CN114807080B

CN114807080B - 一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用

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Publication number: CN114807080B
Application number: CN202210528135.XA
Authority: CN
Inventors: 瞿旭东; 林芝; 胡致伟
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2022-05-16
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114807080A

Abstract

本发明公开了一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用，涉及小分子羧酸化合物甲酯化、生物工程和酶催化领域，其氨基酸序列为如序列表SEQIDNO:1～SEQIDNO:7中任一所示；该甲基转移酶的表达载体，包含编码甲基转移酶的核酸序列，表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；包含该表达载体的工程菌；将甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物的应用；该工程菌在转化羧酸化合物生成甲酯化产物的应用。本发明提供了一种小分子羧酸甲酯化工艺，该工艺绿色高效，价格低廉，适用性宽泛，能够实现多种小分子羧酸的甲酯化，具有极大的应用潜力及经济价值。

Description

一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用

技术领域

本发明涉及小分子羧酸化合物甲酯化、生物工程和酶催化领域，具体涉及一种羧基甲基转移酶、表达载体和工程菌及其应用。

背景技术

小分子羧酸化合物甲酯化是一种重要的反应类型，在医药、化工、能源等领域都有重要的应用。常见的工业化羧酸甲酯化的化学合成工艺主要分为两类：一类为以较惰性的甲醇作为甲酯化试剂，该合成过程往往需要以酸、碱或无机盐等作为催化剂，通常面临设备易被腐蚀，催化剂难以回/收，反应时间长，甲醇用量大等问题；另一类为以较活泼的碘甲烷、重氮甲烷等作为甲酯化试剂，这些活泼的甲酯化试剂较为昂贵，且通常具有较强的毒性，甚至具有易爆等危险特点。

以广泛应用于香料制作的肉桂酸甲酯的制备为例，传统的合成工艺以甲醇和肉桂酸做底物，以浓硫酸作为催化剂来制备肉桂酸甲酯，设备老化快，催化剂以及反应溶剂均回收困难，虽然后续有部分专利研究利用三氯化铁等提高肉桂酸甲酯的转化率，但甲醇用量十分大，原料不经济。因此，发展绿色高效，价格低廉，适用性宽泛的小分子羧酸的甲酯化工艺，是科学研究者们不断追求的目标，也是市场的迫切需求。

相比于化学合成，生物催化反应条件温和，对环境更加友好。迄今为止，研究者们也陆续发现了一些羧基甲基转移酶，可以催化部分小分子羧酸甲酯化，这些酶主要来源于植物，氨基酸序列同源性很高，被统称为SABATH家族。然而，这些羧基甲基转移酶对底物识别十分单一，效率也不高，至今仍未用于工业化生产。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种绿色高效，价格低廉，适用性宽泛的小分子羧酸甲酯化方法，以及能够实现多种小分子羧酸的甲酯化的甲基转移酶。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种绿色高效，价格低廉，适用性宽泛的小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶，并应用于多种小分子羧酸的甲酯化。

为实现上述目的，本发明提供了一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶，其氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7中任一所示。

进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有30％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。

进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有35％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。

进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有40％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。

进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有65％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。

进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。

进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有98％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。

进一步地，甲基转移酶的核酸序列为如序列表SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14中任一所示；或者经密码子优化过的可以编码如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7中任一所示的氨基酸序列的核酸序列；或者在严格条件下与如序列表SEQ ID NO:8～NO:14中任一所示的核酸分子杂交且编码如序列表SEQ ID NO:1～NO:7中任一所示的氨基酸序列的核酸序列。

进一步地，氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5的甲基转移酶来自小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054)，氨基酸序列为SEQ ID NO:6的甲基转移酶来自麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)，氨基酸序列为SEQ ID NO:7的甲基转移酶来自结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)，这些酶具有类似底物识别规律，均可催化多种不同骨架类型的小分子羧酸甲酯化，这些酶的氨基酸序列最低同源性为30％，这些酶催化功能的发现为其产业化应用奠定了基础。

进一步的核酸序列SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:12来自小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054)，核酸序列为SEQ ID NO:13来自麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)，核酸序列为SEQ ID NO:14来自结合分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis H37Rv)。

本发明还提供了一种甲基转移酶的表达载体，包含编码甲基转移酶的核酸序列，表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；原核表达载体包括大肠杆菌表达载体pET系列。

本发明还提供了一种包含甲基转移酶的表达载体的工程菌，工程菌为重组微生物或基因改造微生物，重组微生物是通过将甲基转移酶的核酸序列的表达载体导入原核微生物或真核微生物体内所得到的；基因改造微生物为将含有编码甲基转移酶核酸序列的天然微生物通过基因工程改造后用于催化小分子羧酸化合物发生甲酯化的微生物；基因工程包括基因敲除或中断。

进一步地，重组微生物为将可编码甲基转移酶pET重组质粒导入异源宿主大肠杆菌中，获得具有催化小分子羧酸甲酯化功能的工程菌，为其他异源表达工程菌株的构建提供了参考。

进一步地，基因改造的微生物为通过基因工程技术将分支杆菌(Mycobacteriumneoaurum CCTCC AB2019054))的部分基因进行中断或过表达，获得可以催化小分子羧酸甲酯化，并能积累甲酯化产物的工程菌。

进一步地，原核微生物包括大肠杆菌、假单胞菌或分枝杆菌，真核微生物包括酵母菌或丝状真菌。

本发明还提供了一种甲基转移酶的应用，将甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物。

进一步地，从工程菌中提取具有催化羧酸发生甲酯化的酶活性物质，然后以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化羧酸底物生成甲酯化产物。

进一步地，甲基转移酶催化小分子羧酸发生甲酯化的应用，需要在S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)存在的情况下，以pH为6～8的缓冲液为反应溶液。

进一步地，小分子羧酸化合物为化合物Ia、IIa、IIIa、Ⅳa或Ⅴa，其结构通式如下所示：

其中R₁、R₂、R₃、R₄为H、NH2、CH3、OH、O、F、Cl或Br，n为1、2或3。

进一步地，小分子羧酸化合物还包括化合物Ia～Ⅴa的骨架结构发生修饰或者衍生的羧酸化合物，包括化合物Ia₁～Ia₇、IIa₁、IIIa₁、Ⅳa₁和Ⅳa₂，其结构式分别如下：

本发明还提供了一种该工程菌在转化羧酸化合物生成甲酯化产物的应用。

进一步地，应用方法包括发酵法和生物转化法。

进一步地，发酵法为在工程菌的发酵培养液中加入小分子羧酸化合物作为底物，通过发酵转化小分子羧酸形成甲酯化产物；生物转化法为收集工程菌菌体后，用缓冲液重悬，加入小分子羧酸化合物作为底物，进行催化反应。

进一步地，缓冲液pH为6～8。

进一步地，工程菌为将本发明的甲基转移酶通过pET表达载体导入大肠杆菌所得，通过IPTG诱导表达本发明中的甲基转移酶。

在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了甲基转移酶的克隆表达；

在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明了甲基转移酶催化小分子羧酸生成甲酯化产物的操作步骤及检测方法；

本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了一种催化羧酸化合物甲酯化的工程菌的构建过程，包括重组微生物和基因改造微生物；

在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明了一种催化羧酸化合物甲酯化的工程菌用于转化小分子羧酸化合物生成甲酯化产物的具体步骤及检测方法。

在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明了甲基转移酶催化小分子羧酸生成甲酯化产物的的应用。

本发明从微生物中发现了一类与传统羧基甲基转移酶没有同源性的甲基转移酶，这类甲基转移酶相互之间的同源性超过30％，在多种微生物中普遍存在并行使类似的功能——可催化多个骨架完全不同的小分子羧酸生成甲酯化产物，包括催化肉桂酸生成极具应用价值的肉桂酸甲酯，且催化效率高，有望用于工业化生产。其中，本发明提供的甲基转移酶作用的部分小分子羧酸，如结构通式Ⅱa～Ⅴa类羧酸化合物目前还未有通过生物催化实现甲酯化的研究报道，具有极高的创新性。

本发明提供了一种全新家族的羧基甲基转移酶，可催化多种不同骨架类型的小分子羧酸化合物甲酯化，催化效率高。

本发明提供了一种小分子羧酸甲酯化工艺，该工艺绿色高效，价格低廉，适用性宽泛，能够实现多种小分子羧酸的甲酯化，可弥补传统小分子羧酸甲酯化工艺的缺陷，具有极大的应用潜力及经济价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的甲基转移酶SDS-PAGE凝胶电泳图；

图2是本发明的一个较佳实施例2的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的甲基转移酶催化化合物Ⅴa₁生成产物Vb₁的结果图；

图3是本发明的一个较佳实施例2的化合物Ⅴa₁的核磁¹H-NMR谱图；

图4是本发明的一个较佳实施例2的甲酯化产物Ⅴb₁的核磁¹H-NMR谱图；

图5是本发明的一个较佳实施例2的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5的甲基转移酶催化小分子羧酸化合物Ⅴa₁的动力学参数及拟合曲线；

图6是本发明的一个较佳实施例5的甲基转移酶催化小分子羧酸化合物生成甲酯化产物的反应过程示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：甲基转移酶的克隆表达

以少量小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054，含核酸序列如序列表SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:12所示)、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae，含核酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示)、结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosisH37Rv，含核酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示)作为模板，在前后引物两端，分别设计NdeI和EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过PCR对甲基转移酶基因进行扩增(使用引物P1/P2扩增序列SEQ ID NO:8，使用引物P3/P4扩增序列SEQ ID NO:9，使用引物P5/P6扩增序列SEQ IDNO:10，使用引物P7/P8扩增序列SEQ ID NO:11，使用引物P9/P10扩增序列SEQ ID NO:12，使用引物P11/P12扩增序列SEQ ID NO:13，使用引物P13/P14扩增序列SEQ ID NO:14)，经过琼脂糖凝胶电泳和胶回收获得5′和3′分边带有NdeI和EcoRI酶切位点的7条甲基转移酶基因，其中引物P1-P14的核苷酸序列如下：

P1：CATATGATGAGTTCACTGCGCTCCCA

P2：GAATTCTCAGCGCCTCGTCGCGGTGA

P3：CATATGATGGTGCGTACCGAGGGCGA

P4：GAATTCTCAGCTCAACCGCCCGCTGA

P5：CATATGATGGCACGCACCGACGGTGA

P6：GAATTCCTACTGCTTGATCGCAGTGA

P7：CATATGATGGCACGCACCGATCACGA

P8：GAATTCTCAGCGGCCGGGTGTCGGGT

P9：CATATGATGGCGCGCACCGAGAACGA

P10：GAATTCCTACCTGGTGGCCGTGACGT

P11：CATATGATGACGCAAACGGGCAGTGC

P12：GAATTCTCAGCGTGTGTCTTGGTGTT

P13：CATATGATGAGCACCATGCGCACACA

P14：GAATTCTTACAGACGATGTGCTGTCA。

用NdeI和EcoRI对上述胶回收产物和pET28a质粒进行双酶切，通过胶回收获得带有相应粘性末端的目的基因片段和线性质粒载体。在T4连接酶的作用下，7条目的基因片段分别和线性载体发生酶连。将此酶连产物分边转化至大肠杆菌DH5α中并涂布在含有卡那霉素的LA平板上，分别挑取单克隆抗体转接至含有卡那霉素抗生素的LB培养基中培养。利用质粒提取试剂盒对质粒进行提取，质粒交由测序公司对获得的目的基因序列进行测序，测序验证成功后获得重组质粒pET28-甲基转移酶。通过大肠杆菌化学转化法，将构建的重组质粒pET28a-甲基转移酶转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化液涂布在含有50μg/mL卡那霉素抗生素的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养后，长出单菌落即为重组大肠杆菌。随后将7个重组大肠杆菌在400ml LB培养基中完成蛋白表达，Ni-NTA亲和层析的方式完成蛋白纯化，得到7个纯度为90％以上的甲基转移酶蛋白，蛋白纯化结果如图1所示，图中A-G部分分别表示氨基酸序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的甲基转移酶SDS-PAGE凝胶电泳图。

(1)PCR反应体系：

模板：1μL，DMSO：1μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，Primerstar mix：25μL，超纯水：21μL。

(2)PCR反应条件：

(3)酶连体系：

T4 ligase 1μL

T4 ligase buffer 1μL

DNA片段(碱基数)：载体(碱基数)为3:1

ddH₂O补齐至10μL

16℃水浴过夜酶连

(4)甲基转移酶蛋白表达和纯化步骤

将含甲基转移酶表达载体的重组大肠杆菌按1％的接种量转接至400mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃摇荡2-3h至OD₆₀₀值为0.6-0.8，冰上冷却20min，加入IPTG(终浓度为0.1mM)，放置在18℃摇床诱导表达18-20h。蛋白表达结束后，菌液分批转移至离心杯或离心管中，4000rpm离心15min，弃去上清，将收集到的菌体用约25mL破菌缓冲液(20mM HEPES，300mM NaCl 5mM咪唑，PH调节至7.4)重悬并转移到干净的50mL离心管。将离心管放置在冰水浴中，用超声破碎仪对菌体进行破碎。超声完成后，超声破菌完成后，12000rpm离心40min，上清转移至新的50mL离心管，加入预先处理完毕(已用去离子水和破菌缓冲液多次清洗)的Ni-NTA 2mL，冰浴下振摇1-2h使带有His-Tag的目标蛋白和Ni-NTA树脂充分结合。然后依次用25mM，50mM，100mM，200mM的咪唑缓冲液(20mM HEPES，300mM NaCl和不同浓度的咪唑溶液，PH都调节至7.4)梯度洗脱以分离杂蛋白和目标蛋白，并用1.5mL的EP管收集流出液。分别取出滤液以及各个浓度梯度的洗脱液中进行SDS-PAGE凝胶电泳。根据SDS-PAGE的结果合并含有目的蛋白且纯度大于90％的洗脱液，转移到10KD的Millipore蛋白超滤浓缩管中，4℃、4000rpm离心超滤浓缩至2.5mL。加到预先平衡好的脱盐柱中，待液体全部流出后，加入3.5mL脱盐缓冲液，收集流出液，并用超滤管浓缩至0.5-1mL，分装成50-100μL小管，使用NanoDrop对回收的目标蛋白测定浓度后于-80℃冰箱保存。

实施例2：甲基转移酶催化小分子羧酸生成甲酯化产物的操作步骤及检测方法

将实施例1中纯化得到的7个甲基转移酶蛋白催化小分子羧酸化合物Ia～Ⅴa进行活性测定。

小分子羧酸生成甲酯化产物的200μL反应体系如下：小分子羧酸1mM，甲基转移酶蛋白10μM，SAM 2mM，AdoHcy nucleosidase 10μM，LuxS 10μM，Potassium phosphatebuffer 100mM(PH调节至8.0)，其中AdoHcy nucleosidase和LuxS蛋白按报道的文献方法获得(公开于论文Cheryl L.Hendricks；Jeannine R.Ross；Eran Pichersky,et al.,Anenzyme-coupled colorimetric assay for S-adenosylmethionine-dependentmethyltransferases[J].Analytical Biochemistry2003,326,100–105)。吹打混匀后置于37℃水浴锅中反应12h，用1ml体积甲醇淬灭反应，充分混合均匀后12000rpm离心5min取上清液用于UPLC液相分析。其中催化小分子羧酸化合物Ⅴa₁生成甲酯化产物的UPLC检测结果如图2所示，Vb₁为催化产物，图中空白-Va₁表示空白实验的液相谱图，(A1)+Va₁～(A7)+Va₁分别表示氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的甲基转移酶催化Ⅴa₁生成的产物的液相谱图。

样品使用岛津高效液相检测(Shimadzu LC-30AD)，C18反相色谱柱(2mm×180mm，岛津)，柱温30℃。流动相为乙腈(B)：水(A)，并添加1‰的甲酸。流速为0.2mL/min，进样量9μL，检测波长由不同的小分子羧酸化合物的最大吸收波长决定。流动相条件为T＝0min，5％B；T＝2min，5％B；T＝8min，100％B；T＝10min，100％B；T＝11min，5％B。

结果显示，上述检测条件下，以氨基酸序列为SEQ ID NO:3的甲基转移酶催化化合物Ia-Va结构的小分子羧酸为例，催化结果如表1所示。其中，以小分子羧酸Ⅴa₁为例，纯酶催化体系中，UPLC检测结果如图2所示。

表1氨基酸序列为SEQ ID NO:3的甲基转移酶催化不同的小分子羧酸底物生成甲酯化产物的催化结果

化合物Ⅰa～Ⅳa为国药集团购买获得，化合物Ⅴa₁为化学合成，具体化学合成方式为：将4-HBC(100mg，0.33mmol)溶解于2.2mL冰醋酸中，将预先用0.2mL水和1mL冰乙酸溶解的CrO3(66.6mg，0.66mmol)加入以上溶液中并继续搅拌室温下反应6h，在5℃下加入5.4mL乙醇淬灭反应，加入5％NaOH溶液调节PH至11，二氯甲烷萃取三次，合并继续水洗2次，合并水相然后用稀盐酸调PH＝2，二氯甲烷萃取三次，饱和NaCl洗涤，无水Na₂SO₄干燥。减压旋蒸除去溶剂，得到白色固体Ⅴa₁(80.59mg，71％)。化合物Ⅴa₁和甲酯化产物Ⅴb₁的核磁¹H-NMR分别如图3和图4所示，图3中表示Ⅴa₁的化合物结构鉴定，图4表示氨基酸序列为SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:7的甲基转移酶催化小分子羧酸化合物Ⅴa₁生成的甲酯化产物Ⅴb₁的结构鉴定结果。

甲基转移酶催化底物Ⅴa₁酶动力学参数的测定：采用超高效液相色谱。甲基转移酶动力学测定采用高效液相色谱：在1.5mL离心管中加入不同初始浓度的Ⅴa₁底物60～2000μM，2mM的SAM，适量的甲基转移酶，AdoHcy nucleosidase 10μM，LuxS 10μM，Potassiumphosphate buffer 100mM(PH调节至8.0)补充至100μL，其中AdoHcy nucleosidase和LuxS蛋白按报道的文献方法获得。吹打混匀后置于37℃水浴锅中反应，每隔15秒钟取出各底物浓度其中的1管，立即加入500μL甲醇淬灭反应，充分混合均匀后12000rpm离心5min取上清液用于UPLC液相分析，外标法测定不同时间底物的浓度。每组实验平行重复3次。将不同底物浓度的Ⅴa₁化合物获得的反应数据OriginPro 9.0(OriginLab software，Northampton，MA)软件通过米氏常数方程来拟合得到动力学常数K_m和V_max。根据V_max计算出k_cat值以及k_cat/K_m值。氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的甲基转移酶催化小分子羧酸化合物Ⅴa₁的动力学参数及拟合曲线如图5所示，图中A～E部分分别表示氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5的甲基转移酶催化小分子羧酸化合物Ⅴa₁的动力学参数及拟合曲线示意图。K_m是酶的特性常数，是当反应速度达到最大反应速度一半时，底物的浓度，反映了酶与底物的亲和力，K_m越小，亲和力越大；V_max指最大反应速率；k_cat表示单位时间内每摩尔的酶转化底物的量，k_cat越大，说明酶转化底物的速率越快；k_cat/K_m是衡量酶催化效率的重要参数，比值越大，说明酶的催化效率越好。

实施例3：一种催化羧酸化合物甲酯化的工程菌的构建过程，包括重组微生物和基因改造微生物

(1)重组微生物为将可编码甲基转移酶pET28a重组质粒导入异源宿主大肠杆菌中，获得具有催化小分子羧酸甲酯化功能的工程菌。

构建pET28a甲基转移酶重组质粒：按照实施例1中的方式获得重组质粒pET-甲基转移酶。

化学感受态的大肠杆菌的制备：将大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)接种至无抗生素的LB平板培养基上，37℃过夜培养。挑取长势良好的单菌落接种至3mL液体LB培养基，于37℃和200rpm的条件下培养12h。接着，按1％的接种量将种子液接种至50mL液体LB培养基中，于37℃和200rpm条件下培养大肠杆菌。当OD₆₀₀为0.6时，迅速将菌液置于冰上。然后，将菌液转移至冰预冷的50mL离心管中，在4℃下，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体至50mL离心管中。用30mL冰预冷无菌的0.1mol的CaCl₂冲洗菌体两次，在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀。用2mL预冷0.1mol的CaCl₂(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μL分装至预冷的1.5mL离心管，得到大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞，迅速置于-80℃保存。

质粒转化：将含有化学感受态大肠杆菌细胞的离心管置于冰上融化，加入1μL的重组质粒pET28a-甲基转移酶，冰浴处理30min，在42℃水浴中热激90s，取出立即冰浴处理2min。最后，加入700μL的LB液体培养基至离心管内，并置于37℃摇床上，200rpm培养45min；培养结束后，5000rpm离心2min，留少量上清重悬菌体沉淀，涂布至含有卡那霉素的LB平板培养基上，37℃过夜倒置培养。挑取抗性平板上的单菌落送至测序公司测序，所用引物为For:TTACAGACGATGTGCTGTCA；Rev：CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCT。取验证成功的菌株于甘油管中，置于-80℃保存备用，即可获得具有催化小分子羧酸甲酯化功能的大肠杆菌重组工程菌。

(2)基因改造的微生物为通过基因工程技术将小金色分支杆菌(Mycobacteriumneoaurum CCTCC AB2019054)的部分基因进行中断或敲除获得可以催化小分子羧酸甲酯化，并能积累甲酯化产物的工程菌，例如敲除小金色分支杆菌中的基因chsE1-E2和chsH1-H2。

基因chsE1-E2和chsH1-H2为Ⅴa₁下游降解基因，chsE1-E2和chsH1-H2的基因敲除能够使小金色分支杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054)大量积累Ⅴb₁化合物，实现Ⅴa₁的甲酯化。

chsE1-E2和chsH1-H2的甲基转移酶的基因敲除质粒的构建：

chsE1-E2和chsH1-H2的甲基转移酶的基因敲除质粒的构建：通过同源重组从小金色分枝杆菌的染色体上删除chsE1-E2和chsH1-H2基因。用两个引物ChsE1/ChsE2从小金色分支杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054)基因组DNA中扩增出1.4kb的左侧同源片段。同样，用两个引物ChsH1/ChsH2扩增了1.4kb的右侧同源片段，将DNA片段克隆到pMD18-T中，并对其序列进行验证，将左侧片段(作为EcoRI/NheI盒)和右侧片段(作为NheI/HindIII盒)一起克隆到pk18mobsacb的EcoRI/HindIII位点获得重组质粒pJTU7。

电转感受态细胞的制备：将冷冻储存的小金色分支杆菌(Mycobacteriumneoaurum CCTCC AB2019054)菌株在已经备好的Lemco培养基平面或者平板培养基上进行划线活化，30℃条件下培养3-5天。从活化好的培养基平板上挑取单克隆转接至lemco液体培养基中进行扩大培养，培养条件30℃，200rpm，48h。将上述活化扩大的菌种按照1％接种量接种于50mL/500mL摇瓶中并于30℃，200rpm培养约6h待其OD₆₀₀生长至约1～1.2。将上述菌液于冰上静置1h，4000g，4℃，10min收集菌体用已经预冷的10％无菌甘油溶液洗涤菌体沉淀，先加入少量甘油溶液于离心管中轻轻悬浮菌体，再温柔地加入约40mL的甘油并充分悬浮菌体，4000g，4℃，10min收集菌体。按前面步骤重复操作三次，每次减少10mL甘油溶液量。加入500μL-1000μL的10％预冷的无菌甘油溶液，按照100μL/200μL每支分装到预冷的无菌的1.5mL的EP管经液氮速冻后于-80℃储存。

转化和敲除：将上述处理完毕的5-10μL重组质粒pJTU7于超净工作台加入到相应的感受态细胞中，混匀静置20min。转移至2mm预冷的电转杯，按23ms，2mm，2.5kv的电转条件进行电转化，电转完毕后立刻转移到冰上静置10min，加入1ml的Lemco液体培养基，轻轻重悬细胞转移至1.5mL离心管，30℃，200rpm培养4h。4000rpm，4min离心弃去部分上清，重悬剩余菌液涂布于含有30μg/ml卡那霉素的Lemco固体平板并于30℃培养3-5天。在卡那霉素平板上长出的单菌落后挑取平板上单菌落于Lemco液体培养基进行连续多次传代松弛，用无菌的ddH₂O将传代培养的菌液进行10^-1，10^-2，10^-3，10^-4梯度稀释，稀释后的菌液按以下条件涂布于相应的固体平板，10^-2涂布在平板1(Lemco+Kan+Suc)和平板3(Lemco+Suc)上；10^-4涂布在平板2(Lemco+Kan)和平板4(Lemco+Suc)，其中Suc为10％浓度的蔗糖，继续培养3-5天。如出现平板1上的菌落远小于平板2上的，表示sacB蔗糖致死基因成功在分枝杆菌的基因组上进行了整合并发挥了相应的致死作用。挑取平板3和平板4上的单菌落，每个菌落分别在Lemco+Kan和Lemco平板上划线，排除少量因蔗糖致死失效的导致在平板3和4上生长的菌株。挑取10-20株能在上述的Lemco平板生长而又不能在Lemco+Kan平板上生长的克隆，转接至Lemco液体培养基扩大培养。设计引物验证挑取菌株的DNA，同时送测序公司测序以确定相应的甲基转移酶基因被敲除成功。最后将基因敲除成功的菌株于-80℃和20％甘油条件下保存，即可获得了部分甲基转移酶基因敲除的可以催化小分子羧酸甲酯化的小金色分支杆菌重组工程菌。

实施例4：一种催化羧酸化合物甲酯化的重组工程菌用于转化小分子羧酸化合物生成甲酯化产物的具体步骤及检测方法

(1)重组工程菌的诱导培养

将实施例3中的含有pET28a-甲基转移酶质粒的大肠杆菌重组工程菌接种至具有卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落接种至3mL具有卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃、200rpm下培养12h，得到种子液。将种子液按1％接种至100mL的LB培养基。在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6，添加终浓度为0.1mM的IPTG，在18℃和200rpm的条件下培养16h，在16℃和4000rpm的条件下离心20min，获得诱导培养后的菌体。

将实施例3中的含pJTU7质粒的小金色分支杆菌重组工程菌接种至具有卡那霉素的Lemco固体平板上，28℃过夜培养。挑取单菌落接种至液体Lemco培养基中，于28℃、200rpm下培养24h，得到种子液。将种子液按1％接种至100mL的Lemco培养基。在28℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀＝1.0获得活性高的小金色分支杆菌重组工程菌。

(2)全细胞催化

用pH 8.0、100mM Potassium phosphate buffer缓冲液重悬上述处理过的重组工程菌体沉淀至OD₆₀₀＝10，在37℃、150rpm条件下，投入终浓度为1mM的小分子羧酸化合物进行全细胞催化，催化时间6～12h，用乙酸乙酯萃取反应液，获得甲酯化产物。

(3)催化反应后甲酯化产物的检测

取500μL反应后的转化液，用甲醇1：1稀释，离心后取上清液，上清液经过0.22μm的滤膜过滤至液相瓶中。样品使用岛津高效液相检测(Shimadzu LC-30AD)，C18反相色谱柱(2mm×180mm，岛津)，柱温30℃。流动相为乙腈(B)：水(A)，并添加1‰的甲酸。流速为0.2mL/min，进样量9μL，检测波长由不同的小分子羧酸化合物的最大吸收波长决定。流动相条件为T＝0min，5％B；T＝2min，5％B；T＝8min，100％B；T＝10min，100％B；T＝11min，5％B。

实施例5：甲基转移酶催化小分子羧酸生成甲酯化产物的的应用

甲基转移酶催化小分子羧酸发生甲酯化的应用，需要在S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)存在的情况下，以pH为6～8的缓冲液为反应溶液。甲基转移酶催化小分子羧酸生成甲酯化产物的反应过程示意图如图6所示，其中，S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)为甲基转移反应的甲基供体，S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)为该反应的副产物，Ia、IIa、IIIa、IVa、Va为小分子化合物，R₁、R₂、R₃、R₄为小分子化合物的取代基基团，可为H、NH₂、CH₃、OH、O、F、Cl或Br，n为1、2或3，同时催化小分子Ia、IIa、IIIa、IVa、Va对应地生成的甲酯化产物为Ib、IIb、IIIb、IVb、Vb，具体操作步骤为：从工程菌中提取具有催化羧酸发生甲酯化的酶活性物质，然后以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化羧酸底物生成甲酯化产物，具体的这些形式的酶催化反应条件为：200μL的反应体系包括小分子羧酸1mM，甲基转移酶蛋白10μM，SAM 2mM，AdoHcynucleosidase 10μM，LuxS 10μM，Potassium phosphate buffer 100mM(PH调节至8.0)，吹打混匀后置于37℃水浴锅中反应12h，用1ml体积甲醇淬灭反应，充分混合均匀后12000rpm离心5min取上清液用于UPLC液相分析，检测条件同实施例2。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用

<130> 20220428

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 1

Met Ser Ser Leu Arg Ser His Asp Asp Thr Trp Asp Ile Asp Thr Ser

1 5 10 15

Val Gly Thr Thr Ala Val Met Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Glu Thr

20 25 30

Ala Ala Ala Asp Pro Leu Ile Ser Asp Pro Tyr Ala Arg Ile Leu Val

35 40 45

Asp Gly Ala Gly Gly Gly Pro Trp Ser Met Met Leu Asp Glu Asp Phe

50 55 60

Ala Ala Arg Ala Glu Glu Ile Asp Pro Glu Ala Ala Val Leu Phe Ala

65 70 75 80

His Met Gly Asn Tyr Gln Ala Val Arg Thr Arg Phe Phe Asp Asp Tyr

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Phe Ala Glu Ala Gly Leu Arg Gln Val Val Ile Leu Ala Ser Gly Leu

100 105 110

Asp Ser Arg Ala Phe Arg Leu Ser Trp Pro Ala Gly Thr Thr Val Phe

115 120 125

Glu Ile Asp Gln Pro Lys Val Leu Glu Tyr Lys Arg Gln Val Leu Ala

130 135 140

Glu His Gly Val Gln Pro Thr Ala Thr Arg Val Glu Val Ala Ile Asp

145 150 155 160

Leu Arg Gln Asp Trp Pro Ala Ala Leu Arg Ser Ala Gly Phe Asp Asp

165 170 175

Thr Val Pro Thr Ala Trp Leu Ala Glu Gly Leu Leu Met Tyr Leu Pro

180 185 190

Gly Asp Ala Gln Asp Arg Leu Phe Glu Gln Ile Thr Ala Leu Ser Ala

195 200 205

Pro Gly Ser Arg Ile Ala Ala Glu Thr Ala Pro Met Gln Ala Glu Glu

210 215 220

Arg Arg Ala Gln Met Lys Glu Arg Phe Asp Arg Ile Lys Glu Lys Phe

225 230 235 240

Gly Leu Ser Asp Ser Ile Asp Val Gly Glu Leu Met Tyr Asn Asp Pro

245 250 255

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Pro Trp Leu Ala Gly His Gly Trp Asp Ser

260 265 270

Ala Ala Val Lys Ser Ala Asp Glu Met Arg Arg Leu Asn Arg Trp Ala

275 280 285

Leu Pro Glu Gly Pro Asp Ile Pro Glu Asp Asp Ala Phe Ser Gln Phe

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Val Thr Ala Thr Arg Arg

305 310

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 2

Met Val Arg Thr Glu Gly Asp Ser Trp Asp Leu Ala Ser Ser Val Gly

1 5 10 15

Ala Thr Ala Thr Met Val Ala Ala Gly Arg Ala Ile Ala Ser Ala Ala

20 25 30

Glu Asn Pro Leu Ile Asp Asp Pro Phe Ala Ala Pro Leu Val Arg Ala

35 40 45

Val Gly Ile Pro Ala Phe Thr Met Met Val Asp Gly Ser Val Asp Leu

50 55 60

Ala Glu Ile Ala Pro Glu Ser Ala Ser Gln Val Arg Ser Asn Ile Asp

65 70 75 80

Glu Met Ala Val Arg Thr Lys Phe Phe Asp Asp Tyr Phe Met Ala Ala

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Gly Glu Leu Gly Ile Arg Gln Ala Val Ile Leu Ala Ala Gly Leu Asp

100 105 110

Ala Arg Ala Tyr Arg Leu Pro Trp Ala Asp Gly Thr Thr Val Tyr Glu

115 120 125

Val Asp Gln Pro Glu Val Ile Glu Phe Lys Thr Arg Thr Leu Ala Asp

130 135 140

Leu Gly Ala Ala Pro Thr Ala Glu Arg Arg Thr Val Pro Val Asp Leu

145 150 155 160

Arg Asp Asp Trp Pro Ala Ala Met Arg Ala Ala Gly Leu Asp Pro Asp

165 170 175

Gln Pro Thr Ala Trp Cys Ala Glu Gly Leu Leu Ile Tyr Leu Pro Pro

180 185 190

Glu Ala Gln Asp Arg Leu Phe Asp Asn Ile His Ala Leu Ser Ala Ser

195 200 205

Gly Ser Thr Val Ala Thr Glu Phe Val Pro Gly Met Lys Asp Phe Asp

210 215 220

Pro Glu Lys Ala Arg Ala Ala Ala Ala Thr Phe Ser Lys Leu Gly Leu

225 230 235 240

Glu Met Asp Met Pro Ser Leu Val Tyr Arg Gly Glu Arg Thr Ser Ala

245 250 255

Ala Asp Tyr Leu Gly Ala Arg Gly Trp Arg Met Thr Gln Thr Pro Arg

260 265 270

Ala Asp Leu Phe Thr Arg Tyr Gly Leu Ala Lys Pro Asp Leu Gly Ala

275 280 285

Gly Asp Val Leu Gly Glu Ile Val Tyr Ile Ser Gly Arg Leu Ser

290 295 300

<210> 3

<211> 305

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 3

Met Ala Arg Thr Asp Gly Asp Thr Trp Asp Leu Ala Ser Ser Val Gly

1 5 10 15

Ala Thr Ala Thr Met Val Ala Ala Ala Arg Ala Met Ala Ser Ser Gly

20 25 30

Pro Ala Pro Val Ile Asp Asp Pro Tyr Ala Ala Pro Leu Val Arg Ala

35 40 45

Val Gly Val Asp Phe Phe Thr Lys Leu Val Asp Gly Glu Ile Thr Glu

50 55 60

Ser Glu Leu Gly Asp Asp Pro Gln Met Asn Ile Ala Arg Phe Ala Asn

65 70 75 80

Gly Met Ala Ala Arg Thr Arg Phe Phe Asp Asp Phe Tyr Ala Asp Ala

85 90 95

Val Gly Ala Gly Val Arg Gln Ala Val Ile Leu Ala Ala Gly Leu Asp

100 105 110

Ala Arg Ala Tyr Arg Leu Asp Trp Pro Ala Gly Thr Val Val Phe Glu

115 120 125

Val Asp Gln Pro Glu Val Ile Glu Phe Lys Thr Arg Thr Leu Ala Asp

130 135 140

Leu Gly Ala Lys Pro Thr Ala Asp Arg Arg Thr Val Ala Val Asp Leu

145 150 155 160

Arg Asp Asp Trp Val Ala Ala Leu Arg Ser Ala Gly Phe Asp Pro Ser

165 170 175

Ala Pro Thr Ala Trp Ile Ala Glu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Pro Pro

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Glu Ala Gln Asp Arg Leu Leu Glu Val Ile Thr Glu His Ser Ala Pro

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Gly Ser Arg Leu Ala Ala Glu Ala Val Pro Gly Ile Ser Glu Glu Gln

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Asp His Gly Phe Asp Leu Asp Phe Ser Glu Leu Val Tyr Leu Gly Asp

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Arg Thr Asp Ala Asp Thr His Leu Val Glu Leu Gly Trp Gln Thr Ser

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Ala Met Thr Thr Asn Ala Leu Leu Glu Arg Tyr Gly Leu Pro Val Leu

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Asp Glu Gln Ala Gln Phe Gly His Pro Ser Tyr Ile Thr Ala Ile Lys

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Gln

305

<210> 4

<211> 308

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 4

Met Ala Arg Thr Asp His Asp Ser Trp Asp Leu Ala Ser Ser Val Gly

1 5 10 15

Ala Thr Ala Thr Gly Val Ala Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly

20 25 30

Pro Glu Pro Leu Leu Asp Asp Pro Tyr Ala Glu Pro Leu Val Arg Ala

35 40 45

Val Gly Leu Asp Ala Phe Thr Arg Met Ile Ser Glu Asp Ala Asp Glu

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Val Ala Asp Asp Pro Val Phe Asn Arg Gln Gln Met Ala Glu Gln Val

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Ala Tyr Arg Leu Pro Trp Pro Ala Gly Thr Val Val Tyr Glu Ile Asp

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Gln Pro Lys Val Ile Glu Phe Lys Thr Arg Thr Leu Ala Glu Leu Gly

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Ala Thr Pro Thr Ala Glu Leu Arg Thr Val Gly Ile Asp Leu Arg Ala

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Thr Ala Trp Ser Ala Glu Gly Leu Leu Ile Tyr Leu Pro Pro Glu Ala

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Gln Asp Arg Leu Phe Asp Asp Ile Thr Ala Leu Ser Ala Pro Gly Ser

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Asp Arg Met Ala Glu Phe Ala Gln Arg Trp Gln Arg Tyr Gly Met Ala

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Asp Gln Trp Thr Asp Leu Val Tyr Gln Gly Glu Arg Ala Gln Val Pro

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Ala Tyr Leu Ser Gly Ala Gly Trp Gln Val Thr Ala Arg Gly Thr Val

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Asp Leu Tyr Ala Ala Asn Gly Phe Ala Leu Pro Asp His Glu Met Met

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305

<210> 5

<211> 291

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 5

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Asn Ile Ala Gly Ile Ser Asp Pro Tyr Ala Glu Pro Leu Val Ser Ala

20 25 30

Val Gly Ile Gly Ala Tyr Ala Arg Tyr Ala Arg Gly Glu Ile Asp Gly

35 40 45

Ala Ala Ala Asp Asp Ile Ser Arg Met Ala Asp Gly Ile Ala Ala Arg

50 55 60

Thr Arg Phe Tyr Asp Asp Phe Val Thr Asp Ala Val Asp Ser Gly Ile

65 70 75 80

Arg Gln Val Val Ile Leu Ala Ser Gly Leu Asp Ala Arg Ala Tyr Arg

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Leu Arg Trp Pro Ser Asp Val Val Val Tyr Glu Leu Asp Gln Pro Gln

100 105 110

Val Ile Glu Phe Lys Thr Arg Thr Leu Ala Asp Leu Gly Ala Thr Pro

115 120 125

Ala Ala Glu His Arg Thr Ile Gly Val Asp Leu Arg Asp Asp Trp Pro

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Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly Phe Asp Ser Ser Glu Pro Ala Ala Trp

145 150 155 160

Leu Ala Glu Gly Leu Leu Val Tyr Leu Pro Pro Glu Ser Gln Asp Arg

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Leu Leu Asp Asn Ile Thr Glu Leu Ser Ala Pro Gly Ser Arg Ile Ala

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Thr Glu Asn Thr Ala Thr Ile Ser Ser Asp Asp Leu Val Met Ile Ser

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Leu Gly Val Asp Val Asp Val Ala Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Lys Arg

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Ser Glu Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Gly Ser Gly Trp Arg Pro Val Leu

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<211> 313

<212> PRT

<213> Mycobacterium leprae

<400> 6

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Asp Arg Pro Asp Ala Leu Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Lys Leu Leu Val

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Thr Thr Leu Ala Glu His Gly Val Thr Pro Thr Ala Asp Arg Arg Glu

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Val Pro Ile Asp Leu Arg Gln Asp Trp Pro Pro Ala Leu Arg Ser Ala

165 170 175

Gly Phe Asp Pro Ser Ala Arg Thr Ala Trp Leu Ala Glu Gly Leu Leu

180 185 190

Met Tyr Leu Pro Ala Thr Ala Gln Asp Gly Leu Phe Thr Glu Ile Gly

195 200 205

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His Gly Asp Glu Trp Arg Glu Gln Met Gln Leu Arg Phe Arg Arg Val

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Ser Asp Ala Leu Gly Phe Glu Gln Ala Val Asp Val Gln Glu Leu Ile

245 250 255

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Gly Trp Arg Ala Thr Ala Gln Ser Ala Pro Asp Glu Met Arg Arg Val

275 280 285

Gly Arg Trp Gly Asp Gly Val Pro Met Ala Asp Asp Lys Asp Ala Phe

290 295 300

Ala Glu Phe Val Thr Ala His Arg Leu

305 310

<210> 7

<211> 318

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv

<400> 7

Met Thr Gln Thr Gly Ser Ala Arg Phe Glu Gly Asp Ser Trp Asp Leu

1 5 10 15

Ala Ser Ser Val Gly Leu Thr Ala Thr Met Val Ala Ala Ala Arg Ala

20 25 30

Val Ala Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Val Asn Asp Gln Phe Ala Glu

35 40 45

Pro Leu Val Arg Ala Val Gly Val Asp Phe Phe Val Arg Met Ala Ser

50 55 60

Gly Glu Leu Asp Pro Asp Glu Leu Ala Glu Asp Glu Ala Asn Gly Leu

65 70 75 80

Arg Arg Phe Ala Asp Ala Met Ala Ile Arg Thr His Tyr Phe Asp Asn

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Phe Phe Leu Asp Ala Thr Arg Ala Gly Ile Arg Gln Ala Val Ile Leu

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Ala Ser Gly Leu Asp Ser Arg Ala Tyr Arg Leu Arg Trp Pro Ala Gly

115 120 125

Thr Ile Val Phe Glu Val Asp Gln Pro Gln Val Ile Asp Phe Lys Thr

130 135 140

Thr Thr Leu Ala Gly Leu Gly Ala Ala Pro Thr Thr Asp Arg Arg Thr

145 150 155 160

Val Ala Val Asp Leu Arg Asp Asp Trp Pro Thr Ala Leu Gln Lys Ala

165 170 175

Gly Phe Asp Asn Ala Gln Arg Thr Ala Trp Ile Ala Glu Gly Leu Leu

180 185 190

Gly Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Gln Asp Arg Leu Leu Asp Gln Ile Thr

195 200 205

Ala Gln Ser Val Pro Gly Ser Gln Phe Ala Thr Glu Val Leu Arg Asp

210 215 220

Ile Asn Arg Leu Asn Glu Glu Glu Leu Arg Gly Arg Met Arg Arg Leu

225 230 235 240

Ala Glu Arg Phe Arg Arg His Gly Leu Asp Leu Asp Met Ser Gly Leu

245 250 255

Val Tyr Phe Gly Asp Arg Thr Asp Ala Arg Thr Tyr Leu Ala Asp His

260 265 270

Gly Trp Arg Thr Ala Ser Ala Ser Thr Thr Asp Leu Leu Ala Glu His

275 280 285

Gly Leu Pro Pro Ile Asp Gly Asp Asp Ala Pro Phe Gly Glu Val Ile

290 295 300

Tyr Val Ser Ala Glu Leu Lys Gln Lys His Gln Asp Thr Arg

305 310 315

<210> 8

<211> 933

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 8

atgagttcac tgcgctccca tgacgacacc tgggatatcg acaccagcgt cggcaccacg 60

gccgtcatgg tggcggctgc ccgggccgcc gagacggcgg cggccgaccc gctgatttcc 120

gacccgtacg cgcgcatcct cgtcgacggt gccggcggcg gaccgtggag catgatgctc 180

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gcgtggctgg ccgaggggct gctgatgtat ctgcccggtg acgcgcagga ccggctcttc 600

gagcagatca ccgcgctcag cgcgcccggc agcaggatcg ccgccgagac ggcgccgatg 660

caggccgagg aacgtcgggc ccagatgaag gaacgattcg accgcatcaa ggagaagttc 720

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atgcgcaggc tgaatcggtg ggcacttccg gagggccccg acattcccga agacgacgcg 900

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<211> 912

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 9

atggtgcgta ccgagggcga cagctgggac ctggcatcca gcgtgggtgc cacggccacc 60

atggtggcgg ccgggcgggc catcgccagt gcggccgaga atcccctcat cgacgatccg 120

ttcgcggcgc cactggtgcg cgcggtcggc atcccggcct tcaccatgat ggtcgacggt 180

tcggtcgatc tggccgagat cgcccccgag tccgcgagtc aggtgcggtc gaacatcgat 240

gagatggccg tgcggacgaa gttcttcgac gactacttca tggccgccgg cgaactcggt 300

atccgccagg cggtcattct cgccgcgggc ttggatgcgc gtgcctatcg gctcccgtgg 360

gccgacggca ccaccgtcta tgaggtcgac caaccggagg tcatcgagtt caagacccgc 420

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aacatccacg cgctcagcgc atccggaagc accgtggcca ccgaattcgt gccaggtatg 660

aaggatttcg atccggaaaa ggcgcgcgcc gcggccgcaa cattcagcaa gctgggcctt 720

gagatggaca tgccgtcctt ggtctatcgg ggtgaacgca cctcagccgc agactatctg 780

ggggcgcgcg gctggcggat gacgcaaaca cccagagccg acctgttcac tcgctacggc 840

cttgccaagc ctgatctcgg tgccggcgat gtcttgggcg agatcgtcta catcagcggg 900

cggttgagct ga 912

<210> 10

<211> 918

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 10

atggcacgca ccgacggtga cacctgggac ctggcctcca gcgtgggcgc caccgcgacg 60

atggtggccg ccgcccgcgc catggcctcg tcgggacccg cacccgtgat cgacgacccg 120

tacgccgctc ccctggtacg cgccgtcggc gtcgacttct tcaccaaact cgtcgacggt 180

gagatcaccg agtccgagct tggcgacgac ccacagatga acatcgcccg cttcgccaac 240

ggtatggcag cgcgcacccg gttcttcgac gacttctacg ccgacgcggt cggtgccggc 300

gtgcggcagg cggtgatcct ggccgccggc ctggatgcgc gcgcgtatcg gctggactgg 360

cccgcaggca ccgtggtctt cgaggtcgac cagccagagg tcatcgagtt caagacccgc 420

accctggccg acctgggggc caagcccacc gcagaccgcc gcacggtggc cgtcgacctg 480

cgcgacgact gggtcgccgc gttgcgctcg gcaggtttcg atccgtcggc tccgaccgca 540

tggatcgccg agggcctgtt cggttatctg ccgcccgagg cacaagatcg gctcctggaa 600

gtcatcaccg agcacagcgc accgggcagc cgactcgccg ccgaggccgt gccgggaatt 660

tccgaggagc agcaggagca ggcgcgtgag cgcatgcagg ccgttcgcga ccagtggtcc 720

gatcacggct tcgacctgga cttcagcgaa ttggtctatc tcggcgaccg caccgatgcc 780

gacacccatc tggtcgagct cggctggcag acctccgcga tgaccaccaa tgcgctgctg 840

gagcgctacg gtctgcccgt tctcgacgag caggcgcagt tcgggcaccc gtcctacatc 900

actgcgatca agcagtag 918

<210> 11

<211> 927

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 11

atggcacgca ccgatcacga cagttgggac ctggcctcca gcgtgggagc caccgccacc 60

ggagtcgccg ccggccgcgc gctggcagcc cgcggaccgg agcccctact cgatgacccc 120

tacgccgaac cactggttcg cgccgttggt ctggacgcgt tcacccgcat gatcagcgag 180

gacgccgacg aggtcgccga cgacccggtc ttcaaccgtc agcagatggc cgaacaggtc 240

accgtgcgca cccggttctt cgacgacttc ttccttcggg ccggagccgc aggcatccgg 300

caggccgtga tcctggccag cggcctggac acccgcgcct accggctgcc ctggccggcc 360

ggcacggtgg tctatgaaat cgaccagcct aaggtcatcg aattcaagac ccgcacgctg 420

gccgagttgg gtgccacccc gaccgccgag cttcgcaccg tcggcatcga cctgcgcgcg 480

gactggtcga ccgccctgcg cgagcggggc ttcaaccccg accaaccgac ggcgtggagc 540

gccgaggggc tgctgatcta tctgccgccg gaggctcagg accgcctctt cgacgacatc 600

accgcgctca gtgcccccgg cagcgcgctg gccaccgaac acgttcccga tctcagcatt 660

ctcgccgacg acgaccgcat ggccgaattc gcccagcgct ggcagcgcta cggcatggca 720

gaccaatgga ccgacctcgt ctaccaaggt gagcgcgccc aggtgcccgc ttacctgagc 780

ggcgccggct ggcaggtcac cgcccgaggc accgtagacc tgtacgccgc caacggtttc 840

gccctgcccg accacgagat gatgaccgaa ctcgccgacc tgacctacat cagcgccgtg 900

ctgtcggacc cgacacccgg ccgctga 927

<210> 12

<211> 876

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054

<400> 12

gtgacggcca ctgccgtggc catgaaccgg gcgatcgcca ccagggcgaa tatcgccggg 60

atcagcgatc cgtacgccga gccgctggta tcggccgtcg ggatcggcgc gtacgcccga 120

tacgcccgtg gcgagatcga tggtgcggcg gccgacgata tatcccggat ggccgacggt 180

atcgctgcgc gtacccgctt ctacgacgac ttcgtcaccg acgcagtcga ttcgggcatt 240

cggcaggtcg tcatcctggc ctcgggtctc gatgcccgcg cctaccggct gcgctggccg 300

tccgatgtcg tggtctacga gctggaccag ccgcaggtga tcgagttcaa gacccgaacc 360

ctggcagatc tgggcgcgac cccggcggcg gagcaccgca cgatcggggt ggacctgcgc 420

gacgactggc ccgccgcatt gcgcgcggcc ggattcgaca gctcggaacc ggccgcgtgg 480

ctggccgagg gattgctggt gtacctgccg ccggagtccc aggatcggtt gttggacaac 540

atcaccgagc tcagtgcgcc gggaagccgg atcgccaccg agaacaccgc gaccatcagc 600

tcggatgatc tggtgatgat cagcgaacgc atgcaggaga tgcgcgggag gtggctggac 660

aaggggatcg acctgggggt cgacgtcgat gtcgccgaac tgttctatcc cggcaaacgc 720

agcgaggccg caacctacct ggccggctcc gggtggcggc ccgtgctgcg gacgagttcg 780

gaactgttcg ccgagtacgg gatgcccgcg tccaccgagg tgctctccgc cttcggcgat 840

atcacctatc tctccgccac gctcggcgag cgttag 876

<210> 13

<211> 942

<212> DNA

<213> Mycobacterium leprae

<400> 13

atgagcacca tgcgcacaca tgatgacact tgggacatca agaccagcgt tggtaccacc 60

gccgttatgg ttgccgcagc acgtgccgca gagacagatc gccccgatgc tttaatccgc 120

gacccgtatg ccaaactgct ggtgacaaat accggtgctg gtgctttatg ggaggcaatg 180

ctggatccga gcatggttgc caaagtggag gccattgatg ccgaagccgc agcaatggtg 240

gaacacatgc gcagctatca agctgttcgc accaacttct ttgacaccta ttttaataac 300

gcagtgatcg atggcatccg tcagtttgtg attttagcca gcggtctgga tagccgcgca 360

tatcgtttag attggccgac cggcaccacc gtgtatgaaa tcgatcagcc gaaggtgctg 420

gcctataaaa gtaccacttt agccgaacat ggcgtgacac ctaccgccga tcgccgcgaa 480

gtgcctattg atctgcgtca agattggccg ccggccttac gcagtgctgg ttttgatccg 540

agtgcccgta cagcatggct ggccgagggt ctgttaatgt atctgccggc caccgcacaa 600

gatggtctgt tcaccgaaat cggcggttta agcgccgtgg gcagccgtat tgcagtggaa 660

accagtccgc tgcacggtga tgaatggcgc gaacagatgc agctgcgctt tcgccgtgtg 720

agcgatgctt taggcttcga acaagctgtg gacgtgcaag aactgatcta ccacgatgag 780

aaccgcgcag tggtggccga ttggctgaat cgtcatggtt ggcgtgccac agcccagagt 840

gcaccggatg aaatgcgccg cgttggtcgc tggggtgatg gtgttccgat ggccgatgac 900

aaggatgcct ttgccgagtt tgtgacagca catcgtctgt aa 942

<210> 14

<211> 957

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv

<400> 14

atgacgcaaa cgggcagtgc ccgctttgag ggcgattcgt gggacttggc gtccagtgtg 60

ggtttgacgg ccaccatggt ggcggcggcc cgagcggtag ccggccgggc tcccggcgcg 120

ctggtcaacg accagttcgc ggaaccgctg gtccgcgcgg tcggcgtcga cttcttcgta 180

cgcatggcca gtggcgaact ggatcccgac gagctagccg aagacgaggc caacggcctg 240

cggcggttcg ccgacgcgat ggccattcgc actcactact tcgacaactt ctttctggat 300

gccacccgag ccgggattcg gcaggccgtc atcttggctt ccggcctgga ttcccgcgcc 360

taccggctgc gctggccagc cggcaccatc gtcttcgaag tcgatcagcc gcaggtgatc 420

gacttcaaga ccacgacgct ggccggcctg ggtgcggcac ccacgaccga ccggcgcacc 480

gtggcggtcg atttgcgcga cgactggccc accgccctgc aaaaagccgg ctttgacaac 540

gcgcagcgga ccgcctggat cgccgagggg ctgctgggct atctgtccgc cgaggcgcag 600

gaccggctgc ttgaccagat caccgcccag agcgtaccgg gcagccagtt cgccaccgaa 660

gtcctgcgcg acatcaatcg gctcaacgaa gaagaactgc ggggacgcat gcggcgcctg 720

gcggagcggt tcaggcgcca tggcctcgac ctcgacatgt cgggcctggt gtatttcggc 780

gaccgcacgg acgcgcggac ctatctggcc gaccacggct ggcgaaccgc cagcgcgagc 840

accaccgact tgctggctga acacggactg ccgccgatcg acggcgacga cgccccgttc 900

ggcgaggtga tctatgtctc cgccgaactg aagcagaaac accaagacac acgctga 957

Claims

1.一种甲基转移酶的应用，其特征在于，所述甲基转移酶的氨基酸序列为如序列表SEQID NO:3，将所述甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物；所述小分子羧酸化合物为化合物Ia、IIa、IIIa、Ⅳa或Ⅴa，其结构通式如下所示：

2.一种甲基转移酶的表达载体在转化羧酸化合物生成甲酯化产物的应用，其特征在于，所述表达载体包含编码所述甲基转移酶的核酸序列，所述表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；所述原核表达载体包括大肠杆菌表达载体pET系列；所述甲基转移酶的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:3，将所述甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物；所述小分子羧酸化合物为化合物Ia、IIa、IIIa、Ⅳa或Ⅴa，其结构通式如下所示：

3.一种工程菌在转化羧酸化合物生成甲酯化产物的应用，其特征在于，所述工程菌为重组微生物或基因改造微生物，所述重组微生物是通过将具有甲基转移酶的核酸序列的表达载体导入原核微生物或真核微生物体内所得到的；所述基因改造微生物为将含有编码所述甲基转移酶核酸序列的天然微生物通过基因工程改造后用于催化小分子羧酸化合物发生甲酯化的微生物；所述基因工程包括基因敲除或中断；所述原核微生物包括大肠杆菌、假单胞菌或分枝杆菌，所述真核微生物包括酵母菌或丝状真菌；所述甲基转移酶的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:3，将所述甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物；所述小分子羧酸化合物为化合物Ia、IIa、IIIa、Ⅳa或Ⅴa，其结构通式如下所示：