CN115820584A - 亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然α-氨基酸合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然α‑氨基酸合成中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。以苯乙醛酸为底物进行动力学参数测定，双点突变体T143G/L49G的催化效率(kcat/Km)为16.84mM‑1·s‑1，较野生型提高了2.8倍，在高底物浓度下，有效催化苯乙醛酸合成L‑苯甘氨酸，转化率可达99％。以2‑氧代‑丁酸为底物进行动力学参数测定，双点突变体T143L/V303L的催化效率(kcat/Km)为34.08mM‑1·s‑1，较野生型提高了13.4倍，在高底物浓度下，依然可以有效催化2‑氧代‑丁酸合成L‑2‑氨基丁酸，转化率可达99％。本发明中的双点突变体T143G/L49G和T143L/V303L在成功提高催化效率(kcat/Km)的基础上，仍保持野生型菌株良好的温度稳定性，更具有实际的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然α-氨基酸合成中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术
手性非天然α-氨基酸作为结构砌块和合成前体被广泛应用于多肽、药物活性成分及生物活性分子等合成。例如，L-2-氨基丁酸可用作合成抗惊厥药物Levetiracetam(左乙拉西坦)和抗结核药物Ethambutol(乙胺丁醇)的前体；L-叔亮氨酸可用作合成抗逆转录病毒药物Atazanavir(阿他那韦)的前体；L-苯甘氨酸可用合成治疗库欣综合征的多肽Pasireotide(帕西肽)；L-高苯丙氨酸是当下世界上大约20种治疗高血压药物，包括Benazepril(贝那普利)、Captopril(卡托普利)、Delapril(地拉普利)、Imidapril(咪达普利)的共同中间体。此外，非天然α-氨基酸可以很容易地转化为其他有价值的化合物，例如手性β-氨基醇分子家族。因此，作为结构砌块和合成前体的非天然α-氨基酸的绿色、高效合成具有极大的实际应用价值。
α-氨基酸脱氢酶家族能够催化α-酮酸底物直接不对称地还原胺化反应。在偶联辅酶循环系统时，α-氨基酸脱氢酶只需消耗廉价的还原剂即可一步催化α-酮酸生成α-氨基酸，其副产物仅为水，十分绿色，且其产物的光学纯度(ee值)可达99％，因此，α-氨基酸脱氢酶催化α-酮酸的不对成还原胺化反应是最具潜力的生产手性非天然α-氨基酸作的方法(图1)。
α-氨基酸脱氢酶家族中，谷氨酸脱氢酶(GluDH)具有严格的底物特异性，仅能催化侧链含有羧基的α-酮戊二酸底物生成相应的L-谷氨酸，在非天然α-氨基酸合成中应用极少；苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)可催化侧链带有苯环的α-苯丙酮酸及其衍生物制备相应的L-苯丙氨酸及其同系物，但其底物特异性同样受限于一定的范围。
亮氨酸脱氢酶(LeuDH，EC 1.4.1.9)可催化一系列脂肪族和芳香族α-酮酸直接不对称合成手性α-氨基酸，其底物范围较谷氨酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶更广泛，是一种潜在的非天然α-氨基酸的工业合成用酶。然而，野生型亮氨酸脱氢酶仅能够高效地催化其天然底物4-甲基-2-氧代戊酸合成L-亮氨酸，对一系列具有工业应用价值的非天然α-氨基酸产物的合成效率大大降低。
因此，急需获得对系列具有工业应用价值的手性非天然α-氨基酸的合成效率更高的亮氨酸脱氢酶突变体以解决现有非天然α-氨基酸合成中存在的缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种(数种)对系列具有工业应用价值的非天然α-氨基酸的合成效率高的亮氨酸脱氢酶突变体。
本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，命名为突变体T143G；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，第49位的亮氨酸突变为甘氨酸。命名为突变体T143G/L49G；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，第303位的缬氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L/V303L。
本发明还提供了编码上述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的载体。
本发明还提供了携带上述基因或上述载体的重组细胞。
在一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，表达上述亮氨酸脱氢酶突变体。
在一种实施方式中，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28(+)为表达载体。
本发明还提供了一种催化合成L-苯甘氨酸的方法，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用上述突变体T143G或突变体T143G/L49G与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L-苯甘氨酸；
或，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用表达突变体T143G或突变体T143G/L49G的重组细胞与表达葡萄糖脱氢酶的重组细胞偶联反应合成L-苯甘氨酸。
本发明还提供了一种催化合成L-2-氨基丁酸的方法，所述方法为以2-氧代-丁酸为底物，利用上述突变体T143L或突变体T143L/V303L与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L-2-氨基丁酸；
或，所述方法为以2-氧代-丁酸为底物，利用表达上述突变体T143L或突变体T143L/V303L的重组细胞与表达葡萄糖脱氢酶的重组细胞偶联反应合成L-2-氨基丁酸。
本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备非天然α-氨基酸中的应用。
在一种实施方式中，所述非天然α-氨基酸包括L-2-氨基丁酸或L-苯甘氨酸。
本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在医药领域中的应用。
有益效果：
(1)以苯乙醛酸为底物进行动力学参数测定，野生型亮氨酸脱氢酶的催化效率(kcat/Km)为6.12mM-1·s-1，双点突变体T143G/L49G的催化效率(kcat/Km)为16.84mM-1·s-1，实现了催化效率(kcat/Km)2.8倍的提高，单点突变体T143G的催化效率(kcat/Km)为15.40mM-1·s-1，实现了催化效率(kcat/Km)2.5倍的提高。
(2)以2-氧代-丁酸为底物进行动力学参数测定，野生型亮氨酸脱氢酶的催化效率(kcat/Km)为2.54mM-1·s-1，双点突变体T143L/V303L的催化效率(kcat/Km)为34.08mM-1·s-1，实现了催化效率(kcat/Km)13.4倍的提高，单点突变体T143L的催化效率(kcat/Km)为12.21mM-1·s-1，实现了催化效率(kcat/Km)4.8倍的提高。
(3)与已报道的催化苯乙醛酸合成L-苯甘氨酸的野生型亮氨酸脱氢酶相比，本发明所得的双点突变体T143G/L49G在高底物浓度下(200mmol/L)，依然可以有效催化苯乙醛酸合成L-苯甘氨酸，转化率可达99％，而在相同条件下，野生型催化苯乙醛酸时的底物转化率仅有84％。
(4)与已报道的催化2-氧代-丁酸合成L-2-氨基丁酸的野生型亮氨酸脱氢酶相比，本发明所得的双点突变体T143L/V303L在高底物浓度下(300mmol/L)，依然可以有效催化2-氧代-丁酸合成L-2-氨基丁酸，转化率可达99％，而在相同条件下，野生型催化2-氧代-丁酸时的底物转化率仅有56％。
(5)本发明获得的双点突变体T143G/L49G和T143L/V303L在成功提高催化效率(kcat/Km)的基础上，仍保持野生型菌株良好的温度稳定性，更具有实际的工业应用价值。
附图说明
图1：α-氨基酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶催化α-酮酸制备α-氨基酸流程图。
图2：突变体T143G/L49G和T143L/V303L全细胞催化苯乙醛酸和2-氧代丁酸转化率测定。
图3：突变体T143G/L49G全细胞催化合成L-苯甘氨酸ee值测定。
图4：突变体T143L/V303L全细胞催化合成L-2-氨基丁酸ee值测定。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-28a(+)质粒购自Novagen公司，葡萄糖脱氢酶(GluDH)购自Merck公司，NAD+、NADH购自索莱宝生物科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉20g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
实施例1：亮氨酸脱氢酶突变体基因序列的制备
具体步骤如下：
化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，并克隆至pET-28a(+)质粒的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，获得重组质粒pET28a-LeuDH，将重组质粒pET28a-LeuDH转化至大肠杆菌E.coli BL21获得重组大肠杆菌pET28a-LeuDH/E.coli BL21(参照文献“Jing Li,Jiang Pan,Jie Zhang,etal.Stereoselective synthesis of l-tert-leucine by a newly cloned leucinedehydrogenase from Exiguobacterium sibiricum[J].J MOL CATAL B-ENZYM,2014,105:11-17.”)。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET28a-LeuDH为模板进行定点突变，获得突变质粒pET28a-T143G、pET28a-T143L，再分别以突变质粒pET28a-T143G、pET28a-T143L为模板，获得突变质粒T143G/L49G以及T143L/V303L；
其中，突变T143G所用引物如下：
T143G-For：CATGGAAACAGACTTCGTAGSCGGTG(SEQ ID No.3)；
T143G-Rev：CACCGSCTACGAAGTCTGTTTCCATG(SEQ ID No.4)；
突变L49G(T143G/L49G突变体)所用引物如下：
L49G-For：CGGACCAGCAGBWGGCGGACTCCGTATG(SEQ ID No.5)；
L49G-Rev：CWVCTGCTGGTCCGAGTGTCGTATCATGAA(SEQ ID No.6)；
突变T143L所用引物如下：
T143L-For：CTTCGTABKKGGTGTCAGCCCGGCATTCGGAT(SEQ ID No.7)；
T143L-Rev：TGACACCMMVTACGAAGTCTGTTTCCATGTG(SEQ ID No.8)；
突变V303L(T143L/V303L突变体)所用引物如下：
V303L-For：CATCAATBKKGCCGACGAACTCGACGGG(SEQ ID No.9)；
V303L-Rev：CGTCGGCMMAATTGATGACACCTCCTGCG(SEQ ID No.10)；
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为94℃预变性4min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，并涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取20个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，测序正确即获得含有编码突变体T143G、T143G/L49G、T143L以及T143L/V303L的基因的重组大肠杆菌pET28a-T143G/E.coli BL21、pET28a-T143L/E.coli BL21、T143G/L49G/E.coli BL21、T143L/V303L/E.coli BL21。
实施例2：亮氨酸脱氢酶突变体的诱导培养与蛋白纯化
以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶为野生型，将获得的重组大肠杆菌pET28a-LeuDH/E.coli BL21以及重组大肠杆菌pET28a-T143G/E.coli BL21、pET28a-T143L/E.coli BL21、T143G/L49G/E.coli BL21、T143L/V303L/E.coli BL21分别涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃、200rpm培养6～8h，获得种子液；将种子液按照2％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于37℃、200rpm培养2～3h后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，于17℃、200rpm继续诱导培养12～17h，得到发酵液；将发酵液于4℃、8000rpm离心5min，弃上清，将沉淀用9％生理盐水洗涤菌体两遍得到野生型、突变体T143G、T143G/L49G、T143L以及T143L/V303L的湿菌体。
将湿菌体重悬于缓冲液A(100mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑，pH7.5)中并进行超声破碎，于10000rpm、4℃离心30min，获得粗酶液；用0.22μm水系滤膜过滤后缓慢加样至Ni-NAT亲和层析柱，加样完毕先用缓冲液A洗涤，再用缓冲液B(100mmol/LTris、150mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH 7.5)梯度洗脱，收集300mmol/L咪唑对应的洗脱峰，得到野生型、突变体T143G、T143G/L49G、T143L以及T143L/V303L的纯酶，随后用脱盐柱除去纯酶中的咪唑，用超滤管(截留分子量30kDa)于4000rpm下进行离心浓缩，得到野生型、突变体T143G、T143G/L49G、T143L以及T143L/V303L的浓缩纯酶。
实施例3：不同亮氨酸脱氢酶突变体对苯乙醛酸的催化效率
在NH4Cl-NH4OH缓冲液(1mol/L，pH 9.0)中加入苯乙醛酸(0.1～25mmol/L)以及NADH(0.5mmol/L)，得到反应体系；将反应体系于30℃下保温2min后加入20μl实施例2获得的野生型、突变体T143G以及T143G/L49G的浓缩纯酶开始反应，对照组中不含浓缩酶液，其他成分相同；使反应在30℃下进行5min，每隔10s记录340nm处的吸光度变化，得到野生型、突变体T143L以及T143L/V303L对苯乙醛酸的催化活性。
催化活性(U/mg)＝Ew×V/6220/L×浓缩酶液的蛋白浓度；其中，Ew为1min内340nm处的吸光度变化值；V为酶活测定反应体系的体积，单位为mL，此处为0.2；6200为摩尔消光系数，单位为L/mol/cm；L为光程距离，单位为cm，此处为0.5；浓缩酶液的蛋白浓度用Bradford蛋白试剂盒测定(Bradford蛋白试剂盒测定蛋白浓度可参考文献：Zhou-Pan X R,E Sérée,Zhou X J,et al.Involvement of Human Liver Cytochrome P450 3A inVinblastine Metabolism:Drug Interactions1[J].Cancer Research,1993,53(21):5121-5126.)，单位为mg/mL。使用Origin软件对计算得到的催化活性与对应的底物浓度进行非线性拟合，获得酶的催化效率(kcat/Km)。
结果为：野生型对苯乙醛酸的催化效率(kcat/Km)为6.12mM-1·s-1；单点突变体T143G对苯乙醛酸的催化效率(kcat/Km)为15.40mM-1·s-1；双点突变体T143G/L49G对苯乙醛酸的催化效率(kcat/Km)为16.84mM-1·s-1。
实施例4：不同亮氨酸脱氢酶突变体对2-氧代-丁酸的催化效率
在NH4Cl-NH4OH缓冲液(1mol/L，pH 9.0)中加入2-氧代-丁酸(0.1～25mmol/L)以及NADH(0.5mmol/L)，得到反应体系；将反应体系于30℃下保温2min后加入20ul实施例2获得的野生型、突变体T143L以及T143L/V303L的浓缩纯酶开始反应，对照组中不含浓缩酶液，其他成分相同；使反应在30℃下进行5min，每隔10s记录340nm处的吸光度变化，得到野生型、突变体T143L以及T143L/V303L对2-氧代-丁酸的催化活性。
催化活性(U/mg)＝Ew×V/6220/L×浓缩酶液的蛋白浓度；其中，Ew为1min内340nm处的吸光度变化值；V为酶活测定反应体系的体积，单位为mL，此处为0.2；6200为摩尔消光系数，单位为L/mol/cm；L为光程距离，单位为cm，此处为0.5；浓缩酶液的蛋白浓度用Bradford蛋白试剂盒测定，单位为mg/mL。使用Origin软件对计算得到的催化活性与对应的底物浓度进行非线性拟合，获得酶的催化效率(kcat/Km)。
结果为：野生型对2-氧代-丁酸的催化效率(kcat/Km)为2.54mM-1·s-1；单点突变体T143L对2-氧代-丁酸的催化效率(kcat/Km)为12.21mM-1·s-1；双点突变体T143L/V303L对2-氧代-丁酸的催化效率(kcat/Km)为34.08mM-1·s-1。
实施例5：不同亮氨酸脱氢酶突变体的热稳定性
将实施例2获得的野生型、双点突变体T143G/L49G以及T143L/V303L浓缩酶液在温度范围30-70℃的水浴锅中温浴30min，在30℃下测定温浴30min后的野生型、突变体T143G/L49G以及T143L/V303L对2-氧代-丁酸的催化活性，以不同温度温浴前的活性为100％，温浴后的剩余活性与之相比计算相对活性，以考察野生型、双点突变体T143G/L49G以及T143L/V303L的温度稳定性。
结果为：突变体T143G/L49G以及T143L/V303L的T50 30(温浴30min后的活性为温浴前活性一半所对应的温度)值分别为60℃以及59℃，野生型在相同条件下的T50 15值为62℃，可见，突变体T143G/L49G以及T143L/V303L在提高催化效率的基础上仍保持优异的温度稳定性。
实施例6：亮氨酸脱氢酶突变体T143G/L49G不对成还原胺化合成L-苯甘氨酸
亮氨酸脱氢酶突变体T143G/L49G通过与葡萄糖脱氢酶(GluDH)偶联用于合成L-苯甘氨酸。
反应体系体积为200ml，其中包含实施例2中获得的T143L/V303L湿菌体(4g)，GluDH湿菌体(4.8g)，苯乙醛酸(200mmol/L)，葡萄糖(240mmol/L)，NAD+(0.1mmol/L)，NH4Cl-NH4OH缓冲液(2M，pH 8.5)。
将反应混合物在30℃和200rpm条件下反应，反应期间定时取样(1mL)，样品用NaOH水溶液(200μL，10M)淬灭。
取淬灭后的样品600uL，通过液相色谱法测定反应体系中剩余的苯乙醛酸的浓度，计算底物转化率。测定条件：Diamonsil C18(2)液相色谱柱(5μm；250mm×4.6mm)；进样量，10μL；流动相A(55％甲醇加0.1％三氟乙酸)，30℃下20min；流速，0.8mL/min；波长230nm。
取淬灭后的样品600uL，通过液相色谱法测定反应体系中产物苯甘氨酸的构型和浓度，计算产物ee值。测定条件：
ODS-UG-5液相色谱柱(5μm；150mm×4.6mm)；进样量，20μL；流动相B(5％乙腈加0.1％三氟乙酸)，流动相C(60％乙腈加0.1％三氟乙酸)，线性梯度为0-100％C；30℃下45min；流速，1mL/min；波长340nm。
结果为：T143G/L49G催化200mmol/L苯乙醛酸时的底物转化率可达到99％(图2)，且产物L-苯甘氨酸的ee值可达到99％(图3)。相同条件下，野生型和突变体T143G催化200mmol/L苯乙醛酸时的底物转化率仅有84％和89％。
实施例7：亮氨酸脱氢酶突变体T143L/V303L不对成还原胺化合成L-2-氨基丁酸
亮氨酸脱氢酶突变体T143L/V303L通过与葡萄糖脱氢酶(GluDH)偶联用于合成L-2-氨基丁酸。
反应体系体积为200ml，其中包含实施例2中获得的T143L/V303L湿菌体(4g)，GluDH湿菌体(4.8g)，2-氧代-丁酸(300mmol/L)，葡萄糖(360mmol/L)，NAD+(0.1mmol/L)，NH4Cl-NH4OH缓冲液(2M，pH 8.5)。
将反应混合物在30℃和200rpm条件下反应，反应期间定时取样(1mL)，样品用NaOH水溶液(200μL，10M)淬灭。
取淬灭后的样品600uL，通过液相色谱法测定反应体系中剩余的2-氧代-丁酸的浓度，计算底物转化率。测定条件：Diamonsil C18(2)液相色谱柱(5μm；250mm×4.6mm)；进样量，10μL；流动相A(55％甲醇加0.1％三氟乙酸)，30℃下20min；流速，0.8mL/min；波长230nm。
取淬灭后的样品600uL，通过液相色谱法测定反应体系中产物2-氨基丁酸的构型和浓度，计算产物ee值。测定条件：
ODS-UG-5液相色谱柱(5μm；150mm×4.6mm)；进样量，20μL；流动相B(5％乙腈加0.1％三氟乙酸)，流动相C(60％乙腈加0.1％三氟乙酸)，线性梯度为0-100％C；30℃下45min；流速，1mL/min；波长340nm。
结果为：T143L/V303L催化300mmol/L 2-氧代-丁酸时的底物转化率可达到99％(图2)，且产物L-2-氨基丁酸的ee值可达到99％(图4)。相同条件下，而野生型和突变体T143L催化300mmol/L 2-氧代-丁酸时的底物转化率仅有56％和77％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，命名为突变体T143G；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，第49位的亮氨酸突变为甘氨酸。命名为突变体T143G/L49G；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，第303位的缬氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L/V303L。
2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的重组细胞。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体。
6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28(+)为表达载体。
7.一种催化合成L-苯甘氨酸的方法，其特征在于，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用权利要求1所述突变体T143G或突变体T143G/L49G与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L-苯甘氨酸；
或，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用表达权利要求1所述突变体T143G或突变体T143G/L49G的重组细胞与表达葡萄糖脱氢酶的重组细胞偶联反应合成L-苯甘氨酸。
8.一种催化合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法为以2-氧代-丁酸为底物，利用权利要求1所述突变体T143L或突变体T143L/V303L与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L-2-氨基丁酸；
或，所述方法为以2-氧代-丁酸为底物，利用表达权利要求1所述突变体T143L或突变体T143L/V303L的重组细胞与表达葡萄糖脱氢酶的重组细胞偶联反应合成L-2-氨基丁酸。
9.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述载体，或权利要求4所述重组细胞，或权利要求5或6所述重组大肠杆菌在制备非天然α-氨基酸中的应用。
10.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述载体，或权利要求4所述重组细胞，或权利要求5或6所述重组大肠杆菌在医药领域中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116574707A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-08-11 | 江南大学 | 一种亮氨酸脱氢酶组合突变体及其在生产l-叔亮氨酸中的应用 |
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2022
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