CN112481320A

CN112481320A - 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法

Info

Publication number: CN112481320A
Application number: CN202011449267.0A
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 周彤彤; 许国超; 韩瑞枝; 周婕妤; 董晋军
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112481320B

Abstract

本发明公开了一种催化效率高的制备(‑)γ‑内酰胺的方法应用，属于生物工程技术领域。本发明的(+)γ‑内酰胺酶来源于嗜热菌(Thermaerobacter marianensis)DSM 12885，可作为催化剂用于制备光学纯(‑)‑γ‑内酰胺。其底物耐受浓度高、催化活性高、稳定性好、立体选择性强、适用的反应条件温和、对环境友好，具有很好的应用开发前景。

Description

一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法

技术领域

本发明涉及一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法，属于生物工程及酶工程技术领域。

背景技术

γ-内酰胺作为一种重要的手性化合物，可以被用来合成抗病毒药物阿巴卡韦、帕拉米韦，还可以用于合成神经酰胺酶抑制剂，在医药化学领域的应用引起广泛关注。

γ-内酰胺酶作用于酰胺键，而非蛋白质肽键，并形成羧酸。具有立体选择性的γ-内酰胺酶可以不对称水解γ-内酰胺获得光学纯的γ-内酰胺。

(-)γ-内酰胺最初的生产工艺是利用碱性蛋白酶在水/四氢呋喃的混合溶剂中对外消旋γ-内酰胺选择性水解，底物浓度可达100g/L。1996年Nakano hiroto等人，利用脂肪酶拆分水解外消旋γ-内酰胺(Nakano hiroto et al.Tetrahedron：Asymmetry，1996，7(8)：2381-2386)。1999年，Mahmoudian等以N-乙酰基-L-苯丙氨酸为唯一碳源筛选得到了来源于假单胞菌属产生的(+)γ-内酰胺酶，该酶能够高立体选择性的拆分外消旋γ-内酰胺，但稳定性差，易丧失活性，无法对酶的性质进行表征(Mahmoudian et al.Tetrahedron：Asymmetry，1999，10(6)：1201-1206)。2000年，Wisdom等人报道筛选到一株是食酸毛单胞菌，该酶较以往鉴定的酶具有更高的稳定性，能在较高底物浓度下进行拆分反应(Microorganism，lactamase enzyme obtained therefrom,and their use，2000，UnitedStates patent,US006090616A)；但是野生菌遗传背景复杂，发酵成本高，且γ-内酰胺酶表达量有限，在全细胞催化文斯内酯拆分反应时需要添加大量细胞，限制了其在工业上的应用。2015年，郑等人发现了来源嗜热古菌的(+)γ-内酰胺酶，其最适反应温度超过100℃(Zheng G et al.Appl Biochem Biotechnol，2015，176:170–184.)，然而过高的最适温度使反应条件更为严苛，违背工业生产要求。近年来，随着海量基因组数据的公开，从数据库中挖掘具有优越性能的新的γ-内酰胺酶成为热点研究。实现γ-内酰胺酶合适的稳定、高效、可溶表达，并应用于立体选择性拆分外消旋γ-内酰胺，是工业化制备光学纯(-)γ-内酰胺的潜在方法。

由于大肠杆菌表达系统的优势，成为在工业上应用比较广泛的生产菌株，发明人课题组前期尝试将代尔夫特菌(Delftia acidovorans)来源的γ-内酰胺酶在大肠杆菌E.coli BL21中表达，但是其可溶性差，几乎以包涵体形式存在，限制了在拆分文斯内酯反应中的应用。因此，如何得到一种稳定、高效、可溶表达的γ-内酰胺酶以高效催化制备光学纯(-)γ-内酰胺成为研究的热点和难点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对已经报道的(+)γ-内酰胺酶的对底物文斯内酯的低催化效率，热稳定性差等问题，提供通过基因工程表达得到一种稳定、高效、可溶表达的γ-内酰胺酶以高效催化制备光学纯(-)γ-内酰胺的方法。

本发明首先提供了一种重组大肠杆菌，表达了来源于嗜热菌(Thermaerobactermarianensis)DSM 12885的(+)γ-内酰胺酶。

在本发明的一种实施方式中，所述(+)γ-内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述(+)γ-内酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，以pET28a、pET32a、pET41a、pQE80L、pET20b、或pBAD为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是表达(+)γ-内酰胺酶的重组大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以BL21(DE3)为宿主，以pET28a为载体，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的(+)γ-内酰胺酶。

本发明的第五个目的是提供制备所述细胞系的方法，包括如下步骤：

1)采用化学合成或PCR方法克隆编码所述(+)γ-内酰胺酶的基因TmLM；

2)将步骤1)获得的TmLM基因与质粒pET28a同时用限制性核酸内切酶BamH I和XhoI双酶切，然后使用T4 DNA连接酶进行连接，获得重组表达载体pET28a-TmLM；

3)将步骤2)获得重组表达载体pET28a-TmLM转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TmLM。

本发明还提供了一种全细胞转化制备(-)γ-内酰胺的方法，所述方法为，以上述重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物文斯内酯的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌在反应体系中的细胞浓度为1～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为：温度30～80℃，pH 6～8。

在本发明的一种实施方式中，所述文斯内酯的浓度为218g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述底物文斯内酯的浓度为5～2000mmol/L。

本发明还提供了一种酶法制备(-)γ-内酰胺的方法，利用上述重组大肠杆菌生产(+)γ-内酰胺酶，再将生产的(+)γ-内酰胺酶在含有文斯内酯的反应体系中进行反应。

所述重组大肠杆菌生产的(+)γ-内酰胺酶的方法为：将重组大肠杆菌接种至培养基中培养至OD₆₀₀达0.5～0.7，添加IPTG，在16～30℃诱导培养8～24h后离心收集菌体，并细胞破碎获得粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是LB液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，LB液体培养基含有：蛋白胨10～20g/L，酵母膏5～10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将上述重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀达0.5～0.7，在终浓度为0.1～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，16～30℃诱导培养8～24h后，即可高效表达本发明的重组(+)γ-内酰胺酶；离心收集菌体并细胞破碎获得粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述的文斯内酯的浓度为5～2000mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述的(+)γ-内酰胺酶的用量为1～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，反应条件为：pH 6～8，温度为30～80℃。

有益效果

(1)本发明实现了来源于嗜热菌(Thermaerobacter marianensis)DSM 12885的(+)γ-内酰胺酶在大肠杆菌中的可溶性表达。

(2)采用本发明提供的重组大肠杆菌，其可表达可溶性较好，催化效率高(转化率≥50％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好的(+)γ-内酰胺酶。采用本发明提供的重组大肠杆菌在全细胞催化文斯内酯拆分反应中，单位质量催化剂催化转化底物的量S/C>20，可见本发明的方法具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1：基因TmLM的PCR扩增电泳图谱；M，标记；1，基因TmLM。

图2：pET28a-TmLM重组质粒物理图谱。

图3：重组(+)γ-内酰胺酶的蛋白电泳图；M，标记；泳道1为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TmLM诱导后上清；泳道2分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TmLM诱导后沉淀。

图4：重组(+)γ-内酰胺酶TmLM的蛋白电泳图；M，标记；泳道1为TmLM纯酶。

图5：(+)γ-内酰胺酶TmLM的选择性分析液相检测图。

图6：(+)γ-内酰胺酶TmLM的热稳定性曲线图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

(+)γ-内酰胺酶酶活的检测：

反应体系为：适量酶液、10mmol·L^-1文斯内酯置于反应容器中，于30℃震荡反应30min；反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇：水(20：80)，流速为0.2～1mL·min^-1,检测波长为225nm。

酶活力单位定义(U)：在30℃下，(+)γ-内酰胺酶催化水解1μmol的γ-内酰胺所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

实施例1：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-TmLM的构建及培养

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的(+)γ-内酰胺酶TmLM。

(2)重组大肠杆菌的构建：

用限制性内切酶BamH I和Xho I将质粒pET28a和TmLM于37℃水浴中过夜双酶切，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片段(如图1所示)。37℃下，使用T4 DNA连接酶将基因TmLM与酶切过的质粒pET28a进行连接，即得重组表达载体pET28a-TmLM(如图2所示)，将构建好的重组表达载体pET28a-TmLM热转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性LB固体培养基中，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-TmLM。

(3)重组大肠杆菌的培养：

挑取步骤(2)得到的阳性克隆子于液体LB培养基中培养12h，得到种子液，将种子液按1％(v/v)的转接量转接入新鲜LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·L^-1IPTG，16℃诱导培养24小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。

将收集好的菌体悬浮于磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH 7.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(如图3所示)。

由图3可知，目的蛋白较大部分都在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中能够得到可溶表达。

实施例2：重组大肠杆菌产酶及(+)γ-内酰胺酶的分离纯化

(1)将实施例1得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-TmLM悬浮于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。

(2)(+)γ-内酰胺酶的纯化：

纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，将步骤(1)得到的粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组(+)γ-内酰胺酶。

对纯化后的蛋白进行酶活测定(文斯内酯为底物)及SDS-PAGE分析(图4)。由图4可知，镍柱纯化后，在45kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的(+)γ-内酰胺酶置换到PBS(100mmol·L^-1，pH 7.0)缓冲液中。

实施例3：(+)γ-内酰胺酶的性质

(1)在30℃，pH 7.0的条件下，按照(+)γ-内酰胺酶酶活的检测方法，反应30min后测定(+)γ-内酰胺酶对底物文斯内酯的酶活力，酶活为：2.0U·mg^–1。

(2)配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液：Tris-HCl(8.0～9.0)、磷酸钠缓冲液(pH6.0～8.0)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0～6.0)。然后以外消旋γ-内酰胺为底物，测定TmLM在不同pH缓冲液的相对酶活力，具体如表1所示。TmLM的最适反应pH为7.0～8.0，酶活力为1.4～2.0U·mg^–1。

表1 TmLM在不同pH缓冲液的相对酶活力

(3)以外消旋γ-内酰胺为底物，分别测定TmLM在不同温度(20～80℃)下的酶活，测得的最高酶活定义为100％，其他温度下测得的酶活按照相对于最高酶活的百分比计算，具体如表2所示。结果显示TmLM的最适反应温度为60～70℃，为13.5～13.7U·mg^–1。

表2 TmLM在不同温度下的相对酶活力

(4)以外消旋γ-内酰胺为底物，分别测定TmLM在不同温度(50、70、90℃)下保温不同时间后的酶活，同一温度下，保温0h测得的最高酶活定义为100％，其他时间测得的酶活按照相对于最高酶活的百分比计算。结果显示TmLM在50、70、90℃下的半衰期分别为33h、20h、4h。如图6，TmLM在50℃下保温60h后仍有30％的残余活力。

(5)测定TmLM对底物外消旋γ-内酰胺的动力学参数。酶活测定体系列举如下：磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH 7.0)，外消旋γ-内酰胺(0～100mmol·L^-1)。通过计算比酶活来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的TmLM对底物外消旋γ-内酰胺的动力学参数分别为K_m为32.2mmol·L^-1，V_max为16.2μmol·min^–1·mg^–1。

(6)测定(+)γ-内酰胺酶(TmLM)催化不同的底物的酶活力，以文斯内酯为底物测得的酶活为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表3所示。

表3 TmLM的底物谱

表3显示，TmLM能够催化辛内酰胺，其相对活力只有γ-内酰胺的6％，对底物庚内酰胺，己内酰胺，月桂精内酰胺，丁酰胺，戊酰胺的活力非常低。

(7)测定TmLM催化底物外消旋γ-内酰胺的选择性。反应体系(10mL)为：适量纯化的酶液、10mmol·L^-1外消旋γ-内酰胺。于30℃震荡反应24h。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：Daicel Chiralpack AS-H色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为230nm，流动相为乙腈：异丙醇(80：20)，流速为0.2～1mL/min。

由图5可知，该酶具有非常好的立体选择性，优先水解(+)γ-内酰胺，e.e.值可达99.9％。

实施例4(+)γ-内酰胺酶应用于文斯内酯的不对称拆分制备(-)γ-内酰胺

取5～10g所得的表达重组(+)γ-内酰胺酶细胞于磷酸盐缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入0.1～1.5mol·L^-1文斯内酯(表4)，反应液总体积为10mL。将反应置于50～70℃下，取样检测转化过程，条件如下：Daicel Chiralpack AS-H色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为230nm，流动相为乙腈：异丙醇(80：20)，流速为0.2～1mL/min。

表4 TmLM全细胞催化应用于文斯内酯不对称拆分制备(-)-γ-内酰胺

结果显示，反应周期：14h；单位质量催化剂催化转化底物的量：21.8g/g。

对比例：

具体实施方式同实施例4，区别在于，调整(+)γ-内酰胺酶为编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的(+)γ-内酰胺酶，宿主细胞为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168，结果为：e.e.：98.6％，反应周期为22.5h，单位质量催化剂催化转化底物的量：10g/g。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法

<130> BAA201260A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggggcggc cgctgatcga agtcgacccc acgcggcccg tcgaggaaca gagggaggtc 60

ttgcagaacc gctggcatcc tgacatcccg gccgttgttg aggtgcggcc tggcgacacg 120

ttcgtcgtcg agtgcctcga ctggactggt gggcaggtcc gtaacgatga cgacgcctcc 180

gacatccggg acatggactt gactcccaac catcacctga ccggccccat tgctgtccgc 240

ggggcggaac cgggagacat cctggtcgtt gacatccttg accttggtcc gcaccccaag 300

atgccatggg ggtatacggg aatcttcgcg cgatccaatg gtggtggctt tctaacggac 360

cacttcccgg aggcgcataa agcgatctgg gactttcatg gtgtgtacgc gacgtcccga 420

catgtacccg gcgtgaagat tcctgcgatt ccccacccgg gcatcttggg caccgcaccg 480

tctcaccagt tgctacagcg ttggaacgaa cgagagcgga agctcatcgc acgtgatccg 540

aaccgggtac cgcccctcgc gctgccacca gagccgcgta acgccattct cgggtcgttg 600

cgtccgggga ccccagaatt cgaccggatt gcacgggaag cggcacggac gatcccaccg 660

cgggagaacg gcggaaaccg tgacatcaag aacctcaccc gcggcgctcg tgcctacctg 720

cccgtttacg tccccggggc aaaactgacg gtcggcgacc ttcacttcac ccagggtgac 780

ggcgagatca cgttctgcgg cgccattgag atggccggct ggattgagct acacgtcgac 840

ctgatcaagg atggaatgaa taagtatggg atccggcacc cgatgttcga gccgagcccg 900

atcgagccgc ggttttcccg ttacctcgtg ttcgagggtt attcggtgga tgaagagggc 960

gaacagtact acctggaccc gcatgttgca taccgacggg cgtgtctcga agcggtccag 1020

tatctcaagg gattcggata cacgggggaa gaggcgtaca ccatcttggg ggcggcaccc 1080

gtcgaagggc gcatcagtgc gatcgtggac attccgaacg cttgttgcac gttgtggctg 1140

cccacggaga tctttgagtt tgacatccgg cccgggaccc aggggcccgt tgcgcgggtc 1200

cagggtggcc gactggcccg ggccaggtga 1230

<210> 2

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Arg Pro Leu Ile Glu Val Asp Pro Thr Arg Pro Val Glu Glu

1 5 10 15

Gln Arg Glu Val Leu Gln Asn Arg Trp His Pro Asp Ile Pro Ala Val

20 25 30

Val Glu Val Arg Pro Gly Asp Thr Phe Val Val Glu Cys Leu Asp Trp

35 40 45

Thr Gly Gly Gln Val Arg Asn Asp Asp Asp Ala Ser Asp Ile Arg Asp

50 55 60

Met Asp Leu Thr Pro Asn His His Leu Thr Gly Pro Ile Ala Val Arg

65 70 75 80

Gly Ala Glu Pro Gly Asp Ile Leu Val Val Asp Ile Leu Asp Leu Gly

85 90 95

Pro His Pro Lys Met Pro Trp Gly Tyr Thr Gly Ile Phe Ala Arg Ser

100 105 110

Asn Gly Gly Gly Phe Leu Thr Asp His Phe Pro Glu Ala His Lys Ala

115 120 125

Ile Trp Asp Phe His Gly Val Tyr Ala Thr Ser Arg His Val Pro Gly

130 135 140

Val Lys Ile Pro Ala Ile Pro His Pro Gly Ile Leu Gly Thr Ala Pro

145 150 155 160

Ser His Gln Leu Leu Gln Arg Trp Asn Glu Arg Glu Arg Lys Leu Ile

165 170 175

Ala Arg Asp Pro Asn Arg Val Pro Pro Leu Ala Leu Pro Pro Glu Pro

180 185 190

Arg Asn Ala Ile Leu Gly Ser Leu Arg Pro Gly Thr Pro Glu Phe Asp

195 200 205

Arg Ile Ala Arg Glu Ala Ala Arg Thr Ile Pro Pro Arg Glu Asn Gly

210 215 220

Gly Asn Arg Asp Ile Lys Asn Leu Thr Arg Gly Ala Arg Ala Tyr Leu

225 230 235 240

Pro Val Tyr Val Pro Gly Ala Lys Leu Thr Val Gly Asp Leu His Phe

245 250 255

Thr Gln Gly Asp Gly Glu Ile Thr Phe Cys Gly Ala Ile Glu Met Ala

260 265 270

Gly Trp Ile Glu Leu His Val Asp Leu Ile Lys Asp Gly Met Asn Lys

275 280 285

Tyr Gly Ile Arg His Pro Met Phe Glu Pro Ser Pro Ile Glu Pro Arg

290 295 300

Phe Ser Arg Tyr Leu Val Phe Glu Gly Tyr Ser Val Asp Glu Glu Gly

305 310 315 320

Glu Gln Tyr Tyr Leu Asp Pro His Val Ala Tyr Arg Arg Ala Cys Leu

325 330 335

Glu Ala Val Gln Tyr Leu Lys Gly Phe Gly Tyr Thr Gly Glu Glu Ala

340 345 350

Tyr Thr Ile Leu Gly Ala Ala Pro Val Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ile

355 360 365

Val Asp Ile Pro Asn Ala Cys Cys Thr Leu Trp Leu Pro Thr Glu Ile

370 375 380

Phe Glu Phe Asp Ile Arg Pro Gly Thr Gln Gly Pro Val Ala Arg Val

385 390 395 400

Gln Gly Gly Arg Leu Ala Arg Ala Arg

405

<210> 3

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccgaaa ccctgatcaa ggtcgatctc aaccagtccc cctacgacaa cccgcaggtg 60

cacaaccgct ggcatcccga catccccatg gcggtctggg tggagccggg cgcggagttc 120

aagctggaga cctatgactg gaccggcggc gccatcaaga acgacgacag cgccgaagac 180

gtgcgcgacg tggacctgtc caccgtccac ttcctgtccg gccccgtggg cgtcaagggc 240

gccgagcccg gcgacctgct ggtggtggac ctgctggaca tcggcgcgcg cgacgacagc 300

ctctggggct tcaacggctt tttctccaag caaaatggcg gcggcttcct ggacgagcat 360

ttcccgctgg cccagaagtc catctgggac ttccacggca tgttcaccaa gagccgccac 420

atccccggcg tcaacttcgc aggcctcatc cacccgggcc tgatcggctg cctgcccgac 480

cccaagatgc tggccagctg gaacgagcgc gagaccggcc tcatcgccac cgaccccgac 540

cgcattcccg gcctggccaa cccgcccaac gccaccaccg cccacatggg ccagatgcag 600

ggcgaggccc gcgacaaggc cgccgccgaa ggcgcacgca ccgtgccgcc gcgcgagcac 660

ggcggcaact gcgacatcaa ggacctctcg cgcggctcgc gcgtgttctt ccccgtctac 720

gtggacggcg cgggcctgag cgtgggcgac ctgcacttca gccagggcga tggcgagatc 780

accttctgcg gcgccatcga gatggccggc tgggtgcaca tgaaggtctc gctgatcaag 840

ggcggcatgg ccaagtacgg catcaagaac cccatcttca agcccagccc catgacgccc 900

aactacaagg actacctgat cttcgaaggc atctcggtgg acgaaaaggg caagcagcac 960

tacctggacg tgaccgtggc ctaccgccag gcctgcctga acgccatcga gtacctgaag 1020

aaattcggct acagcggcgc ccaggcctac tcgctgctgg gcacggcgcc cgtgcagggc 1080

cacatcagcg gcgtggtgga cgtgcccaat gcctgcgcca cgctgtggct gcccacggag 1140

atcttcgact tcgacatcaa tcccacggcc gagggaccac agaagatcat cacgggcggg 1200

gtggatctgc ccatcgccca ggacaagtaa 1230

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了嗜热菌(Thermaerobacter marianensis)DSM12885来源的(+)γ-内酰胺酶。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述(+)γ-内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述(+)γ-内酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET28a、pET32a、pET41a、pQE80L、pET20b、或pBAD为表达载体。

5.一种全细胞转化制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，以权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有文斯内酯的反应体系中反应。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌在反应体系中的细胞浓度为1～10g/L。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应条件为：温度30～80℃，pH 6～8；优选的，所述文斯内酯的浓度为218g/L。

8.一种酶法制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，应用权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌生产(+)γ-内酰胺酶，再将生产的(+)γ-内酰胺酶在含有文斯内酯的反应体系中进行反应。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌接种至培养基中，培养至OD₆₀₀达0.5～0.7，添加IPTG，在16～30℃诱导培养8～24h后离心收集菌体，并细胞破碎获得粗酶液。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的文斯内酯的浓度为5～2000mmol/L；优选的，所述的(+)γ-内酰胺酶的用量为1～10g/L；优选的，反应条件为：pH 6～8，温度为30～80℃。