtcctgatg gcgcgattgt gttacgcggt 240
ttaccggtgg atagcatggg tttaccgcct accccgcgtg ttaacggtag cgttcagcgc 300
gaagcgagct taggtgcggc ggtgttactg atgaccgcgt gcggtttagg tgatccgggt 360
gcgtttctgc cggaaaaaaa cggtgcgctg gtgcaggatg ttgttcctgt tccgggcatg 420
gaagaatttc agggcaacgc gggctcaacc ctgctgacct ttcataacga aaacgcgttt 480
catgaacatc gcccggattt tgtgatgctg ctgtgcttac gtgcagatcc taccggccgt 540
gcaggtttac gtaccgcatg tgttcgccgc gttctgcctt tactgagcga tagcaccgtt 600
gatgcgttat gggcgcctga atttcgtacc gcaccgcctc ctagctttca actgagcggc 660
cctgaagaag caccggcgcc ggttttatta ggcgatcgca gcgatcctga tctgcgtgtt 720
gatctggcgg cgaccgaacc tgttactgaa cgtgcggcgg aagcgttacg tgaactgcag 780
gcgcattttg atgcgaccgc ggttacccat cgtctgttac ctggcgaact ggcgattgtg 840
gataaccgcg tgaccgttca tggtcgcacc gaatttaccc cgcgctatga tggtaccgat 900
cgctggttac agcgcacctt tgtgctgacc gatttacgtc gcagccgtgc gatgcgtcct 960
gcggatggct atgttttagg tgcggcgcct caacctgcat aa 1002
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ataagaatgc ggccgcaagg agatatacca tgtttgagaa cattaccgcc gct 53
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ccgctcgagt tacagcactg ccacaatcgc ttc 33
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
cccaagctta aggagatata ccatgtgttc aatttttggc gtatt 45
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
ataagaatgc ggccgcttac ttatacgccg actggtgaa 39
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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ggatcttcca gagatggatc cgatgtcaaa caacattcgt atcgaag 47
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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ctgccgttcg acgataagct tttactgttc gctttcatca gtatagcg 48
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<212> DNA
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tgaacggctg gccacgttca tcatcg 26
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<213> 人工合成()
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ggtgagatga caggagatcc 20
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 10
gcagaactga taatattcat tttgcctt 28

Claims (8)

1.生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为沉默表达天冬氨酸激酶III基因lysC，并过表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬酰胺加氧酶基因asnO和天冬氨酸氨解酶基因aspA的大肠杆菌；所述天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬氨酸氨解酶基因aspA和天冬氨酸激酶III基因lysC均来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，所述天冬氨酸转氨酶基因aspC的Gene ID为945553，天冬酰胺合成酶基因asnB的Gene ID为945281，天冬氨酸氨解酶基因aspA的GeneID为948658，天冬氨酸激酶III基因lysC的Gene ID为948531；所述天冬酰胺加氧酶基因asnO来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以pET28a(+)质粒表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬酰胺加氧酶基因asnO；以pACYCDuet-1质粒表达天冬氨酸氨解酶基因aspA。
3.一种微生物发酵法转化生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的方法，其特征在于，以葡萄糖为底物，利用权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌发酵生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为将所述基因工程菌接种于种子培养基，经培养后获得种子液，再将种子液接种于发酵培养基，经诱导后，获得发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为液体LB培养基，所述种子培养的条件为35℃～37℃，200rpm～250rpm，摇瓶培养10h～14h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为M9培养基，种子液的接种量为1％～2％(v/v)。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵液的具体制备方法为接入种子液后于35℃～37℃的条件下，培养至OD600为0.6～0.8，然后加入0.2mM IPTG，28℃～32℃诱导3h～4h，再加入终浓度为1mM的L-谷氨酰胺，0.5mM FeSO4·7H2O和1mM抗坏血酸，于28℃～32℃、150rpm～200rpm的条件下继续培养20h～28h，结束发酵过程。
8.权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌或权利要求3-7任意一项所述的方法在生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸中的应用。
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