CN109402097A - 一种L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株以及应用 - Google Patents

一种L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑天冬氨酸α‑脱羧酶的基因工程菌株以及应用，具体涉及一种以L‑天冬氨酸α‑脱羧酶的基因工程菌株催化合成β‑丙氨酸的方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明通过建立并优化全细胞催化工艺，采用底物分批补加的方式，加入四次底物后，野生型重组菌株转化23h生成β‑丙氨酸约123.81g/L；K221R突变株转化23h可使产物β‑丙氨酸浓度达到134.72g/L；G369A突变株转化23h可使产物β‑丙氨酸浓度达到136.33g/L。此方法使β‑丙氨酸产量得到较大提高，这一发现对于工业化制备β‑丙氨酸具有重要的应用价值。

Description

一种L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株以及应用
技术领域
本发明涉及一种L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株以及应用，具体涉及一种以L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株催化合成β-丙氨酸的方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，其用途广泛：工业上，是合成泛酸钙的重要原料，也是合成肌肽的两种氨基酸之一；医药上，作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮；还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。
在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法，或β-氨基丙腈水解法，这些方法多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化繁琐，存在环境污染问题。因此使用生物催化法替代化学合成法制备β-丙氨酸是发展趋势。
目前生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，在培养微生物过程中合成β-丙氨酸，此法虽然较简便，但是由于微生物代谢过程中会产生大量副产物，对产物的分离纯化带来较大困难，增加了后期纯化成本；另一种方法是生物酶法合成β-丙氨酸，即通过表达天冬氨酸α-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去α-羧基生成β-丙氨酸，其操作简便，污染小。
然而，由于L-天冬氨酸-α-脱羧酶酶活较低的缘故，β-丙氨酸生物的合成产量也较低。Chan WooSong等利用E.coli W3110异源扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶的panD基因，构建从葡萄糖开始的β-丙氨酸合成途径，发酵39hβ-丙氨酸产量达到32.3g/L；范雪萍等构建来源于特基拉芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶重组大肠杆菌菌株，转化10h生成β-丙氨酸66.4g/L。因此，提供一种高产β-丙氨酸的方法，对于工业制备β-丙氨酸具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种以L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株催化合成β-丙氨酸的方法，所述方法是以L-天冬氨酸为底物，以L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌为生物催化剂，采用分批补料的方式进行全细胞催化；所述L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株是以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主，以pET 28a(+)为表达载体，表达赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID1-3任一所示。
在本发明的一种实施方式中，底物每次添加量为0.3-0.5mol/L，每隔3-4h添加一次，共添加4-5次。
在本发明的一种实施方式中，转化体系的反应温度为35-38℃，pH为6.0-7.0。
在本发明的一种实施方式中，将L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌的菌体按OD600为200-220加入至转化体系中。
在本发明的一种实施方式中，L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌的培养方法包括将菌株在LB固体培养基上划线，35-38℃培养10-16h；挑取单菌落接种于LB培养基，35-38℃、200-220r/min振荡培养10-16h；将上述培养物按1％-3％的接种量接种于2xYT培养基，35-38℃、200-220r/min振荡培养至OD600为0.6–0.8，进行诱导表达。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导表达是加入终浓度0.2-0.4mmol/L IPTG，20-25℃培养16–20h，0-4℃下，3500-5000rpm离心收集菌体。
在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
(1)通过全质粒pcr得到核苷酸序列如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因与pET 28a(+)表达载体相连的质粒；赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因、其酶突变体基因K221R、其酶突变体基因G369A的核苷酸序列分别如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
(2)将pcr产物经DpnI消化后，通过热激法转入大肠杆菌JM109中；
(3)挑取转化后的单克隆菌落，35-40℃，200-220rpm摇菌12-16h，提取重组质粒；
(4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21表达。
本发明的第二个目的是提供上述的方法在工业或医药领域中不以疫病的诊断或治疗为目的的应用，所述应用包括合成泛酸钙、肌肽、甜味剂、制备抑制恶性肿瘤骨转移的药物、制备抗结肠炎药物或制备铅中毒的解毒剂。
本发明的有益效果：
本发明构建来源于赤拟谷盗的L-天冬氨酸α-脱羧酶重组菌株，并对其进行定点突变，获得G369A和K221R两个突变体，将突变体重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21中，得到重组突变型大肠杆菌菌株。利用工程菌株进行全细胞催化，采用底物分批补料的催化工艺，加入四次底物后，野生型重组菌株转化23h生成β-丙氨酸约123.81g/L；K221R突变株转化23h可以产物β-丙氨酸浓度达到134.72g/L；G369A突变株转化23h可使产物β-丙氨酸浓度达到136.33g/L。本发明采用分批补料的全细胞催化法，使β-丙氨酸产物浓度较之前研究报道得到提升。这一发现对于工业化制备β-丙氨酸具有重要的应用价值。
附图说明
图1：野生型菌株底物一次性补料合成β-丙氨酸催化工艺；
图2：野生型菌株底物分批补料合成β-丙氨酸催化工艺；
图3：K221R菌株底物分批补料催化工艺；
图4：G369A菌株底物分批补料催化工艺；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行更详细的说明。
(一)培养基
2xYT培养基：蛋白胨16g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl 5g/L。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH 7.4左右。
(二)天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定
反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入750μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层850μL溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。
(三)大肠杆菌感受态热击转化方法
向大肠杆菌感受态细胞中加入10μL PCR产物，充分混匀，将体系放在冰水混合物中静置30-40min，42℃热击90s，在放回冰水混合物中冷却5min，往离心管中加300-400μLLB培养基，37℃，振荡培养40-60min后，3 000rpm离心1min，弃200μL培养液上清，将剩余培养液重悬后，均匀涂布在含卡那抗生素的LB平板，37℃倒置培养12-16h。
实施例1L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌的构建
以如SEQ ID NO.4所示的野生型赤拟谷盗来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因为模板，设计引物：
F49，序列信息如SEQ ID NO 7所示；R49，序列信息如SEQ ID NO 8所示。
F369，序列信息如SEQ ID NO 9所示；R369，序列信息如SEQ ID NO 10所示。
F221，序列信息如SEQ ID NO 11所示；R221，序列信息如SEQ ID NO 12所示。
用全质粒PCR方法得到突变后的基因与表达载体pET 28a(+)相连的质粒，DpnI消化3h左右，采用感受态热激发转入大肠杆菌JM109中，挑选出单克隆菌落，37℃，220rpm摇菌过夜，提取质粒送至测序公司测序，将测序结果正确的质粒转入大肠杆菌BL21中，构建成功的突变型分别命名为K49R，G369A，K221R。
实施例2L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌的培养、诱导、表达
将得到的野生型、突变型天冬氨酸a脱羧酶工程菌接种于5mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡培养过夜。将上述培养物按1％的接种量接种于卡那霉素浓度为50μg/mL的2xYT培养基，37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6–0.8，加入终浓度0.2mmol/L IPTG，20℃培养16–20h，4000rpm下离心收集菌体。
实施例3一次性添加高浓度固体底物的催化工艺
将诱导后的菌株离心收集后，进行全细胞催化反应。在10mL反应体系(包含菌体、pH6.5的磷酸盐缓冲液、底物、PLP)中，细胞OD600为200，pH为6.5，PLP浓度为1mmol/L，反应温度37℃，一次性添加固体底物L-天冬氨酸钠至终浓度为1mol/L。每隔一段时间取样检测β-丙氨酸生成量。结果如图1所示。转化23h生成β-丙氨酸836mmol/L，摩尔转化率83.6％。
实施例4底物分批补料全细胞催化工艺
向体积为10mL，OD600为200的反应体系中每隔4h加入0.4mol/L固体底物。分别加入四次固体底物，检测产物生成量。野生型23h生成β-丙氨酸1389.7mmol/L，约123.81g/L，摩尔转化率为86.9％(图2)。K221R突变株添加四次底物后，转化23h生成生成1512.24mmol/Lβ-丙氨酸，约134.72g/L，摩尔转化率94.52％(图3)。G369A突变株添加四次底物后，转化23h生成1530.27mmol/Lβ-丙氨酸，约136.33g/L，摩尔转化率95.64％(图4)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种以L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以L-天冬氨酸为底物，以产L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株为生物催化剂，采用分批补料的方式进行全细胞催化；所述L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株是以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主，以pET 28a(+)为表达载体，表达赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID 1-3任一所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，底物L-天冬氨酸每次添加量为0.3-0.5mol/L，每隔3-4h添加一次，共添加4-5次。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，转化体系的反应温度为35-38℃，pH为6.0-7.0。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，将L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株的菌体按OD600为200-220加入至转化体系中。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株的培养方法包括将菌株在LB固体培养基上划线，35-38℃培养10-16h；挑取单菌落接种于LB培养基，35-38℃、200-220r/min振荡培养10-16h；将上述培养物按1％-3％的接种量接种于2xYT培养基，35-38℃、200-220r/min振荡培养至OD600为0.6–0.8，进行诱导表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达是加入终浓度0.2-0.4mmol/LIPTG，20-25℃培养16–20h，0-4℃下，3500-5000rpm离心收集菌体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：
(1)通过全质粒pcr得到核苷酸序列如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因与pET 28a(+)表达载体相连的质粒；
(2)将pcr产物经DpnI消化后，通过热激法转入大肠杆菌JM109中；
(3)挑取转化后的单克隆菌落，35-40℃，200-220rpm摇菌12-16h，提取重组质粒；
(4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21表达。
9.权利要求1-8任一所述的方法在工业或医药领域中不以疾病的诊断或治疗为目的的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括合成泛酸钙、肌肽、甜味剂、制备抑制恶性肿瘤骨转移的药物、制备抗结肠炎药物或制备铅中毒的解毒剂。
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