CN112779243A

CN112779243A - 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其应用

Info

Publication number: CN112779243A
Application number: CN201911088195.9A
Authority: CN
Inventors: 郭倩; 柳鹏福; 储消和; 陈艳; 竹国津; 韩笑笑
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN112779243B

Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶，其氨基酸序列以及基因序列如序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。其根据桃蚜（Myzus persicae）基因组中编码半胱氨酸亚磺酸脱羧酶的基因序列，进行密码子优化后，体外合成该基因。克隆到表达载体，转入大肠杆菌构建成高表达工程菌。将该工程菌培养诱导后，检测发现该酶具有L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶活性，该酶在合适条件下能将L‑天冬氨酸转化为β‑丙氨酸，克服了现有技术中的原核来源的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶易失活的缺陷，因而可在酶用量较小以及较低成本的条件下用于β‑丙氨酸的工业化生产。

Description

一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其应用。

背景技术

L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase，EC4.1.1.11，ADC)，又称L-天冬氨酸-1-脱羧酶，可催化L-天冬氨酸脱掉α位羧基生成β-丙氨酸。

目前报道的 ADC 主要有两类，第一类 ADC发现于细菌和古细菌中，此类ADC 以丙酮酰基团作为活性中心；第二种 ADC发现于部分古细菌和昆虫中，需要辅酶磷酸吡哆醛(PLP)完成催化活性，这一类酶通常具有多种催化能力，催化特异性较差，但无底物依赖性失活。

β-丙氨酸又名 3-氨基丙酸，是生物体内合成泛酸的重要前体物质，是自然界中唯一天然存在的β型氨基酸。目前主要采用化学法合成β-丙氨酸，如丙烯酸法、β-氨基丙腈法等。但这些方法普遍对条件和动力要求高，分离纯化困难，易污染环境，因此开发绿色安全的生物法生产工艺具有十分明显的经济和社会效益。

生物酶催化法生产β-丙氨酸，目前主要使用原核来源的丙酮酰依赖型的ADC。该类酶的催化机理为:底物 L-天冬氨酸通过一个 Schiff 碱结构连接丙酮酰基团形成酶-底物的中间体，中间体脱去α-羧基（释放一分子CO₂）形成延伸的烯醇结构，该结构去质子化，获得酶-产物的 Schiff 碱中间体，最后通过水解作用释放产物β-丙氨酸，同时丙酮酰基团再生。但是在脱羧过程中亚胺结构的异常质子化，是导致转氨作用形成的主要原因，转氨作用伴随脱羧作用的发生，最终会导致酶失去了丙酮酰基团，也就失去了催化活性。这也就会导致原核来源的酶每催化一个反应就会失活，无法实现反复利用，因此在β-丙氨酸制备时酶用量太大，成本过高。

综上所述，寻找一种可以反复催化L-天冬氨酸脱羧反应的ADC成为实现β-丙氨酸工业制备的关键因素。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的原核来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶易失活无法反复利用，导致β-丙氨酸制备时酶用量太大，成本过高的缺陷，提供了一种来源于真核生物，且能够反复利用的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其能够在催化制备β-丙氨酸过程中反复使用，同时酶用量有效减小，成本大幅下降。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，该酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，该酶原始编码基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

作为优选，为便于在大肠杆菌中表达，该酶编码基因序列被优化如SEQ ID NO.3所示。

本发明中的L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源为真核生物桃蚜（Myzus persicae），其在桃蚜中的基因原始编码序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，但是SEQ ID NO.2中所示的编码序列不利于在大肠杆菌中表达，因此本发明中为了便于大肠杆菌的表达，对该基因做了密码子优化，优化后的具体序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶其与现有的以丙酮酰基团作为活性中心的L-天冬氨酸-α-脱羧酶不同点在于，其催化活性并不以丙酮酰基团作为活性中心，因此其在催化过程中不会因为丙酮酰基团的失去而导致催化活性的丧失。因此本发明中的这种L-天冬氨酸-α-脱羧酶其可回收利用性相较于现有的以丙酮酰基团作为活性中心的L-天冬氨酸-α-脱羧酶而言更高。其可以反复利用，且活性不会发生明显变化，因此，可以以较小的添加量来催化β-丙氨酸，使得成本大幅下降。

作为优选，该酶适宜反应温度为30~40℃，适宜反应pH为6.0~8.0。

作为优选，该酶最适反应温度为37℃，最适反应pH为7.0~8.0。

一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶在磷酸吡哆醛作为辅酶的条件下，催化L-天冬氨酸发生脱羧反应生成β-丙氨酸。

作为优选，所述应用方法包括以下步骤：

（1）重组大肠杆菌构建：将SEQ ID NO.3所示基因编码序列克隆到高表达载体，转化到大肠杆菌合适菌株中，构建基因工程菌；

（2）发酵培养：将1~3%工程菌接种至含卡那霉素30~60μg/mL 的TB培养基中，30~40℃培养4-5h后加诱导剂IPTG至终浓度为0.2~0.6mmol/L，并将温度降至20~28℃诱导目的蛋白的表达，继续培养16-25小时，结束发酵，收集菌体备用；

（3）β-丙氨酸的生产：将发酵得到的湿菌体通过全细胞催化法生产β-丙氨酸；或者从发酵得到的湿菌体提取得到L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化生产β-丙氨酸。

作为优选，所述步骤（1）具体步骤如下：将SEQ ID NO.3所示DNA片段利用NdeI和BamHI酶切位点克隆到表达载体pET 28a(+)，得到pET28a(+)-MpADC重组质粒，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得了高表达的重组大肠杆菌。

作为优选，所述步骤（3）中全细胞催化法生产β-丙氨酸方法如下：全细胞催化法生产β-丙氨酸方法如下：将发酵得到的湿菌体、底物L-天冬氨酸以及磷酸吡哆醛组成转化体系，重组大肠杆菌加菌量为10~50g/L。

作为优选，所述步骤（3）中蛋白催化法生产β-丙氨酸：将发酵得到的湿菌体超声破碎，提取目的蛋白L-天冬氨酸-α-脱羧酶后与底物L-天冬氨酸以及磷酸吡哆醛组成转化体系，反应得到β-丙氨酸，其中L-天冬氨酸-α-脱羧酶的质量为底物L-天冬氨酸的0.5~4%。

作为优选，采用Ni柱纯化并浓缩、脱盐得到纯的目的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳验证、蛋白浓度测定后进行相关酶学性质的探究。

所述方法中，Ni柱纯化条件为超低温破碎发酵所得湿菌体。

所述方法中，Ni柱纯化采用不同浓度咪唑梯度洗脱。

所述方法中，Ni柱纯化咪唑浓度可为5mmol/L-300mmol/L。

作为优选，所述转化体系中底物L-天冬氨酸的的初始浓度为150~400 mmol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0-5mmol/L，反应温度为30~40℃，反应pH为6.0~8.0。

因此，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供了一种来源于真核生物桃蚜的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，通过构建高表达重组工程菌和酶学性质测定，发现该酶与原核来源的ADC相比无底物依赖性失活，可持续的催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸。

（2）进一步将该酶应用于β-丙氨酸的制备，发现具有反应迅速，酶用量少等优点，克服了原核来源的ADC生物酶用量大、成本高的缺陷，对于工业化制备β-丙氨酸具有重要的应用价值。

（3）这是首次从桃蚜中发现的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，且将该酶首次应用于β-丙氨酸的制备，这对于发现新的不同真核来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶具有重要意义。

附图说明

图1：L-天冬氨酸液相检测图片。

图2：β-丙氨酸液相检测图片。

图3：纯化后的MP ADC的SDS-PAGE凝胶电泳检测图。

图4：MP ADC纯化酶最适PLP浓度。

图5：MP ADC纯化酶最适温度。

图6：MP ADC纯化酶最适pH。

图7：MP ADC全细胞催化生产β-丙氨酸的浓度变化曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的磷酸盐缓冲液均为200mmol/L的PBS缓冲液。对于同一条件参数下的不同次反应的色谱图来说，目标峰保留时间会有一定的误差范围，一般相差0.1min内可以视为误差，可以认定为同一目标物。实施例中的细胞浓度“g/L”中的“g”均代表细胞湿重。

下面结合具体实施例对本发明进行更详细的说明。

L-天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定方法：

L-天冬氨酸和β-丙氨酸衍生后用HPLC测具体含量：

衍生剂的制备方法：取0.0343g邻苯二甲醛和0.1472g N-乙酰-L-半胱氨酸，再加入5mL无水乙醇，然后用0.1M硼酸钠（pH=9.5）定容到25mL。

衍生反应：取300μL待测样品，加入200μL硼酸钠缓冲液(0.1M pH=9.5)，再加入200μL衍生剂，反复颠倒混匀6-8次，避光衍生2min后进样。

HPLC系统：Agilent 1100；色谱柱：Welch Ultimate® AQ-C18（4.6×250mm，5μm）；

流动相：50mmol/L乙酸钠水溶液：甲醇＝45:55(体积比)。

流速：0.8mL/min；

柱温：35℃；

检测波长：334nm。

其中L-天冬氨酸检测图片如图1所示，L-天冬氨酸出峰时间为2.392min。

β-丙氨酸液相检测图片如图2所示，β-丙氨酸出峰时间:3.757min。

实施例1

高表达工程菌的构建

（1）从NCBI数据库中获得的桃蚜(Myzus persica)半胱氨酸亚磺酸脱羧酶的蛋白质序列XP_022171514，密码子优化为SEQ ID NO.3后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，利用NdeI和BamHI酶切位点克隆到pET28a(+)载体，从而得到pET28a(+)-MpADC重组质粒。

（2）将所得重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。

（3）在无菌环境下，取100μL用涂布棒将细胞均匀涂布于LB固体培养基平板上(Kan抗性)，温度控制在37℃，正置10-20min后，倒置培养过夜(12-14h)。

（4）由LB平板(Kan抗性)划线37℃培养12h后，接5mL LB试管(Kan抗性)过夜培养。

（5）以2%的接种量接至含卡那霉素45μg/mL 的TB培养基，37℃培养4-5h加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续培养16-25小时，结束发酵。12000rpm，4℃离心10min，收集菌体备用。

实施例2

实施例2中其余步骤与实施例1中相同，区别在于步骤（5），具体如下：以1%工程菌接种至含卡那霉素30μg/mL 的TB培养基中，30℃培养5h后加诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，并将温度降至20℃诱导目的蛋白的表达，继续培养25小时，结束发酵，收集菌体备用。

实施例3

实施例3中其余步骤与实施例1中相同，区别在于步骤（5），具体如下： 3%工程菌接种至含卡那霉素60μg/mL 的TB培养基中， 40℃培养4h后加诱导剂IPTG至终浓度为0.6mmol/L，并将温度降至28℃诱导目的蛋白的表达，继续培养16小时，结束发酵，收集菌体备用。

实施例4

纯化目的蛋白

（1）用磷酸盐缓冲液重悬实施例1~3中得到的菌体，洗去残留培养液，离心弃上清，将菌体重悬后进行超声破碎；

（2）破碎完全后，4℃、12000rpm离心20-30min。上清液用0.45μm的滤膜过滤，于冰上保存；

（3）使用1mL的His Trap FF纯化柱，先用含5mmol/L咪唑的破胞 Buffer平衡层析柱；

（4）取样品上样，用上述破胞 Buffer将没有挂柱的杂蛋白除去；

（5）用不同浓度的咪唑洗脱，收集洗脱液；

（5）SDS-PAGE凝胶电泳检测不同浓度咪唑洗脱液中的蛋白情况；

（6）选取只有目的蛋白洗脱液浓缩、脱盐后保留酶液；

（7）用SDS-PAGE凝胶电泳检测目标蛋白是否满足要求，其电泳检测图如图3所示；

（8）Brandford法测目的蛋白浓度为11mg/mL。

实施例5

最适磷酸吡哆醛（PLP）浓度

反应体系中各组分的组成：L-Asp：7.5mmol/L；PLP：0mmol/L-2.5mmol/L；Mp ADC纯化酶：45μg；最后用pH=7.5、200mmol/L的PBS补齐至1mL

在磁力搅拌器上37℃，1000rpm条件下反应5min取样加10%的SDS终止反应，12000rpm离心3min取上清用于后续的HPLC检测。

检测结果如图4所示，从图中显示当PLP浓度为0.5 mmol/L时，β-丙氨酸的产量最高，故PLP添加量定为0.5 mmol/L。

实施例6

最适反应温度

反应体系中各组分的组成：L-Asp：7.5mmol/L；PLP：0.5mmol/L；Mp ADC纯化酶：45μg；最后用pH=7.5、200mmol/L的PBS补齐至1mL

在磁力搅拌器上1000rpm，20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、50℃、60℃条件下反应2min后取样加10%的SDS终止反应，12000rpm离心3min取上清用于后续的HPLC检测。

检测结果如图5所示，从图中显示当温度为37℃时β-丙氨酸的产量最高，故最适反应温度为37℃。

实施例7

最适反应pH

反应体系中各组分的组成：L-Asp：7.5mmol/L；PLP：0.5mmol/L；Mp ADC纯化酶：45μg；最后用pH=4、pH=5、pH=5.5、pH=6、pH=6.5、pH=7、pH=7.5、pH=8、pH=9，200mmol/L的PBS补齐至1mL

在磁力搅拌器上37℃，1000rpm条件下反应2min后取样加10%的SDS终止反应，12000rpm离心3min取上清用于后续的HPLC检测。

检测结果如图6所示，从图中显示当磷酸盐缓冲液pH=7.5时β-丙氨酸的产量最高，故最适pH=7.5。

实施例8

全细胞催化法生产β-丙氨酸

反应体系的组成：发酵得到的湿菌体、底物L-天冬氨酸、磷酸吡哆醛（PLP）；反应体系中各组分的初始浓度如下：工程菌加菌量为20g/L；PLP浓度为5mmol/L，L-Asp浓度为50g/L。

反应条件：37℃、220rpm振荡。

反应过程中以 pH 为指标，分批补加底物L-天冬氨酸进行酶转化控制反应体系的pH为7.5。

间隔取样HPLC检测β-丙氨酸产量，检测结果如图7所示，11hβ-丙氨酸产量为74.56g/L且没有底物抑制失活现象产生。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> PRT

<213> 桃蚜(Myzus persicae)

<400> 1

Met Pro Ile Val Met Pro Ala Ala Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Ala Thr

1 5 10 15

Ala Arg Pro Val Glu Leu Met Val Thr Ala Ser Ala Leu Asp Glu Lys

20 25 30

Pro Cys Gly Gln Ser Pro Ile Met Glu Ser Leu Ser Ala Ala Val Cys

35 40 45

Gly Tyr Lys Ser Ala Pro Asn Ala Ser Asp His Glu Ala Phe Val Arg

50 55 60

Asp Ala Val Arg Leu Met Leu Glu Gln Ala Val Phe Arg Gly Thr Asp

65 70 75 80

Arg Arg Arg Pro Val Leu Asn Trp Lys Ser Pro Glu Glu Leu Gln Ala

85 90 95

Ala Phe Asp Phe Ala Leu Asp Arg Ser Pro Thr Thr His Gly His Leu

100 105 110

Leu His Leu Ile Glu Asp Thr Ile Glu His Ser Val Lys Thr Gly His

115 120 125

Pro Tyr Phe Ile Asn Gln Leu Phe Ser Ser Val Asp Pro Tyr Gly Leu

130 135 140

Ile Gly Gln Trp Leu Thr Asp Ala Leu Asn Pro Ser Val Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Glu Val Ala Pro Val Met Thr Ile Met Glu Glu Thr Val Leu Thr Glu

165 170 175

Met Arg Lys Phe Leu Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Gly Asp Gly Ile Phe

180 185 190

Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ala Ile Asn Cys Ala Arg

195 200 205

Phe Ser Ala Phe Pro Glu Val Lys Thr Arg Gly Met His Gly Leu Pro

210 215 220

Arg Leu Val Val Tyr Thr Ser Ala Asp Ala His Tyr Ser Ile Lys Lys

225 230 235 240

Leu Cys Ala Phe Glu Gly Ile Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Leu Ile Asn

245 250 255

Thr Asp Thr Lys Gly Lys Met Asp Val Gly His Leu Arg Gln Gln Ile

260 265 270

Gln Arg Thr Leu Glu Glu Lys Ala Val Pro Ile Met Val Ser Ala Thr

275 280 285

Ala Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Ile Ala Glu Ile Ala

290 295 300

Asp Val Cys His Glu Tyr Gly Ile Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp

305 310 315 320

Gly Gly Gly Ala Leu Val Ser Lys Lys His Lys His Leu Leu Asn Gly

325 330 335

Ile Asp Arg Ala Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Leu Thr

340 345 350

Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr Phe Leu Thr Lys His Glu Arg Val Leu

355 360 365

Thr Glu Ser Asn Ser Ser Cys Ala Gln Tyr Leu Phe Gln Lys Asp Lys

370 375 380

Phe Tyr Asp Thr Thr Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile Gln Cys Gly

385 390 395 400

Arg Arg Ala Asp Val Phe Lys Phe Trp Phe Met Trp Lys Ala Lys Gly

405 410 415

Thr Asp Gly Leu Glu Ala His Val Asp Glu Asn Phe Asp Asn Ala Lys

420 425 430

Tyr Phe Thr Glu Met Ile Arg Asn Arg Ala Gly Phe Lys Leu Val Leu

435 440 445

Glu Glu Pro Glu Tyr Thr Asn Ile Thr Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser

450 455 460

Leu Arg Gly Arg Gln Asn Glu Pro Asp Phe Lys Asn Lys Leu His Lys

465 470 475 480

Val Ala Pro Lys Ile Lys Glu Arg Met Met Lys Glu Gly Thr Met Met

485 490 495

Ile Thr Tyr Gln Pro Ala Asp Asp Leu Pro Asn Phe Phe Arg Leu Val

500 505 510

Leu Gln Asn Ser Ser Leu Asp Gln Asn Asp Met Asp Tyr Phe Val Asn

515 520 525

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Ser Asp Leu

530 535

<210> 2

<211> 1614

<212> DNA

<213> 桃蚜(Myzus persicae)

<400> 2

atgccgatcg tcatgccagc cgcttcggcg cccacagatt acgcgaccgc gcgcccggtc 60

gagctaatgg tgaccgcgtc cgccttggac gagaagccct gtggccaaag tccgataatg 120

gagtcgctgt cggcggcggt gtgcggatac aaaagtgcac cgaacgcttc cgaccacgag 180

gcgttcgtcc gggacgcggt gcgtctgatg ctcgagcaag ctgtgttccg aggaacggac 240

cgccgtcgcc cggtgctcaa ctggaagagc ccggaagagc tgcaggccgc attcgacttt 300

gcgctcgacc gttcgcccac tacccacggc cacctgttgc acctgatcga ggacaccatc 360

gagcacagcg tcaaaaccgg acatccgtac ttcatcaatc aactgttttc cagcgtcgac 420

ccttacggcc tgatcggcca gtggctgacc gacgcgctta acccgagcgt gtacacgttc 480

gaagtggcgc ctgttatgac catcatggag gaaacagttc tgacggaaat gaggaagttc 540

ctgggatacc ccgaaggcaa gggcgacggt atattctgtc cgggtggttc gatagccaac 600

ggctacgcga tcaattgtgc caggttttcc gctttccccg aggtcaagac aagagggatg 660

catggattgc cgaggttagt agtgtatacg tcagccgatg ctcattactc tatcaaaaaa 720

ttatgtgcat tcgagggaat cggttcggat aatttgtatt tgatcaacac agacaccaaa 780

ggaaaaatgg acgtgggtca tttacgacaa caaattcaaa gaacattaga agaaaaagca 840

gtgcctatta tggtgtctgc tactgcaggt acaacggtcc tgggggcgtt tgatccgata 900

gcggaaattg ctgacgtttg tcacgaatac ggaatatggt tgcacgttga cgcggcttgg 960

ggaggtggag ctttggtgtc aaaaaaacac aaacacctgt tgaacggcat cgacagagcc 1020

gactcagtca cctggaaccc tcacaaaatg ctcaccgcac ctcaacagtg ttcaacgttt 1080

ttgaccaaac acgaacgcgt gctgaccgaa agcaactctt cttgcgctca atatctgttc 1140

caaaaagaca agttctacga cacgacgtat gacaccggcg ataagcacat tcagtgcggc 1200

cgcagggcgg atgtgttcaa attttggttc atgtggaaag ccaagggaac ggacggattg 1260

gaagctcacg ttgacgaaaa ctttgacaac gccaaatatt tcaccgagat gatacggaac 1320

agagctggtt tcaaattggt actcgaagaa ccggagtaca cgaacattac attttggtat 1380

gtaccaccga gcctgcgcgg acgtcagaac gaaccggatt tcaagaataa actgcacaag 1440

gtggcgccga aaattaaaga gaggatgatg aaggaaggaa cgatgatgat cacgtaccag 1500

ccagccgacg atttgccgaa tttcttccga cttgttcttc aaaactcgtc gttagatcaa 1560

aatgatatgg attatttcgt gaatgaaatc gaacggttgg gttcggattt gtaa 1614

<210> 3

<211> 1614

<212> DNA

<213> 桃蚜(Myzus persicae)

<400> 3

atgccgatcg ttatgccggc ggcgagcgcg ccgaccgact atgcgaccgc gcgtccggtg 60

gagctgatgg ttaccgcgag cgcgctggat gaaaagccgt gcggtcagag cccgattatg 120

gagagcctga gcgcggcggt gtgcggttat aaaagcgcgc cgaacgcgag cgaccatgaa 180

gcgtttgtgc gtgatgcggt tcgtctgatg ctggagcagg cggtgttccg tggtaccgac 240

cgtcgtcgtc cggttctgaa ctggaagagc ccggaggaac tgcaagcggc gttcgacttt 300

gcgctggatc gtagcccgac cacccatggt cacctgctgc acctgatcga ggataccatt 360

gaacacagcg ttaaaaccgg ccacccgtac tttatcaacc agctgttcag cagcgtggac 420

ccgtatggtc tgattggcca atggctgacc gatgcgctga acccgagcgt ttacaccttt 480

gaagtggcgc cggttatgac catcatggag gaaaccgtgc tgaccgagat gcgtaagttt 540

ctgggttacc cggaaggcaa aggtgacggc attttctgcc cgggtggcag catcgcgaac 600

ggctatgcga ttaactgcgc gcgttttagc gcgttcccgg aagttaagac ccgtggtatg 660

catggtctgc cgcgtctggt ggtttacacc agcgcggacg cgcactatag catcaagaaa 720

ctgtgcgcgt ttgagggtat cggcagcgat aacctgtacc tgattaacac cgacaccaag 780

ggtaaaatgg atgttggcca cctgcgtcag caaatccagc gtaccctgga ggaaaaggcg 840

gtgccgatta tggttagcgc gaccgcgggt accaccgtgc tgggtgcgtt tgacccgatt 900

gcggagattg cggatgtgtg ccacgaatat ggtatctggc tgcatgttga tgcggcgtgg 960

ggtggcggtg cgctggttag caagaaacac aaacacctgc tgaacggcat tgaccgtgcg 1020

gatagcgtta cctggaaccc gcacaagatg ctgaccgcgc cgcagcaatg cagcaccttc 1080

ctgaccaaac acgagcgtgt gctgaccgaa agcaacagca gctgcgcgca gtacctgttt 1140

caaaaggaca aattctacga taccacctat gacaccggtg ataagcacat ccaatgcggc 1200

cgtcgtgcgg acgttttcaa attttggttc atgtggaagg cgaaaggtac cgatggcctg 1260

gaggcgcacg tggacgaaaa ctttgataac gcgaagtatt tcaccgaaat gatccgtaac 1320

cgtgcgggtt ttaaactggt tctggaggaa ccggagtaca ccaacattac cttttggtac 1380

gtgccgccga gcctgcgtgg tcgtcagaac gagccggact ttaagaacaa actgcacaag 1440

gtggcgccga agatcaaaga gcgtatgatg aaagaaggta ccatgatgat tacctaccaa 1500

ccggcggacg atctgccgaa cttctttcgt ctggttctgc agaacagcag cctggaccaa 1560

aacgacatgg attatttcgt gaacgagatt gaacgtctgg gtagcgatct gtaa 1614

Claims

1.一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其特征在于，该酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其特征在于，该酶原始编码基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其特征在于，为便于在大肠杆菌中表达，该酶编码基因序列被优化如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1或2 或 3所述的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其特征在于，该酶适宜反应温度为30~40℃，适宜反应pH为6.0~8.0。

5.根据权利要求4所述的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其特征在于，该酶最适宜反应温度为37℃，最适反应pH为7.0~8.0。

6.一种如权利要求1~5中任意一项所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用，其特征在于，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶在磷酸吡哆醛作为辅酶的条件下，催化L-天冬氨酸发生脱羧反应生成β-丙氨酸。

7.根据权利要求6所述一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用，其特征在于，所述应用方法包括以下步骤：

（2）发酵培养：将1~3%工程菌接种至含卡那霉素30~60μg/mL 的TB培养基中，30~40℃培养4~5h后加诱导剂IPTG至终浓度为0.2~0.6mmol/L，并将温度降至20~28℃诱导目的蛋白的表达，继续培养16-25小时，结束发酵，收集菌体备用；

8.根据权利要求7所述一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用，其特征在于，所述步骤（1）具体步骤如下：将SEQ ID NO.3所示DNA片段利用NdeI和BamHI酶切位点克隆到表达载体pET28a(+)，得到pET28a(+)-MpADC重组质粒，将其转化到大肠杆菌感受态细胞，获得了高表达的重组大肠杆菌。

9.根据权利要求7所述一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用，其特征在于，所述步骤（3）中：

全细胞催化法生产β-丙氨酸方法如下：将发酵得到的湿菌体、底物L-天冬氨酸以及磷酸吡哆醛组成转化体系，反应得到β-丙氨酸。

10.根据权利要求9所述一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用，其特征在于，所述转化体系中磷酸吡哆醛的浓度为0-5mmol/L，反应温度为30~40℃，反应pH为6.0~8.0。