CN103966192B - 一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（-）γ-内酰胺酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（-）γ-内酰胺酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有拆分消旋体γ‑内酰胺活性的(‑)γ‑内酰胺酶及其编码基因与应用，其是来源于大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA6)的(‑)γ‑内酰胺酶及其编码基因，还提供了该(‑)γ‑内酰胺酶水解拆分消旋体γ‑内酰胺的应用。本发明所述(‑)γ‑内酰胺酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体γ‑内酰胺活性的由SEQ ID No:1衍生的蛋白质。利用该(‑)γ‑内酰胺酶水解拆分消旋体γ‑内酰胺，其拆分活性接近100％，进而利用催化产物氨基酸制备(‑)γ‑内酰胺。

Description

一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（-）γ-内酰胺酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(-)γ-内酰胺酶及其编码基因，以及该(-)γ-内酰胺酶的应用。
背景技术
(-)2-氮杂双环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮(简称(-)γ-内酰胺)是制备抗病毒药物阿巴卡韦及抗流感药物帕拉米韦等重要的中间体。相比化学合成方法具有过程繁琐且易造成环境污染的缺点，生物酶法在合成手性(-)γ-内酰胺的过程中具有高效简便、环境友好等诸多优点。
(-)γ-内酰胺酶能够水解拆分消旋γ-内酰胺的酶。(-)γ-酰胺酶属于酰胺酶的一种，而酰胺酶又是腈水解酶家族中的一种酶，能有效的断裂酰基基团中的碳氮键形成游离的酸和氨。(-)γ-内酰胺酶能够手性拆分消旋γ-内酰胺得到(+)2-氮杂双环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮(简称(+)γ-内酰胺)和对应的氨基酸，利用催化产物氨基酸可以进一步合成具有重要应用价值的(-)γ-内酰胺。目前对(-)γ-内酰胺酶的研究较少，却存在对消旋γ-内酰胺底物的拆分选择性不高、选用的酶不稳定等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(-)γ-内酰胺酶及其编码基因。该(-)γ-内酰胺酶具有绝对选择性，可用于消旋体γ-内酰胺的拆分，利用催化产物氨基酸进一步合成(-)γ-内酰胺，制备手性药物中间体。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明所提供的(-)γ-内酰胺酶以下简称为B-J，来源于大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA6)CGMCC NO.1.2250。
(-)γ-内酰胺酶B-J是如下(a)或(b)的蛋白质；
(a)一种包含SEQ ID No:1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)一种包含SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ ID No:1衍生的蛋白质。
其中，序列表中的SEQ ID No:1由274个氨基酸残基组成。
上述(-)γ-内酰胺酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一：
(a)序列表中SEQ ID No:2所示的核苷酸序列；
(b)编码序列表中SEQ ID No:1蛋白质序列的多核苷酸。
其中，序列表中的SEQ ID No:2由825个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第825位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明所述的(-)γ-内酰胺酶B-J是通过如下方法制备的：
A.以大豆慢生根瘤菌基因组为模板设计引物，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增基因，将扩增片段进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳后回收800bp条带，即为目的片段；
B.目的片段用T4连接酶连接到T载体上，转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，转化产物涂到蓝白斑平板，其中培养基加入40μl5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)，8μl500mol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37°过夜培养；
C.之后进行单菌落PCR，根据电泳结果挑选测序条带，将测序成功的单菌落37°培养，并进行质粒中提。用NdeⅠ和HindⅢ内切酶对目的片段和载体pET30进行酶切，电泳分别回收目的片段和载体片段；
D.将目的基因用T4连接酶连接到载体pET30上，再次转化到E.coli DH5α中，转化产物涂到含卡那霉素的平板上37°过夜培养；
E.之后进行单菌落PCR，根据电泳结果挑选测序条带，将测序成功的单菌落37°培养，并进行质粒中提，即得到构建好的重组质粒；
F.将构建好的表达载体导入宿主细胞，用60μl500mol/LIPTG诱导表达得到(-) γ-内酰胺酶B-J。
本发明所述的(-)γ-内酰胺酶B-J还可以通过化学合成(-)γ-内酰胺酶B-J的编码基因，通过常规基因操作手段将此化学合成的基因构建到表达载体，并导入大肠杆菌宿主细胞得到转化子，培养该转化子，表达得到(-)γ-内酰胺酶B-J。
用于构建含有上述γ内酰胺酶编码基因的重组表达载体都可以为基因工程领域中的质粒表达载体，可行的载体包括pET系列载体，pUC系列载体，pGEX系列载体等。宿主细胞选择与上述表达载体相应的宿主，如大肠杆菌E.coli BL-21(DH3)等。表达后的蛋白可以进一步利用公认已知的纯化方法进行纯化。
附图说明
图1以大豆慢生根瘤菌基因组为模板PCR扩增B-J的DNA电泳图
图2重组B-J的表达及纯化SDS-PAGE图
图3重组B-J拆分外消旋γ-内酰胺HPLC图谱
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
(一)本发明(-)γ-内酰胺酶B-J基因的获得
(1)(-)γ-内酰胺酶B-J基因组从大豆慢生根瘤菌中提取。
(2)引物设计
根据已知的基因序列设计引物，引物序列如下(由上海生工合成)；
B-J上游引物：
5’-ggaattccatatgatgcccaccatcaccaccaa-3’
下划线表示NdeⅠ酶切位点
B-J下游引物：
5’-cccaagcttcgccttgaagaacgccagcagg-3’
(3)PCR扩增及基因克隆
以基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：1μl基因组DNA，2.5μl10×PCR Buffer，上下游引物各1μl，1μl dNTP(2.5mM)，1μlTaq酶(5U/μl)，用ddH2O补至25μl。PCR条件为：第一步热变性95°，5分钟；第二步热变性95°，30秒；第三步退火53°，1分钟；第四步延伸72°，1分钟；第五步延伸72°，10分钟。第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束之后琼脂糖凝胶电泳检测(见附图1，泳道1，B-J PCR 产物；泳道M，DNA分子量标准)。
PCR产物经胶回收试剂盒(QIAGEN)，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行，回收800bp左右条带；回收条带用T4连接酶连接到T载体上，转化到E.coli DH5α中，转化产物进行蓝白斑筛选，单菌落PCR，根据电泳结果挑选测序条带，将测序成功的单菌落37°培养，并进行质粒中提。质粒分别用NdeⅠ和HindⅢ酶切，连入相同酶切的pET30质粒。构建好的载体为pET30B-J。
(二)重组蛋白表达和纯化
将构建好的质粒pET30B-J通过热激法导入大肠杆菌E.coli BL-21(DH3)，获得转化子E.coli BL-21(pET30B-J)。将转化子接种到LB液体培养基(含有卡那霉素)的试管中，37°过夜培养，然后接种到50mlLB培养基(含卡那霉素)中，37°培养3-4个小时，加入60μl500mol/L IPTG30°过夜诱导表达。离心收集菌体，将菌体悬浮在磷酸缓冲液中，超声破碎(227W，超声2秒，间隔4.5秒，超声30分钟)。12000rpm离心，收集上清液。
纯化过程采用Ni-NTA亲和柱层析方法：上清液加入1mlNi-NTA亲和柱，结合后用10ml上样缓冲液(Tris20mM，NaCl250mM)洗涤，再用10ml洗杂缓冲液(Tris20mM，NaCl250mM，咪唑20mM，pH7.4)将杂蛋白从纯化柱上洗去，之后加入10ml洗脱缓冲液(Tris20mM，NaCl250mM，咪唑200mM，pH7.4)进行洗脱。洗脱后的蛋白用20mM Tris HCl缓冲液透析，透析后的蛋白冷冻干燥后收集。SDS-PAGE检测表明蛋白的纯度在95％以上(见附图2，泳道M，蛋白分子量标准；泳道1，pET30B-J诱导前空白；泳道2，pET30B-J诱导后全细胞表达；泳道3，pET30B-J细胞破碎后上清表达；泳道4，pET30B-J细胞破碎后沉淀；泳道5，Ni-NTA纯化后蛋白)。
(三)重组γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
γ内酰胺酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；乙腈：异丙醇9:1；流速为0.6ml/min；检测波长为230nm。
将重组大肠杆菌菌体悬浮在450μl磷酸缓冲液中，加入50μlγ内酰胺底物，37°反应24小时。反应混合物离心，上清加入250μl乙酸乙酯萃取，(+)γ-内酰胺被萃取进入有机相，生成的氨基酸留在水相。取上层100μl进行HPLC检测，拆分活性大于99％(见 附图3，A消旋体γ-内酰胺的HPLC分析图谱；B酶拆分获得的(+)γ-内酰胺HPLC分析图谱；其中，1乙酸乙酯溶剂峰，2(+)γ-内酰胺3(-)γ-内酰胺)。
实施方式所采用的试剂盒仪器如未作特殊说明均为市场常规产品。
实施方式中所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(-)γ-内酰胺酶，是由序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的(-)γ-内酰胺酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述(-)γ-内酰胺酶的编码基因具有编码序列表中SEQ ID No:1蛋白质序列的多核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述的(-)γ-内酰胺酶编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的(-)γ-内酰胺酶编码基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的(-)γ-内酰胺酶编码基因的宿主菌。
7.根据权利要求1所述的(-)γ-内酰胺酶在拆分消旋体γ-内酰胺，利用催化产物氨基酸进一步获得(-)γ-内酰胺的应用。
8.根据权利要求2或3所述的(-)γ-内酰胺酶编码基因在拆分消旋体γ-内酰胺，利用催化产物氨基酸进一步获得(-)γ-内酰胺的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述应用为：将含(-)γ-内酰胺酶基因的重组大肠杆菌菌体悬浮到pH6.0-pH8.5的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37°转化24小时，拆分消旋γ-内酰胺，得到催化产物氨基酸，进行一步制备(-)γ-内酰胺。
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