CN116254304A - 一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体 - Google Patents

一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN116254304A
CN116254304A CN202211100878.3A CN202211100878A CN116254304A CN 116254304 A CN116254304 A CN 116254304A CN 202211100878 A CN202211100878 A CN 202211100878A CN 116254304 A CN116254304 A CN 116254304A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pgnit
nitrilase
chloronicotinonitrile
mutant
wet
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211100878.3A
Other languages
English (en)
Inventor
郑仁朝
汤晓玲
金金
李雨怡
郑裕国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN202211100878.3A priority Critical patent/CN116254304A/zh
Publication of CN116254304A publication Critical patent/CN116254304A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/05—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in nitriles (3.5.5)
    • C12Y305/05001—Nitrilase (3.5.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/584—Recycling of catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种腈水解酶在选择性催化6‑氯烟腈合成6‑氯烟酸中的应用及突变体，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸获得的。在最优体系下，腈水解酶对6‑氯烟腈的水解活力达450U/g(WCW)，可催化300g/L 6‑氯烟腈合成6‑氯烟酸，产率为达92％，同时催化合成2‑氯烟酰胺浓度最高达4.8g/L；以腈水解酶突变体催化6‑氯烟腈时，活力达580U/g(WCW)，可催化300g/L 6‑氯烟腈合成6‑氯烟酸，产率达99％，同时对2‑氯烟腈的水合活力消除，无2‑氯烟酰胺产生。

Description

一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用 及突变体
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于伯克霍尔德氏杆菌(Paraburkholderia graminis)的腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用以及突变体和应用。
(二)背景技术
氯代烟酸衍生物是重要的医药和农药产物中间体，它独特的吡啶环结构使其成为目前咋环化合物中开发应用范围最广的品种之一。6-氯烟酸是一种重要的化工中间体，也是他扎罗丁等药物的关键中间体，并可用于新性农药产品的合成领域，市场需求逐年增加。6-氯烟酸的绿色、高效合成越来越受到关注，同时对其合成纯度要求也非常高。目前报道的6-氯烟酸合成方法主要为化学法，以氯苯为溶剂，以2-氯-5-甲基吡啶为起始原料，在醋酸钴的催化下，直接氧化制备6-氯烟酸粗品，并通过进一步的重结晶工艺获得6-氯烟酸成品。但是化学合成方法环境污染严重、过程冗长、收率低，越来越不符合先进工业的要求，并且在合成过程中伴随着2-氯烟酸的产生，要获得高纯度目标产物，后处理工艺复杂。
腈水解酶作为生物催化领域的重要工业酶，具有反应条件温和，环境友好，催化效率高等优点，在羧酸化合物合成中展现出日益巨大的应用潜力和重要价值。以烟腈氯代衍生物为底物，腈水解酶可以一步催化水解生成相应的烟酸氯代衍生物。在此过程中，腈水解酶的活性、底物选择性等催化性能是影响目标产物高效、高纯度合成的关键，挖掘对6-氯烟腈具有高活力和高选择性的腈水解酶对建立6-氯烟酸工业化酶法合成路线具有重要意义。
(三)发明内容
本发明提供一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体和应用，本发明来源于伯克霍尔德氏杆菌(Paraburkholderia graminis)的腈水解酶PgNit，除了具有催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸的水解活力外，亦具有催化2-氯烟腈合成2-氯烟酰胺的腈水合活力。基于此，对该酶进行了改造，获得了突变体PgNit-A55S，消除了对2-氯烟腈的水合活力，解决了传统腈水解酶催化氯代底物和反应选择性差的问题。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种伯克霍尔德氏杆菌(P.graminis)来源的腈水解酶PgNit在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用，所述腈水解酶PgNit的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
优选，所述的应用为：以含SEQ ID NO.1所示腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和2-氯烟腈为底物，以pH 6.0-9.0的缓冲液为反应介质，在25-40℃条件下进行反应，获得含6-氯烟酸和2-氯烟酰胺的反应液。所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2-20g/L，优选10g/L；所述6-氯烟腈和2-氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100-500g/L，各自均优选为300g/L。
优选的，所述缓冲液优选50mM、pH 7.0的PB缓冲液。优选所述反应温度为30℃。
优选的，所述腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液按如下方法制备：1)平板培养：将含腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基，经37℃过夜活化，获得单菌落；所述LB固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH 7.0；
2)种子培养：将单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180rpm培养10-12h，获得种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0；
3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的量接种至含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，180rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于28℃，180rpm条件下诱导培养10-12h，菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体；
4)湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于pH5.0～9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10-50kHz频率下(优选20kHz)破碎5-30min(优选破碎2min，间隔10s，破碎10min)，收集破碎混合液，即获得粗酶液；所述pH5.0～9.0的缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为10mL/g。
第二方面，为了进一步提升腈水解酶PgNit对6-氯烟腈的水解活力，同时完全消除对2-氯烟腈的水合活力，本发明筛选获得腈水解酶突变体PgNit-A55S，所述腈水解酶突变体PgNit-A55S是将SEQ ID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸获得的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
任何对SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或者替换一个或几个氨基酸且具有催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸活力的，仍属于本发明的保护范围。
本发明还提供了腈水解酶突变体PgNit-A55S编码基因，重组载体以及重组基因工程菌。
本发明可通过本领域常规方法将本发明的腈水解酶PgNit及其突变体PgNit-A55S的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28b(+)。
引入编码本发明腈水解酶PgNit及其突变体PgNit-A55S的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的腈水解酶基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选E.coli BL21(DE3)。
本发明选择pET28b(+)作为表达载体用于腈水解酶PgNit及其突变体PgNit-A55S的表达，具体地，将目的基因插入在质粒pET28b(+)上的NcoI和XhoI之间，转化于E.coliBL21(DE3)宿主细胞中。
第三方面，本发明提供一种腈水解酶突变体PgNit-A55S在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用，所述的应用为：以含SEQ ID NO.3所示腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和2-氯烟腈为底物，以pH 6.0-9.0的缓冲液为反应介质，在25-40℃条件下进行反应，获得含6-氯烟酸的反应液。所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2-20g/L，优选10g/L；所述6-氯烟腈和2-氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100-500g/L，各自均优选为300g/L。所述缓冲液优选50mM、pH 7.0的PB缓冲液。优选所述反应温度为30℃。
所述含腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液按如下方法制备：
1)平板培养：将含腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基，经37℃过夜活化，获得单菌落；所述LB固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH7.0；
2)种子培养：将单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180rpm培养10-12h，获得种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0；
3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的量接种至含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，180rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于28℃，180rpm条件下诱导培养10-12h，菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体；
4)湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于pH5.0～9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10-50kHz频率下(优选20kHz)破碎5-30min(优选破碎2min，间隔10s，破碎10min)，收集破碎混合液，即获得粗酶液；所述pH5.0～9.0的缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为10mL/g。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)本发明以含腈水解酶PgNit基因的重组细胞或其破碎粗酶液为催化剂，选择性催化6-氯烟腈，在最优体系下，本发明所提供的腈水解酶PgNit对6-氯烟腈的水解活力达450U/g(WCW)，可催化300g/L 6-氯烟腈合成6-氯烟酸，产率为达92％，同时表现出对2-氯烟腈的水合活力，催化合成2-氯烟酰胺浓度最高达4.8g/L；(2)本发明以含腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组细胞或其破碎粗酶液为催化剂，选择性催化6-氯烟腈，一步合成高纯度6-氯烟酸，过程简单，工业成本较低。与野生型相比，突变体完全消除了对2-氯烟腈的催化活力，过程中无2-氯烟酰胺产生。在最优体系下，本发明以腈水解酶突变体PgNit-A55S催化6-氯烟腈时，活力达580U/g(WCW)，可催化300g/L 6-氯烟腈合成6-氯烟酸，产率达99％，同时对2-氯烟腈的水合活力消除，无2-氯烟酰胺产生。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述LB固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH 7.0。
所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0。
所述PB缓冲液(50mM、pH 7.0)的配制方法为：称取K2HPO4·H2O 2.28g，加入200mL超纯水使其完全溶解；然后称取KH2PO4·H2O 1.36g于200mL超纯水，将两者相互混合，将缓冲液pH调节至7.0。
实施例1、PgNit重组菌的构建
将来源于伯克霍尔德氏杆菌(Paraburkholderia graminis)的腈水解酶(PgNit)基因(ACCESSION NO:QCT24552.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)在北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成，连接于质粒pET-28b的NcoI和XhoI酶切位点，转入E.coli DH5感受态细胞，涂布含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜后，挑取阳性转化子并测序鉴定。将所验证的阳性单克隆接种至5mL含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，提取质粒进行验证后，将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-PgNit，于37℃在含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上培养过夜。挑取单克隆接种至5mL含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，菌液和30％甘油(v/v＝1:1)混合于甘油管内，-80℃冰箱保存。
SEQ ID NO.1：
atgggtaaagttgtcaaagccgctgctgttcaattttctccagttctgtacagccgcgaagcaaccgtagcaaaagtcgtacagaagatccacgaactgggtctgaaaggcgtgcaattcgctaccttcccggaaaccgttgtcccgtactacccgtatttcgctgcagttcagactggtatcgagctgctgagcggttccgaacacctgcgtctgctggagcaggcggttactgttcctagcgcggctacggatgcaatcggtaaagctgctcgtgaagcaggtatggttgtatctatcggcgtgaacgagcgcgacggtggcacgctgtacaacacccaactgctgtttgatgccgatggcacgctgattcagcgtcgccgtaaaatcaccccaactcacttcgaacgtatgatttggggtcagggtgatggttctggtctgcgtgcggttgattccgccgtgggccgcattggtcagctggcgtgtttcgaacataacaacccactggcccgttacgcgatgatcgctgatggcgaacaaatccattctgcgatgtatccgggcagcgcttttggcgaaggttttgcgcagcgtatggaaatcaacattcgtcagcacgcactggaatccggcgcgttcgtagtcaacgcaaccgcatggctggatgcggatcagcaggcacaaattatgaaagacaccggctgcggcattggtccaattagcggtggttgtttcaccaccattgtttccccggacggtatgctgatggctgaaccgctgcgctctggtgagggcgaggtcatcgttgacctggactttgcacagatcgatcgtcgtaaaatgctgatggacgctgccggtcattacaaccgtccggaactgctgtctctgatgatcgatcgtacccctaccgcgcatgtacatgaacgtgcgccgcactccctgccggtaagcgacaaagcggacgacgacgtgcgcacccaagcggctgcagtcgcgggttcccgcctcgagatt
SEQ ID NO.2：
MGKVVKAAAVQFSPVLYSREATVAKVVQKIHELGLKGVQFATFPETVVPYYPYFAAVQTGIELLSGSEHLRLLEQAVTVPSAATDAIGKAAREAGMVVSIGVNERDGGTLYNTQLLFDADGTLIQRRRKITPTHFERMIWGQGDGSGLRAVDSAVGRIGQLACFEHNNPLARYAMIADGEQIHSAMYPGSAFGEGFAQRMEINIRQHALESGAFVVNATAWLDADQQAQIMKDTGCGIGPISGGCFTTIVSPDGMLMAEPLRSGEGEVIVDLDFAQIDRRKMLMDAAGHYNRPELLSLMIDRTPTAHVHERAPHSLPVSDKADDDVRTQAAAVAGSRLEI.
实施例2、PgNit突变体的获得及含突变体基因工程菌的构建
1、突变文库的构建
以实施例1获得的重组表达载体pET28b-PgNit为模板，通过易错PCR扩增，获得扩增序列。
扩增引物为(5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’)和(5’TGCTAGTTATTGCTCAGCG 3’)。
扩增体系为：50μL反应体系：10x Taq polymerase buffer：5μL；Mg2+(25mM)：2-8μl；Mm2+(25mM):2-8μL；dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM；浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，DNA模板：1μL；Taq DNA聚合酶：10U；用双蒸水补足体系。
PCR反应条件为：预变性95℃1min，然后进入温度循环95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。获得的易错PCR产物用clean-up试剂盒纯化。
以上述随机突变获得的基因片段作为引物，pET28b-PgNit质粒作为模板，使用高保真DNA聚合酶进行PCR反应，最终获得线性的全质粒PCR产物。全质粒PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测为阳性后，使用限制性核酸内切酶DpnⅠ去甲基化，再用clean-up试剂盒提纯，转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得重组细胞。
2、突变体的筛选
(1)用灭菌牙签挑选上述突变文库中的单克隆子，接种于加有600μL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的96深孔板中，在37℃，180rpm条件下培养20-22h后作为种子液。随后取出200μL种子液转接至新的96深孔板中，于37℃，180rpm培养2-3h，使OD600达到0.6-0.8，向每孔加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃，180rpm培养12h。随后将96孔板于4℃，4000rpm离心15min，弃上清，保留菌体备用。
(2)在步骤(1)96孔板中每孔加入200μL的PB缓冲液(50mM，pH 7.0)重悬腈水解酶菌体，加入终浓度为50mM的6-氯烟腈，于30℃，180rpm反应5min，加入15μL 6M HCl终止反应，随后，4℃，4000rpm离心15min。
另一块96孔板中加入200μL的PB缓冲液(50mM，pH 7.0)重悬腈水解酶菌体，0.5g/L酰胺酶(可以不同来源，只要对2-氯烟酰胺有活力)，终浓度为50mM的2-氯烟腈，于30℃，180rpm反应5min，加入15μL 6M HCl终止反应，随后，4℃，4000rpm离心15min。
(3)取20μL离心后的上清至黑色荧光酶标板中，每孔中加入荧光显色液(0.1g邻苯二甲醇,50μL巯基乙醇和20mL无水乙醇混合后稀释十倍制备获得)，37℃反应30min，通过酶标仪测定荧光强度(412nm激发波长，467nm发射波长)。根据荧光强度变化筛选阳性突变体。
3、突变体的复筛验证
通过上述高通量筛选获得的阳性突变体进一步进行复筛验证。取96孔板中对应的阳性菌株的种子液100μL加入到100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃，180rpm条件下诱导培养10-12h。收获的菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体备用。
称取0.1g菌体(湿重)重悬于10mL的PB缓冲液(50mM，pH 7.0)，在30℃保温5min，加入50mM 6-氯烟腈和50mM 2-氯烟腈，于180rpm，30℃下反应5-10min。取样1ml反应液，加入10μL 6M HCl终止反应，随后静置1min并在12000rpm离心2min。收集上清液，适当稀释后，样品用于高效液相色谱(HPLC)分析。具体色谱设备及分析条件如下：色谱柱类型为WelchromC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；色谱柱工作温度设为30℃，紫外检测波长为210nm，流动相为25％乙腈和75％水(含有0.1％的H3PO4)，流速1.0mL/min。
酶活定义：30℃，pH 7.0条件下，每分钟生成1μmol 6-氯烟酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。
通过以上验证，获得了PgNit-A55S突变体(记为PgNitM)，其序列为野生型序列SEQID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
野生型PgNit对6-氯烟腈的水解活力为450U/g(WCW)，对2-氯烟腈的水合活力为12U/g(WCW)；突变体A55S对6-氯烟腈的水解活力为580U/g(WCW)，对2-氯烟腈的水合活力消除。
SEQ ID NO.3：
atgggtaaagttgtcaaagccgctgctgttcaattttctccagttctgtacagccgcgaagcaaccgtagcaaaagtcgtacagaagatccacgaactgggtctgaaaggcgtgcaattcgctaccttcccggaaaccgttgtcccgtactacccgtatttctctgcagttcagactggtatcgagctgctgagcggttccgaacacctgcgtctgctggagcaggcggttactgttcctagcgcggctacggatgcaatcggtaaagctgctcgtgaagcaggtatggttgtatctatcggcgtgaacgagcgcgacggtggcacgctgtacaacacccaactgctgtttgatgccgatggcacgctgattcagcgtcgccgtaaaatcaccccaactcacttcgaacgtatgatttggggtcagggtgatggttctggtctgcgtgcggttgattccgccgtgggccgcattggtcagctggcgtgtttcgaacataacaacccactggcccgttacgcgatgatcgctgatggcgaacaaatccattctgcgatgtatccgggcagcgcttttggcgaaggttttgcgcagcgtatggaaatcaacattcgtcagcacgcactggaatccggcgcgttcgtagtcaacgcaaccgcatggctggatgcggatcagcaggcacaaattatgaaagacaccggctgcggcattggtccaattagcggtggttgtttcaccaccattgtttccccggacggtatgctgatggctgaaccgctgcgctctggtgagggcgaggtcatcgttgacctggactttgcacagatcgatcgtcgtaaaatgctgatggacgctgccggtcattacaaccgtccggaactgctgtctctgatgatcgatcgtacccctaccgcgcatgtacatgaacgtgcgccgcactccctgccggtaagcgacaaagcggacgacgacgtgcgcacccaagcggctgcagtcgcgggttcccgcctcgagatt
SEQ ID NO.4：
MGKVVKAAAVQFSPVLYSREATVAKVVQKIHELGLKGVQFATFPETVVPYYPYFSAVQTGIELLSGSEHLRLLEQAVTVPSAATDAIGKAAREAGMVVSIGVNERDGGTLYNTQLLFDADGTLIQRRRKITPTHFERMIWGQGDGSGLRAVDSAVGRIGQLACFEHNNPLARYAMIADGEQIHSAMYPGSAFGEGFAQRMEINIRQHALESGAFVVNATAWLDADQQAQIMKDTGCGIGPISGGCFTTIVSPDGMLMAEPLRSGEGEVIVDLDFAQIDRRKMLMDAAGHYNRPELLSLMIDRTPTAHVHERAPHSLPVSDKADDDVRTQAAAVAGSRLEI.
实施例3、PgNit及其突变体PgNit-A55S催化剂的制备
1)平板培养：分别将含腈水解酶PgNit的重组基因工程菌和含突变体PgNitM的重组基因工程菌经平板划线接种至含50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基，经37℃过夜活化，获得单菌落。
2)种子培养：将单菌落接种至装有5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，于37℃，180rpm培养10-12h，获得种子液。
3)发酵培养：向装有100mL液体LB培养基的摇瓶中加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，并接入2％(v/v)的种子液，于37℃，180rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃，180rpm条件下诱导培养10-12h。收获的菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体，分别获得PgNit湿菌体和PgNitM湿菌体，备用。
实施例4、PgNit及其突变体PgNitM催化氯代烟腈底物的反应进程
1、在20mL PB缓冲液(pH 7.0、50mM)中，分别加入实施例3方法制备的PgNit湿菌体和PgNitM湿菌体各10g/L，以100g/L 2-氯烟腈和100g/L 6-氯烟腈的混合物为底物，在30℃的条件下反应，采用实施例2所述高效液相色谱法进行检测。结果表明，反应1h后，PgNit和PgNitM湿菌体均可催化100g/L 6-氯烟腈，产率达99％以上。但PgNit在催化的过程中产生4.8g/L 2-氯烟酰胺，而PgNitM突变体催化过程中无2-氯烟酰胺产生。
2、在20mL PB缓冲液(pH 7.0、50mM)中，分别加入实施例3方法制备的PgNit湿菌体和PgNitM湿菌体各10g/L，以200g/L 2-氯烟腈和200g/L 6-氯烟腈的混合物为底物，在30℃条件下反应。采用实施例2所述高效液相色谱法进行检测。结果表明，发应2h后，PgNit催化200g/L 6-氯烟腈合成6-氯烟酸产率达96％，催化过程中产生4.2g/L 2-氯烟酰胺。PgNitM催化200g/L 6-氯烟腈合成6-氯烟酸产率达99％，催化过程中无2-氯烟酰胺产生。
3、在20mL PB缓冲液(pH 7.0、50mM)中，分别加入实施例3方法制备的PgNit湿菌体和PgNitM湿菌体各10g/L，以300g/L 2-氯烟腈和300g/L 6-氯烟腈的混合物为底物，L，在30℃条件下反应。采用实施例2所述高效液相色谱法进行检测。结果表明，发应4h后，PgNit催化300g/L 6-氯烟腈合成6-氯烟酸产率达92％，催化过程中产生3.9g/L 2-氯烟酰胺。PgNitM催化200g/L 6-氯烟腈合成6-氯烟酸产率达99％，催化过程中无2-氯烟酰胺产生。
本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种源自伯克霍尔德氏杆菌(P.graminis)的腈水解酶PgNit在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用，其特征在于，所述腈水解酶PgNit氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和2-氯烟腈为底物，以pH 6.0-9.0的缓冲液为反应介质，在25-40℃条件下进行反应，获得含6-氯烟酸和2-氯烟酰胺的反应液。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2-20g/L；所述6-氯烟腈和2-氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100-500g/L。
4.一种用于权利要求1所述选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸的腈水解酶突变体PgNit-A55S，其特征在于，所述腈水解酶突变体PgNit-A55S是将SEQ ID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸获得的。
5.一种含权利要求4所述腈水解酶突变体PgNit-A55S的编码基因的重组基因工程菌。
6.如权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是将目的基因插入质粒pET28b(+)上的NcoI和XhoI之间，转化于E.coli BL21(DE3)宿主细胞中获得的。
7.一种权利要求4所述腈水解酶突变体PgNit-A55S在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和2-氯烟腈为底物，以pH 6.0-9.0的缓冲液为反应介质，在25-40℃条件下进行反应，获得含6-氯烟酸的反应液。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2-20g/L；所述6-氯烟腈和2-氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100-500g/L。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液按如下方法制备：
1)平板培养：将含腈水解酶突变体PgNit-A55S基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基，经37℃过夜活化，获得单菌落；所述LB固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH 7.0；
2)种子培养：将单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180rpm培养10-12h，获得种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0；
3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的量接种至含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，180rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，于28℃，180rpm条件下诱导培养10-12h，菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体；
4)湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于pH5.0～9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10-50kHz频率下破碎5-30min，收集破碎混合液，即获得粗酶液。
CN202211100878.3A 2022-09-09 2022-09-09 一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体 Pending CN116254304A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211100878.3A CN116254304A (zh) 2022-09-09 2022-09-09 一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211100878.3A CN116254304A (zh) 2022-09-09 2022-09-09 一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116254304A true CN116254304A (zh) 2023-06-13

Family

ID=86678107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211100878.3A Pending CN116254304A (zh) 2022-09-09 2022-09-09 一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116254304A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10865404B1 (en) Aspartase mutant, recombinant expression vector and recombinant bacterium containing aspartase mutant, and use thereof
WO2022073331A1 (zh) 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN113528476B (zh) 一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达
CN111154746B (zh) 酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN114958693A (zh) 一株枯草芽孢杆菌、一种重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN112409493B (zh) 一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN116254304A (zh) 一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体
CN107937376B (zh) 一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用
CN112375725B (zh) 一种生产维生素b6的代谢工程菌株及其构建方法与应用
CN110923223B (zh) 一种新型腈水解酶及其应用
CN104130998B (zh) 定点突变获得的恶臭假单胞菌腈水解酶突变株及其构建方法
CN114196658B (zh) 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN118325755B (zh) 一种生产s-羟丙基四氢吡喃三醇的工程菌及其构建方法
CN115537406B (zh) 一种酮还原酶及其在制备(s)-1-(4-吡啶基)-1,3-丙二醇中的应用
CN115851632B (zh) 一种漆酶突变体及其应用
CN108866017B (zh) 一种酶法制备β-羟基-β-甲基丁酸的方法
CN111575258B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN115029329B (zh) 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用
CN114807080B (zh) 一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用
CN114574505B (zh) 单加氧酶基因phzO、编码的蛋白质、基因工程菌株及其构建方法和应用
CN115161299B (zh) 一种158位突变的醛酮还原酶突变体及其应用
CN117603950A (zh) 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN114806899B (zh) 一种生产l-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用
CN115786313A (zh) 一种腈水解酶突变体及其在合成2-氯烟酸中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination