CN102796720A - 拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶及应用 - Google Patents

拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶及应用 Download PDF

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朱绍洲
宋大伟
宫萃宇
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Abstract

本发明提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-酰胺酶及编码基因在手性化合物上的应用；及利用一种以大豆慢生根瘤菌生产（-）γ-内酰胺的方法。提取大豆慢生根瘤菌基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体或（+）γ内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中加入γ内酰胺底物反应、萃取获得（-）γ-内酰胺。或提取大豆慢生根瘤菌基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶，加入底物反应、萃取获得（-）γ-内酰胺。本发明中的（+）γ-内酰胺酶源于大豆慢生根瘤菌，催化效率高，得到的（-）γ-内酰胺纯度高。

Description

拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-酰胺酶及其编码基因在手性化合物上的应用。
背景技术
（-）2-氮杂双环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮（简称（-）γ-内酰胺）是合成抗病毒药物如阿巴卡韦的重要中间体，获得高光学纯度的（+/-）γ-内酰胺是限制上述多种抗病毒药物、及代谢调节药物生产成本降低、及产量提高的主要因素之一。目前，γ-内酰胺酶是一种新型的酰胺酶，能够催化酰胺类化合物的酰胺键水解。(+)γ-内酰胺酶能够高效拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物阿巴卡韦((-)abacavir)的重要中间原料，具有巨大的经济价值。与化学合成法相比，生物催化具有的反应条件温和，特异性高，低能耗，底物专一性，重复使用，催化效率高等优点,已代替某些化学合成法投入应用；微生物酶法拆分外消旋体γ-内酰胺具有良好的应用前景。
Figure BDA00002021670700011
中国专利申请“一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用”（申请号：201010210197.3，公开号：CN101921742A）中公开一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用，其是来源于氧化烃微杆菌的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因，还提供了该(+)γ-内酰胺酶水解拆分消旋体γ-内酰胺的应用。利用该(+)γ-内酰胺酶水解拆分消旋体γ-内酰胺可以获得光学纯度为99.5％的(-)γ-内酰胺，收率大于39％。
但是，目前的科研和实践中，尚未将大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum）体内的（+）γ-酰胺酶及其编码基因克隆和表达并应用于获得高纯度（-）γ-内酰胺。
发明内容
本发明提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-酰胺酶及其编码基因在手性化合物上的应用；以及利用一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶，所述的（+）γ-内酰胺酶是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）其氨基酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:1；
（b）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ IDNo:1衍生的蛋白质。
一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶编码基因，所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因是如下（a）或（b）的基因：
（a）、其核苷酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:2；
（b）、编码序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
一种重组表达载体、一种转基因细胞系、一种宿主菌，均含所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的克隆和表达，制备得到（+）γ内酰胺酶的方法；以及所述的（+）γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用方法。
所述的（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的克隆和表达方法为：提取大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；
所述的（+）γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用为：
将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体或（+）γ内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得（-）γ-内酰胺。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；
B、振荡培养：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种接种到根瘤菌培养基中，进行振荡培养，得到发酵液；
C、收集菌体：将所述的发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液的混合，得到稀释发酵液；将所述的稀释发酵液进行离心处理，收集沉淀；将该沉淀用所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行洗涤处理，回收得到湿菌体；
D、生物拆分实验：将所述的湿菌体与(+/-)γ-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；将所述的菌体混合液进行振荡培养，得到振荡后的菌液；
E、分离样品：将所述的振荡后的菌液以进行离心处理，得到上清液，即为所述的（-）γ-内酰胺。
本发明用于转化生产（-）γ-内酰胺的微生物是一种大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，菌种保藏号CGMCC：1.2550），该菌种具有如下的性质：
1、形态生理生化特征：
A、形态特征：杆菌，菌落呈乳白色，微小（直径<1毫米），圆形，细胞外有很厚的粘液层。
B、生理生化特征：革兰氏阴性细菌，产γ-内酰胺水解酶。
2．采用的培养基：
A、根瘤菌保藏培养基：酵母提取物1.0‰，碳源1.0%，土壤提取液20%，甘油25%；土壤提取液：25%土壤，加去离子水，105kPa蒸煮1小时,过滤后加水补足到蒸煮前体积；以上均为质量/体积百分比，将上述组分溶于去离子水，以NaOH调pH值为7.2，105kPa灭菌30min。
B、根瘤菌发酵培养基：酵母提取物1.0‰；碳源1.0%；土壤提取液20%；土壤提取液：25%土壤,加去离子水,105kPa蒸煮1小时,过滤后加水补足到蒸煮前体积；以上均为质量/体积百分比，将上述组分溶于去离子水，以NaOH调pH值为7.2，105kPa灭菌30min。
3、培养条件：
A、培养温度：25~35℃，更适宜温度：28℃。
B、培养方式：有氧条件下发酵培养。
本发明相比现有技术具有如下有益效果：
本发明中的（+）γ-内酰胺酶源于大豆慢生根瘤菌，催化效率高，得到的（-）γ-内酰胺纯度高。
附图说明
图1是实施例4、实施例5的外消旋γ-内酰胺的手性HPLC图谱。
图2是实施例4的γ-内酰胺手性HPLC图谱。
图3是实施例5的γ-内酰胺手性HPLC图谱。
图4是实施例2中的大豆慢生根瘤菌基因组为模板PCR扩增BJA基因的DNA电泳图。
图5是实施例2中重组BJA基因表达的SDS-PAGE电泳图。
图6是实施例2中重组BJA拆分外消旋γ-内酰胺HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1：
本实施例为一种大豆慢生根瘤菌体内、具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶。
所述的（+）γ-内酰胺酶（BJA）是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）其氨基酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:1；
（b）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ IDNo:1衍生的蛋白质。
一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶编码基因，是如下（a）或（b）的基因：
（a）、其核苷酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:2；
（b）、编码序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
一种重组表达载体，含有所述的（+）γ-内酰胺酶编码基因。
一种转基因细胞系，含有所述的（+）γ-内酰胺酶编码基因。
一种宿主菌，含有所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因。
本实施例中的（+）γ-内酰胺酶的克隆和表达方法参见实施例2。
实施例2：
本实施例为通过实施例1中的（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的克隆和表达，制备得到（+）γ内酰胺酶的方法；以及所述的（+）γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用方法。
所述的（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的克隆和表达方法如下：
A、基因组提取：
a.将保藏于-80℃的大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）菌种取出，以0.2%的体积比接种到根瘤菌发酵培养基中，进行振荡培养，得到菌液；所述的振荡培养的温度为30℃，时间为120小时，转速为220rpm；
所述的根瘤菌发酵培养基的原料包括：酵母提取物1g，甘露醇10g，土壤提取液20ml，蒸馏水800ml；
所述的土壤提取液的原料包括：土壤50g，去离子水200ml；所述的土壤提取液的制备方法为：将所述的土壤与去离子水混合，于105kPa蒸煮1小时，过滤后再另加入蒸馏水补足到蒸煮前体积，得到所述的土壤提取液；
所述的根瘤菌发酵培养基的制备方法为：将所述的酵母提取物、甘露醇、土壤提取液溶于蒸馏水，以NaOH调PH值为7.2，于105kPa灭菌30min，得到所述的根瘤菌发酵培养基；
b.将所述的菌液进行离心处理，转速为12000rpm，时间为15min，收集沉淀，该沉淀即为用于提取DNA的菌体；
c.将所述的菌体进行DNA提取处理，得到大豆慢生根瘤菌基因组DNA；所述的DNA提取处理采用细菌基因组提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNAKit）提取，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行；
B、引物设计：
根据已知的大豆慢生根瘤菌基因组DNA序列设计引物，引物序列如下（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；
BJA上游引物：
5’-GGAATTCCATATGGTGACAGTTGTCCTTCC-3’，下划线表示NdeⅠ酶切位点；
BJA下游引物：
5’-CCCAAGCTTTCACATCTTCTTCCAGTCGCC-3’，下划线表示HindⅢ酶切位点；
C、PCR扩增及基因克隆：
a.以所述的大豆慢生根瘤菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系(25μl)为：模板：1μl，10×PCR Buffer：2.5μl，上下游引物：各1μl，dNTP（2.5mM）：1μl，Taq酶（5U/μl）：1μl，ddH2O：补至25μl；
b.PCR扩增反应条件为：第一步：热变性95℃，5分钟；第二步：热变性95℃，30秒；第三步退火53℃，1分钟；第四步延伸72℃，1分钟；第五步延伸72℃，10分钟。第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束之后进行电泳检测，再进行回收处理，得到目的片段；所述的回收处理采用回收试剂盒（QIAGEN），操作方法按照试剂盒提供的说明书进行；
图4为大豆慢生根瘤菌基因组为模板PCR扩增（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的DNA电泳图；图4中，泳道1、2中为BJA基因的PCR产物；泳道M为DNA分子量标准。
b.将所述的目的片段用T4连接酶进行连接处理到T载体上，再进行转化处理到E.coli DH5α中，得到转化产物；将所述的转化产物进行蓝白斑筛选，再进行单菌落PCR，根据电泳结果挑选测序条带，将测序成功的单菌落37℃培养，并进行质粒中提处理，得到T-BJA质粒；
D、pET30BJA质粒载体构建：
将所述的T-BJA质粒分别用NdeⅠ和HindⅢ进行酶切处理，再与相同酶切处理后的pET30质粒进行连接反应，得到构建好的载体为pET30BJA质粒载体；
E、重组蛋白表达
a.将所述的pET30BJA质粒载体通过热激法导入大肠杆菌E.coli BL-21（DH3），得到转化子E.coli BL-21-pET30BJA；
b.将所述的转化子E.coli BL-21-pET30BJA接种到LB液体培养基（含有卡那霉素30μg/mL）的试管中，37℃过夜培养，然后接种到50mlLB培养基（含卡那霉素30μg/mL）中，37℃培养3-4个小时，再加入60μl、500mol/l的IPTG于30℃过夜诱导表达，得到诱导后的菌液；
c.将所述的诱导后的菌液进行离心处理，转速为12000rpm，时间为15min，收集沉淀，该沉淀即为用于提取重组蛋白的重组菌体；
d.将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体悬浮在磷酸缓冲液（pH=7）中，进行超声破碎处理、离心处理，分别收集上清液和沉淀，以备SDS-PAGE检验蛋白诱导表达效果；本步骤中收集到的上清液即为所述的（+）γ内酰胺酶（pETBJA）；
所述的超声破碎处理中，功率为227W，超声2秒，间隔4.5秒，超声50分钟；所述的离心处理中，转速为12000rpm，时间为15min；。
图5为重组BJA基因表达的SDS-PAGE电泳图；图5中，泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：pETBJA诱导前空白；泳道2：pETBJA诱导后表达；
所述的重组（+）γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用如下。
应用方法之一：
将7mg所述的用于提取重组蛋白的重组菌体悬浮在450μl、50mmol、pH6.0~8.5的磷酸缓冲液中，加入50μl浓度为5g/L的γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；
将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；
将所述的上清液中加入250μl乙酸乙酯萃取，取上层100μl进行HPLC检测，获得光学纯度为99.8%的（-）γ-内酰胺。
应用方法之二：
将100μl所述的（+）γ内酰胺酶悬浮在450μl、50mmol、pH6.0~8.5的磷酸缓冲液中，加入50μl浓度为5g/L的γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；
将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；
将所述的上清液中加入250μl乙酸乙酯萃取，取上层100μl进行HPLC检测，获得光学纯度为99.8%的（-）γ-内酰胺。所述的HPLC检测中，
色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；乙腈与异丙醇的体积比为9:1；流速为0.6ml/min；检测波长为230nm。
图6为重组（+）γ内酰胺酶拆分外消旋γ-内酰胺HPLC图谱；图6中，A为消旋体γ-内酰胺的HPLC分析图谱；B为酶拆分获得的（-）γ-内酰胺HPLC分析图谱；其中，1为乙酸乙酯溶剂峰，2为（+）γ-内酰胺，3为（-）γ-内酰胺。
实施例3：
本实施例为一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法。
该方法包括如下步骤：
A、菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；所述的大豆慢生根瘤菌菌种保藏于-80℃；
B、振荡培养：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种以0.2%的体积比接种到根瘤菌培养基中，进行振荡培养，得到发酵液；所述的振荡培养的温度为20℃~30℃，时间为4~7天，转速为200-250rpm；
所述的根瘤菌培养基包括的原料为：氮源0.1%，碳源1%，土壤提取液20%，去离子水足量；
所述的土壤提取液的包括的原料为：土壤25%，去离子水75%；所述的土壤提取液的制备方法为：将所述的土壤与去离子水混合，于105kPa蒸煮1小时，过滤后再另加入去离子水补足到蒸煮前体积，得到所述的土壤提取液；
所述的根瘤菌培养基的制备方法为：将所述的氮源、碳源、土壤提取液溶于去离子水，以NaOH调PH值为7.2，于105kPa灭菌30min，得到所述的根瘤菌发酵培养基；
以上配比均为质量/体积百分比；
所述的根瘤菌培养基的原料中，所述碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种的混合物，优选为甘露醇；所述氮源包括胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合物，优选为酵母提取物。
C、收集菌体：将所述的发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液混合，得到稀释发酵液；所述的发酵液与所述的pH值为7.0磷酸盐缓冲液的体积比为1：5；将所述的稀释发酵液进行离心处理，转速为9000~11000rpm，时间为10-15min，收集沉淀；将该沉淀用所述的pH值为7.0磷酸盐缓冲液进行洗涤处理，回收得到湿菌体，作为生物催化剂使用；
所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.05mol/l的Na2HPO4溶液和0.05mol/l的NaH2PO4溶液混合而成，所述的Na2HPO4溶液和NaH2PO4溶液的体积比为7:3。
D、生物拆分实验：将所述的湿菌体与1-5g/L(+/-)γ-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；所述的湿菌体与(+/-)γ-内酰胺溶液的质量/体积百分比为4~14%；所述的(+/-)γ-内酰胺为分析纯，购自苏州开元民生科技股份有限公司；
将所述的菌体混合液进行振荡培养，得到振荡后的菌液；所述的振荡培养的温度为25℃~45℃，pH值7.0~10.0条件下，转速为200~220rpm，时间为1~4天；
E、分离样品：将所述的振荡后的菌液进行离心处理，转速为8000~12000rpm，时间为10~15分钟，得到上清液，即为所述的（-）γ-内酰胺样品。
F、HPLC测定：取500μL所述的（-）γ-内酰胺样品与200μL乙酸乙酯充分震荡混合，使目标产物被萃取到乙酸乙酯中，得到萃有目标产物的乙酸乙酯；再取10μL所述的萃有目标产物的乙酸乙酯进样，利用手性HPLC测定（+）γ-内酰胺及（-）γ-内酰胺的含量，得到ee值和（-）γ-内酰胺的产率。
实施例4：
本实施例为一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法，是在实施例3中方法基础上的优选方案，改进之处在于：
B步骤中，所述的振荡培养的温度为28℃，时间为4天，转速为220rpm；所述的根瘤菌发酵培养基的原料中，所述碳源为甘露醇，所述氮源为酵母提取物；
C步骤中，将所述的稀释发酵液进行离心处理，转速为11000rpm，时间为10min，收集沉淀；
D步骤中，将所述的湿菌体与1g/L(+/-)γ-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；所述的湿菌体与(+/-)γ-内酰胺溶液的质量/体积百分比为14%；
所述的振荡培养的温度为45℃，pH值9.0条件下，转速为220rpm，时间为2天；
E步骤中，将所述的振荡后的菌液进行离心处理，转速为12000rpm，时间为10min，得到上清液，即为所述的（-）γ-内酰胺样品。
F步骤中，利用手性HPLC测定（+）γ-内酰胺及（-）γ-内酰胺的含量，得到ee值为96%，（-）γ-内酰胺的产率为48%。
图1是外消旋γ-内酰胺的手性HPLC图谱，作为空白手性HPLC图谱；图1中，1号峰为溶剂乙酸乙酯，2号峰为（+）γ-内酰胺，3号峰为（-）γ-内酰胺。
图2是γ-内酰胺手性HPLC图谱；图2中，1号峰为溶剂乙酸乙酯，2号峰为（+）γ-内酰胺，3号峰为（-）γ-内酰胺。
实施例5：
本实施例为一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法，是在实施例3中方法基础上的优选方案，改进之处在于：
B步骤中，所述的振荡培养的温度为28℃，时间为4天，转速为220rpm；所述的根瘤菌发酵培养基的原料中，所述碳源为甘露醇，所述氮源为酵母提取物。
C步骤中，将所述的稀释发酵液进行离心处理，转速为11000rpm，时间为10min，收集沉淀；
D步骤中，将所述的湿菌体与5g/L(+/-)γ-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；所述的湿菌体与(+/-)γ-内酰胺溶液的质量/体积百分比为14%；
所述的振荡培养的温度为45℃，pH值9.0条件下，转速为220rpm，时间为2天；
E步骤中，将所述的振荡后的菌液进行离心处理，转速为12000rpm，时间为10min，得到上清液，即为所述的（-）γ-内酰胺样品。
F步骤中，利用手性HPLC测定（+）γ-内酰胺及（-）γ-内酰胺的含量，得到ee值为96%，（-）γ-内酰胺的产率为48%。
图1是外消旋γ-内酰胺的手性HPLC图谱，作为空白手性HPLC图谱；图1中，1号峰为溶剂乙酸乙酯，2号峰为（+）γ-内酰胺，3号峰为（-）γ-内酰胺。
图3是的γ-内酰胺手性HPLC图谱；图3中，1号峰为溶剂乙酸乙酯，2号峰为（+）γ-内酰胺，3号峰为（-）γ-内酰胺。
实施例2至实施例5中，所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中（（美〕J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版）。
实施例2至实施例5中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品，HPLC采用岛津-高效液相色谱仪（Essentia LC-15C）。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Figure IDA00002021671600011
Figure IDA00002021671600031
Figure IDA00002021671600041

Claims (10)

1.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶，其特征在于：
所述的（+）γ-内酰胺酶是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）其氨基酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:1；
（b）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ ID No:1衍生的蛋白质。
2.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶编码基因，其特征在于：
所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因是如下（a）或（b）的基因：
（a）、其核苷酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:2；
（b）、编码序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于：含有权利要求2中所述的（+）γ-内酰胺酶编码基因。
4.一种转基因细胞系，其特征在于：含有权利要求2中所述的（+）γ-内酰胺酶编码基因。
5.一种宿主菌，其特征在于：含有权利要求2中所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因。
6.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶的编码基因的应用，其特征在于：
提取大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；
将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体悬浮在的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得（-）γ-内酰胺。
7.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶的编码基因的应用，其特征在于：
提取大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；
将所述的（+）γ内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得（-）γ-内酰胺。
8.一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；
B、振荡培养：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种接种到根瘤菌培养基中，进行振荡培养，得到发酵液；
C、收集菌体：将所述的发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液的混合，得到稀释发酵液；将所述的稀释发酵液进行离心处理，收集沉淀；将该沉淀用所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行洗涤处理，回收得到湿菌体；
D、生物拆分实验：将所述的湿菌体与(+/-)γ-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；将所述的菌体混合液进行振荡培养，得到振荡后的菌液；
E、分离样品：将所述的振荡后的菌液以进行离心处理，得到上清液，即为所述的（-）γ-内酰胺。
9.根据权利要求8所述的生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：所述的根瘤菌培养基的碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种的混合物；所述的根瘤菌培养基的氮源包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合物。
10.根据权利要求8所述的生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.05mol/l的Na2HPO4溶液和0.05mol/l的NaH2PO4溶液混合而成，所述的Na2HPO4溶液和NaH2PO4溶液的体积比为7:3。
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