CN115786313A

CN115786313A - 一种腈水解酶突变体及其在合成2-氯烟酸中的应用

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Publication number: CN115786313A
Application number: CN202211293575.8A
Authority: CN
Inventors: 郑仁朝; 孔慧翠; 吴哲明; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在合成2‑氯烟酸中的应用，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID No.2所示腈水解酶氨基酸序列的第146位或194位氨基酸进行单突变或多突变获得的。本发明腈水解酶突变体较野生型活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应酶活仍然保持较高状态。此外，本发明的腈水解酶突变体能够适应30～45℃的催化温度。本发明的腈水解酶突变体较亲本活力提高80多倍，产量提高23.2倍，为工业化酶法合成2‑氯烟酸奠定基础。

Description

一种腈水解酶突变体及其在合成2-氯烟酸中的应用

(一)技术领域

本发明涉及涉及酶工程技术领域，具体涉及一种来源于赤霉菌腈水解酶的改造及其在催化合成2-氯烟酸中的应用。

(二)背景技术

2-氯烟酸是农药和医药化学品的重要合成砌块，应用前景广阔。在农药领域，可用于合成多种杀菌剂、杀虫剂和除草剂，如磺酰脲类除草剂烟嘧磺隆、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺以及三唑硫酮类系列杀菌活性化合物；在医药领域，可用于合成抗生素、心血管疾病治疗药物等，如抗艾滋病药奈韦拉平、抗抑郁药米氮平、消炎药普拉洛芬、抗炎镇痛药尼氟灭酸和烟甲灭酸等。

由于2-氯烟酸在医药和农药领域的广泛应用，其合成方法开发也成为研究热点。瑞士Lonza公司最早于1977年申请了第一个合成专利(US4144238)，以烟酸为原料经氮氧化、氯化和水解合成2-氯烟酸；此后日本有机合成和日本光荣化学等先后致力于其合成研究(JP59144759；JP56169672)。目前，2-氯烟酸合成方法包括以3-氰基吡啶为原料，经氮氧化、氯化、水解合成2-氯烟酸；以2-氯-3-三氟甲基吡啶为原料，经氯化、水解合成2-氯烟酸；以氰基乙酸乙酯为原料，经氯化、麦克尔加成、水解合成2-氯烟酸。然而，上述路线均存在原料制备困难、副产物多、三废排放大等缺陷。因此，构建2-氯烟酸的绿色高效合成工艺具有重要意义。

腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)是合成羧酸的重要工具酶，能水解腈类化合物合成羧酸。腈水解酶介导的生物催化过程具有原子经济性高、环境友好等优势，是替代传统合成方法、实现绿色制造过程的重要途径。如Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶可高区域选择性催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸(ZL201710396386.6；ZL202010127927.7)。拟南芥腈水解酶可高立体、区域选择性催化异丁基丁二腈合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸(US10100297B2；ZL201810765047.5)。

然而，目前发现的腈水解酶催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸普遍存在活力低、反应选择性差等问题。本发明利用蛋白质工程技术对腈水解酶进行分子改造，构建了可高效催化2-氯烟腈合成2-氯烟酸的腈水解酶，对于开发2-氯烟酸绿色合成工艺具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种腈水解酶突变体及其在催化2-氯烟腈合成2-氯烟酸中的应用，通过定点饱和突变技术对赤霉菌(Gibberella intermedia)来源的腈水解酶(Gi-Nit)基因序列进行分子改造，提高其对2-氯烟腈的水解活力，从而有利于该腈水解酶在2-氯烟酸工业制备中的应用，解决现有方法中腈水解酶催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸普遍存在活力低、反应选择性差等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种腈水解酶突变体，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID No.2所示腈水解酶氨基酸序列的第146位或194位氨基酸进行单突变或多突变获得的。

优选的，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸突变为下列之一：(1)第194位的缬氨酸(V)替换为天冬氨酸(D)，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；(2)第194位的缬氨酸(V)替换为亮氨酸(L)，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；(3)第146位的亮氨酸(L)替换为苯丙氨酸(F)，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；(4)第146位的亮氨酸(L)替换为丝氨酸(S)，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；(5)第194位的缬氨酸(V)突变成天冬氨酸(D)的同时将第146位的亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；(6)第194位的缬氨酸(V)突变成天冬氨酸(D)的同时将第146位的亮氨酸(L)突变为丝氨酸(S)，核苷酸序列如SEQ IDNo.13所示，氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

本发明还涉及所述腈水解酶突变体的编码基因，含所述编码基因的重组载体，所述重组载体构建的重组基因工程菌，所述重组载体优选pET28a为基础载体，优选E.coliBL21(DE3)为宿主菌。

本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在催化2-氯烟腈制备2-氯烟酸中的应用，所述的应用以含所述腈水解酶突变体编码基因的工程菌经摇瓶培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以2-氯烟腈为底物，以pH为7.0～7.5(优选pH值为7.2)的缓冲液为反应介质构成转化体系，30～45℃、100～1000r/min条件下(优选30℃、600r/min)进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。所述反应体系中，底物的加入浓度为50～1500mM(优选1200mM)，所述催化剂的用量以菌体细胞干重计为1～5g/L(优选3g/L)。

优选的，所述缓冲液为KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(100mM，pH 7.2)。

优选的，所述底物分批加入，所述底物的初始加入浓度为50～300mM(优选200mM)，每隔0.5～2h(优选1.5h)补料50～300mM(优选300mM)，至总加入量为50～1500mM。所述反应时间为5～20h(优选15h)。

优选的，所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的工程菌接种到含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、180r/min培养12h，随后以体积浓度2％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、180r/min培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG(优选0.1mM)，28℃、180r/min诱导培养12h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。LB液体培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，溶剂为水，pH值为7.0；LB平板培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂20，溶剂为水，pH值为7.0。

本发明所述的腈水解酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，还可以是经部分纯化或完全纯化的酶蛋白形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的腈水解酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式进行使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明腈水解酶突变体较野生型活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应酶活仍然保持较高状态。此外，本发明的腈水解酶突变体能够适应30～45℃的催化温度。本发明的腈水解酶突变体较亲本活力提高80多倍，产量提高23.2倍，为工业化酶法合成2-氯烟酸奠定基础。

(四)附图说明

图1、突变体L146F/V194D全细胞催化2-氯烟腈制备2-氯烟酸的补料反应进程。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB液体培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，溶剂为水，pH值为7.0。

LB平板培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂20，溶剂为水，pH值为7.0。

实施例1、野生型腈水解酶的表达

野生型腈水解酶基因工程菌的构建：将来源于赤霉菌(Gibberella intermedia)的腈水解酶基因(Gi-Nit，Genbank:JN236216)进行人工合成，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将腈水解酶基因连接至pET-28a质粒的NcoI和HindIII位点之间，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，获得野生型腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-Gi-Nit。

SEQ ID No.1

ATGAGCAAAACGCTGAAAGTTGCGGCGATTCAGGCGGAACCGGTGTGGAACGACCTGCAGGGCGGGGTGAACAAAAGCATTGGGCTGATTCAGGAAGCAGCGAAAAATGGGGCAAATGTGATTGGATTTCCGGAGGTTTTTATTCCGGGTTATCCGTGGAGCATTTGGGCAAACAGCCCTACAGAAAATGCACCGTGGGTTAATGAATATTTTAAAAATAGCCTGGAGCGTGAAAGTCCGGAAATGGATCAGATTCGTGCGGCAGTTCGTGAAGCGGGAGTTTTTGTTGTGCTGGGTTATAGTGAACGTTATCGTGGTACCCTGTATATTGCACAGAGCTTTATTGATGAGACAGGTACGATTGTTCTGCATCGTCGTAAAATTAAACCGACCCATGTTGAGCGTGCAATTTATGGTGATGGACAAGGTGAAAGCCTGACCAACGTTGCAGACACCAAATTTGGCCGCGTTGCTGGTCTGAACTGTTGGGAACATACCCAAACACTGCTGCGTTATTATGAATATAGCCAGGATGTTGATATCCATGTGTCATCCTGGCCGAGTATTTTTCCGCAGAATGTTCCTGAATGGCCGTATCATATTACCCCTGAATGCTGTAAAGCATTTTCTCACGTTGTTTCTATGGAAGGTGCATGTTTTGTTCTGCTGGCAAGCCAAATTATGACGGAAGAAAACCATAAAAAGGCGAATGTTGAAGGTTATGATTATACGAAAAAGAGTGGTGGTGGTTTTAGTATGATTTTTTCTCCGTTTGGTGAGGAACTGGTTAAACCGCTGGCCCCGAATGAAGAAGGTATCCTGTATGCCGATATTAATCTGGAGGAGAAATATAAAGCGAAACAGAATCTGGATATCGTGGGTCATTATAGCCGTCCGGATCAACTGAGCCTGCGTGTTAACAAACATGCAGCAAAACCGGTGTTTTTTGCAAACGATCTG。

SEQ ID No.2

MSKTLKVAAIQAEPVWNDLQGGVNKSIGLIQEAAKNGANVIGFPEVFIPGYPWSIWANSPTENAPWVNEYFKNSLERESPEMDQIRAAVREAGVFVVLGYSERYRGTLYIAQSFIDETGTIVLHRRKIKPTHVERAIYGDGQGESLTNVADTKFGRVAGLNCWEHTQTLLRYYEYSQDVDIHVSSWPSIFPQNVPEWPYHITPECCKAFSHVVSMEGACFVLLASQIMTEENHKKANVEGYDYTKKSGGGFSMIFSPFGEELVKPLAPNEEGILYADINLEEKYKAKQNLDIVGHYSRPDQLSLRVNKHAAKPVFFANDL。

野生型腈水解酶基因工程菌的表达：从-80℃冰箱保藏的甘油管中，取10μL野生型腈水解酶基因工程菌的菌液接种至10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养过夜，以体积浓度2％接种量转接至100mL新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.4～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃下诱导培养12h。培养结束后，4℃下8000rpm离心10min，收集菌体，用0.9％的生理盐水洗涤2次，得到野生型腈水解酶基因工程菌细胞。

实施例2、腈水解酶的饱和突变与筛选

1、饱和突变

通过同源建模和分子对接，筛选获得对腈水解酶活力有影响的关键氨基酸位点V194。对实施例1野生型腈水解酶氨基酸序列中的第194位点的氨基酸进行饱和突变，设计引物V194(见表1)，以野生型腈水解酶Gi-Nit基因(核苷酸序列SEQ ID No.1)的pET28a-Gi-Nit质粒为模板，进行全质粒扩增。

PCR体系为：2×phanta Max buffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，如表1所示的突变引物10μM各1μL，质粒pET28a-Gi-Nit 1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，ddH₂O补至50μL。

PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸6.5min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。用0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，取PCR产物20μL，加入1μL的DpnⅠ，37℃酶切3h去除模板质粒DNA，于65℃下灭活10min。

2、腈水解酶突变体的转化

取感受态细胞E.coli BL21(DE3)，加入10μL步骤1中的PCR产物，冰上静置30min，在42℃热激90s，加入600μL不含卡那霉素的LB液体培养基，37℃下以180r/min转速培养1h，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。

3、菌体培养及高通量筛选

挑取步骤2的单菌落至96深孔板中，每孔加入1mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养12h，取200μL菌液转接到800μL新鲜含终浓度50μg/mL卡那霉素和0.1mMIPTG的LB液体培养基，28℃培养18h。将96深孔板的菌体离心30min(4000rpm，4℃)，弃去上清后，用200μL KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(100mM，pH 7.0)洗涤并重悬菌体。各孔中加入200μLKH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液溶解的20mM底物2-氯烟腈，30℃反应30min。反应结束后加入10μL 6MHCl终止反应，将96深孔板的反应液离心15min(4000rpm，4℃)，取30μL上清液转移至每个孔中含有150μL邻苯二甲醛与巯基乙醇混合液(邻苯二甲醛0.3g，巯基乙醇150μL，无水乙醇20mL)的96孔微量反应板中，放置于37℃保温30min。随后利用酶标仪(激发波长412nm，发射波长467nm)测定荧光强度。选取荧光强度提高的突变体作为阳性菌，进行后续的液相色谱复筛验证及测序分析。

表1、194位点定点饱和突变引物设计表

注：N＝A/G/C/T，K＝G/T，M＝A/C

实施例3、腈水解酶阳性突变体的复筛

如实施例2所得阳性菌按实施例1培养条件培养，获得突变体全细胞。称取湿菌体加入100mM的PBS(pH 7.2)缓冲液打匀，制成湿细胞浓度为20g/L的菌悬液。

突变体活力测定的反应体系为：总体系10mL，湿细胞添加量为0.1g/L，100mM PBS(pH 7.2)，20mM 2-氯烟腈。在30℃，180r/min振荡，反应10min后取1mL加入10μL 6M盐酸终止反应，离心后使用液相色谱检测底物2-氯烟腈和产物2-氯烟酸含量。

液相色谱检测条件：色谱柱为C18柱，以乙腈：水：磷酸＝250：750：1(v/v/v)为流动相，流速1mL/min，检测波长270nm；底物2-氯烟腈出峰时间8.75min，产物2-氯烟酸出峰时间3.75min。

酶活单位(U)定义：在30℃、pH 7.2条件下，每分钟催化2-氯烟腈生成1μmol的2-氯烟酸所需的细胞量作为一个活力单位(U)。取全细胞酶活高于野生型的突变体提取质粒进行测序。

活力提高的阳性克隆DNA测序显示其第194位的缬氨酸替换为天冬氨酸或亮氨酸，获得腈水解酶突变体工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-V194D、E.coli BL21(DE3)/pET28-V194L，突变体活力见表2。

表2、阳性突变体的全细胞酶活

实施例4、迭代突变文库的构建及活力测定

将实施例3的最优单突变体V194D进行迭代突变，设计引物(见表3)，以腈水解酶突变体的质粒pET28-V194D为模板，按实施例2中步骤1进行全质粒扩增后转化。挑取单菌落于装有10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的试管中进行培养，测序并保藏。取迭代突变的重组菌按实施例1步骤1所述培养方式培养，按实施例3所述方式进行全细胞酶活的测定。各个突变体的全细胞酶活和序列见表4，其中双突变体L146F/V194D细胞活力最高，达236U/g(湿细胞)为出发菌株81倍。

表3、迭代突变的引物

注：N＝A/G/C/T，K＝G/T，M＝A/C

表4、迭代突变体的全细胞酶活

实施例5、野生型腈水解酶Gi-Nit全细胞催化2-氯烟腈的反应进程(一)

转化体系组成及转化操作如下：20mL的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(100mM，pH7.2)中，分别加入实施例1中获得的野生型重组腈水解酶Gi-Nit全细胞，菌体添加量为4.6g/L(干重)，底物2-氯烟腈浓度为150mM，于30℃，600rpm反应15h。利用HPLC检测反应进程，HPLC检测条件如实施例3所示。结果表明，反应到15h时，2-氯烟酸浓度为5g/L。

实施例6、腈水解酶突变体L146F/V194D全细胞催化2-氯烟腈的反应进程(一)

转化体系组成及转化操作如下：20mL的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(100mM，pH 7.2)中，分别加入实施例4中获得的重组腈水解酶突变体L146F/V194D，菌体添加量为2.3g/L(干重)，底物的初始浓度为300mM，每隔0.5-1小时补料300mM至投料总量为1200mM，于30℃，600rpm反应15h。利用HPLC检测反应进程，HPLC检测条件如实施例3所示。结果表明，反应到15h时，2-氯烟酸浓度可达71g/L(图1)。

实施例7、腈水解酶突变体L146F/V194D全细胞催化2-氯烟腈的反应进程(二)

转化体系组成及转化操作如下：20mL的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(100mM，pH7.2)中，分别加入实施例4中获得的重组腈水解酶突变体L146F/V194D，菌体添加量为3g/L(干重)，底物的初始浓度为300mM，每隔0.5-1小时补料300mM至投料总量为1200mM，于30℃，600rpm反应15h。利用HPLC检测反应进程，HPLC检测条件如实施例3所示。结果表明，反应到15h时，2-氯烟酸浓度可达116g/L(图1)。

Claims

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID No.2所示腈水解酶氨基酸序列的第146位或194位氨基酸进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体是将SEQIDNo.2所示氨基酸突变为下列之一：(1)第194位的缬氨酸替换为天冬氨酸；(2)第194位的缬氨酸替换为亮氨酸；(3)第146位的亮氨酸替换为苯丙氨酸；(4)第146位的亮氨酸替换为丝氨酸；(5)第194位的缬氨酸突变成天冬氨酸的同时将第146位的亮氨酸突变为苯丙氨酸；(6)第194位的缬氨酸突变成天冬氨酸的同时将第146位的亮氨酸突变为丝氨酸。

3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。

4.一种含权利要求1所述编码基因的重组载体。

5.一种权利要求4所述重组载体构建的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化2-氯烟腈制备2-氯烟酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用以含所述腈水解酶突变体编码基因的工程菌经摇瓶培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以2-氯烟腈为底物，以pH为7.0～7.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，30～45℃、100～1000r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，底物的加入浓度为50～1500mM，所述催化剂的用量以菌体细胞干重计为1～5g/L。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述底物分批加入，所述底物的初始加入浓度为50～300mM，每隔0.5～2h补料50～300mM，至总加入量为50～1500mM。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的工程菌接种到含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、180r/min培养12h，随后以体积浓度2％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、180r/min培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，28℃、180r/min诱导培养12h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。