CN104293744B - 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 - Google Patents
来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104293744B CN104293744B CN201410409072.1A CN201410409072A CN104293744B CN 104293744 B CN104293744 B CN 104293744B CN 201410409072 A CN201410409072 A CN 201410409072A CN 104293744 B CN104293744 B CN 104293744B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- reaction
- lipase
- carboxyethyl
- cyano group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 241001136490 Thermomyces dupontii Species 0.000 title claims abstract description 12
- AYXYPKUFHZROOJ-ZETCQYMHSA-N pregabalin Chemical compound CC(C)C[C@H](CN)CC(O)=O AYXYPKUFHZROOJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229960001233 pregabalin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 45
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 23
- 125000000143 2-carboxyethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 6
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 claims description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- XCKNAZREWFWIPE-VEDVMXKPSA-N 2-[(1S)-1-cyano-3-methylbutyl]pentanedioic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](C#N)C(C(O)=O)CCC(O)=O XCKNAZREWFWIPE-VEDVMXKPSA-N 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000349750 Baphia nitida Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 description 1
- 101000984201 Thermomyces lanuginosus Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- MHPUGCYGQWGLJL-UHFFFAOYSA-N dimethyl pentanoic acid Natural products CC(C)CCCC(O)=O MHPUGCYGQWGLJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 1
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/002—Nitriles (-CN)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突变体,所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示,所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸,或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸;本发明提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活力2~5倍,可用于工业化生产(3S)‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸,用于进一步合成普瑞巴林。
Description
(一)技术领域
本发明涉及脂肪酶编码基因的克隆和利用基因突变技术制备脂肪酶突变体的方法,所获得的突变体及其在普瑞巴林手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用。
(二)背景技术
脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3),系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerol acylhydrolase),是一类既能催化酯水解,又具有催化酯合成、转酯化、氨解、醇解等反应的酶,在食品、洗涤、饲料、有机合成和生物能源等领域应用广泛(Curr.Opin.Biotech.2002,13:390-397)。脂肪酶催化的反应除具有选择性高、副反应少,产物光学纯度高等特点外,还具有催化反应条件温和、绿色环保等优势。这使得脂肪酶在光学纯化合物特别是手性药物的制备中具有独特的优势,已成为制备光学纯手性药物的重要技术手段(Coord.Chem.Rev.2008,252:659-701.)。
普瑞巴林(Pregabalin)是一种新型γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂,能有效阻断电压依赖性钙通道,减少神经递质的释放,具有良好的抗焦虑和神经痛治疗效果(Angew.Chem.Int.Edit.2008,47:3500-3504)。由于疗效显著和适应症的扩大,普瑞巴林的销售额逐年递增,2013年达到45.95亿美元,列全球最畅销药物榜第13位,市场潜力巨大。2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)被脂肪酶/酯酶选择性水解,其产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要手性中间体。该中间体经脱羧、碱性水解、氢化即得到普瑞巴林(Org.Process Res.Dev.2008,12:392-398)。但目前只有来源于Novozymes公司的即商品化Thermomyces lanuginosus脂肪酶能满足工业化生产的需要。因此,开发能够高效拆分CNDE的新催化剂具有重要意义。
热稳定酶一般具有较强的溶剂稳定性,具有很好的生物技术和工业应用潜力(Environ.Technol.2010,31:1159-1167)。近年来,从嗜热菌中获得热稳定酶已成为学术和工业界的研究热点。嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)是一类分布广泛,生长温度上限较高的嗜热真菌,已成为具有工业应用价值热稳定酶的重要来源。
随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展,运用分子改造的手段对酶分子进行改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止,这项技术已被成功用于改造各种各样的酶,取得了令人瞩目的进展(Curr.Opin.Struct.Biol.2011,21:473-480)。分子改造广泛应用于脂肪酶催化活力、底物特异性、热稳定性和对映体选择性等性质的改造。
(三)发明内容
本发明目的在于通过定点饱和突变技术对嗜热踝节菌的脂肪酶进行改造,提供脂肪酶突变体,其对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的水解活力明显提高,从而有利于该脂肪酶在普瑞巴林中间体制备中的应用。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列。本发明的再一目的在于将本发明的突变体应用于选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明采用的技术方案是:
本发明通过对来源于T.thermophilus ATCC 20186脂肪酶基因进行克隆表达,利用全质粒PCR技术对含有脂肪酶基因的表达载体进行定点饱和突变,构建突变文库,利用基于真实底物的96孔板高通量筛选方法进行筛选,获得了一系列对CNDE活力明显提高且对映体选择性严格的脂肪酶突变体,这些突变体能以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物,在室温和较高的温度下高效生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。最终本发明提供一种来源于嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体,所述来源于嗜热踝节菌(T.thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示,核苷酸序列为SEQ ID No.1所示,所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸(氨基酸序列为SEQ ID No.4所示,核苷酸序列为SEQ ID No.3所示),或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸(氨基酸序列为SEQ ID No.6所示,核苷酸序列为SEQ ID No.5所示),优选所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸(氨基酸序列为SEQ IDNo.6所示,核苷酸序列为SEQ ID No.5所示)。
本发明还涉及一种所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用,具体所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源,以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物,以Ca(OAc)2为螯合剂(用于解除产物抑制剂),以水或缓冲液(优选Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成pH值为6.0~8.0(优选pH值为7.0)的转化体系,30~60℃、150~500r/min条件下(优选40℃、500r/min)进行转化反应,反应结束后,取反应液分离纯化,获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始浓度为0.1~3.0mol/L转化体系(优选1mol/L),所述催化剂的用量以湿菌体质量计,终浓度为10~50g/L转化体系(优选50g/L),Ca(OAc)2终浓度为50~180mmol/L转化体系(优选150mmol/L)。
本发明所述湿菌体按如下方法制备:将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150r/min培养12h,再以体积浓度1%接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养至菌体浓度OD600为0.4~0.8,再向培养液中加入终浓度为0.1~1.0mM(优选0.1mM)的IPTG,28℃诱导培养10h,取培养物离心,收集沉淀即获得湿菌体。LB液体培养基组成为(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,溶剂为去离子水,pH值为7.0;LB平板培养基组成为(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,琼脂15,溶剂为去离子水,pH值为7.0。
本发明所述分离纯化的方法为:反应结束后,将反应液离心除去菌体,取上清液减压蒸馏至原1/3体积,将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取(除去残留底物),取萃取层减压蒸馏至干(去除残留甲苯和水),得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明所述的脂肪酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用,也可以是未经纯化的粗酶形式使用,也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。如果需要,还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
此外,本发明的突变体较亲本活力大幅提高,即使使用该酶的粗提物或者工程菌全细胞,反应也会以较高的速率进行。此外,本发明的突变体可以在相对较高的温度例如40-60℃下用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,从而进一步合成普瑞巴林。
本发明的有益效果主要体现在:本发明提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活力提高2~5倍,可用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,用于进一步合成普瑞巴林。
(四)附图说明
图1为实施例4中工程菌诱导表达的SDS-PAGE分析;其中泳道M为蛋白质分子量Marker,泳道1~3分别为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL,E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T,泳道4~6为IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL,E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T。
图2为实施例6中脂肪酶突变体S63M/S83T全细胞催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(1.0M)制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸反应进程曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:亲本基因的扩增及表达载体的构建
采用RT-PCR的方法从Talaromyces thermophilus ATCC 20186(购自美国典型微生物菌种保藏中心,American Type Culture Collection)中获得脂肪酶基因。根据文献报道的Talaromyce thermophilus CTM10.103脂肪酶基因序列(GenBank accessionno.JF414585)设计引物TTL-F和TTL-R(见表1),采用RT-PCR的方法从T.thermophilus ATCC20186中分离脂肪酶基因。采用TRIzol法提取T.thermophilus ATCC 20186总RNA,使用Promega公司的GoScriptTM逆转录试剂盒进行cDNA第一链的的制备,反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。以cDNA第一链为模板,在引物TTL-F和TTL-R作用下,利用PCR方法扩增脂肪酶cDNA序列。PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL):10×Pfu DNA polymerasebuffer 10μL,10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL,浓度为50μM的引物TTL-F和TTL-R各0.5μL,cDNA 1μL,Pfu DNA聚合酶2μL,无核酸水85μL。采用Biometra的TProfessional PCR仪,PCR反应条件为:预变性94℃3min,然后进入温度循环94℃30s,58℃30s,72℃1min,共30个循环,最后72℃延伸10min。0.9%琼脂糖凝胶电泳表明PCR产物大小约800bp。利用Axygen的PCR Cleanup Kit回收该PCR产物,经限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切与经同样限制性内切酶酶切处理的表达载体pET-28b(+)连接,构建含有脂肪酶基因的表达重组质粒pET28-TTL,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),涂布于含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板,37℃培养过夜。随机挑取10个单克隆进行菌落PCR鉴定,挑取一个阳性克隆进行测序证实。经DNA测序证实,确定该被克隆的亲本脂肪酶的核苷酸序列,即序列表中的SEQ ID No.1,相应的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No.2,获得脂肪酶工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TTL。
实施例2:脂肪酶位点83的定点饱和突变
定点饱和突变技术参考(Current Protocols in Protein Science26.6.1-26.6.10,2011;Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述,阳性突变子的高通量筛选技术参考(Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述。具体过程如下:
为了将亲本氨基酸序列中的第83位点的Ser进行饱和突变,设计突变引物S83-F和S83-R(见表1),以实施例1构建的质粒pET28-TTL为模板,进行全质粒PCR。PCR扩增体系为:5×PS buffer 10μL,dNTP(2.5mM each)4μL,突变引物S83-F和S83-R各0.5μL,质粒pET28-TTL 0.5μL,PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL,补水至50μL。PCR条件为98℃预变性2min,25个循环:98℃10s,65℃10s,72℃6min,最后72℃10min。经0.9%琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后,取PCR反应液20μL,加入1μL DpnⅠ,37℃酶切2h去除模板质粒DNA,65℃灭活10min,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),涂布含终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板,37℃培养过夜,获得约500个克隆的突变体库。挑取单菌落于装有LB培养基的96孔培养板,37℃培养至OD600约为0.6,加入终浓度0.1mM IPTG,28℃诱导10h。96孔板离心机上4,000g,15min离心,弃上清,加入100μL磷酸钾缓冲液(pH 7.2,10mM)重悬菌体。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物,以0.01%溴百里香酚蓝为指示剂,以突变前的工程菌细胞为参照,在96孔板上初筛活力提高的阳性克隆,根据反应体系颜色变化(蓝色→黄色)的速度进行粗筛,筛选出变色速度快于对照菌株的克隆。筛选出的阳性克隆再经活力测定验证,从阳性克隆中抽提质粒,经DNA测序确定引入的点突变,活力最高的阳性克隆DNA测序显示83位的Ser突变成了Thr(S83T),获得脂肪酶突变体工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T。突变体S83T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.3,其中一种编码基因序列见序列表中的SEQ ID No.4。
实施例3:对脂肪酶突变体S83T位点58的定点饱和突变
定点饱和突变技术参考(Current Protocols in Protein Science26.6.1-26.6.10,2011;Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述,阳性突变子的高通量筛选技术参考(Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述。具体过程如下:
在脂肪酶突变体S83T的基础上对位点58的Ser进行饱和突变,设计突变引物S58-F和S58-R(见表1),以质粒pET28-S83T为模板(见实施例2),进行全质粒扩增。PCR体系为:5×PS buffer 10μL,dNTP(2.5mM each)4μL,突变引物S58-F和S58-R各0.5μL,质粒pET28-S83T0.5μL,PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL,补水至50μL。PCR条件为98℃预变性2min,25个循环:98℃10s,65℃10s,72℃6min,最后72℃10min。经0.9%琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后,取PCR溶液20μL,加入1μL DpnⅠ,37℃酶切2h去除模板质粒DNA,65℃灭活10min,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),涂布含卡那霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板,37℃培养过夜,获得约500个克隆的突变体库。位点58的饱和突变库的筛选同实施例2,不同是所用对照为实施例2获得的S83T突变体细胞。筛选出的阳性克隆再经活力测定证实后从阳性克隆中抽提质粒,经DNA测序确定引入的点突变,活力最高的阳性克隆DNA测序显示58位的Ser突变成了Met(S58M),获得脂肪酶突变体工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T。突变体S58M/S83T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.5,其编码基因序列见序列表中的SEQ ID No.6。
表1:引物
注:N=A/G/C/T,K=G/T,M=A/C.
实施例4:亲本脂肪酶和脂肪酶突变体工程菌诱导表达
将E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL(见实施例1)、E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T(见实施例2)和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T(实施例3)分别接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150r/min培养12h,再以1%接种量(v/v)转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右,再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷),28℃诱导培养10h,诱导完成取样进行SDS-PAGE分析(图1),表明诱导后目的蛋白大量表达。取样后的培养物于4℃、8000×g离心10min,收集菌体细胞,可用于酶活测定和生物催化制备普瑞巴林中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
实施例5:亲本脂肪酶和脂肪酶突变体的活性测定
以携带空质粒的宿主菌E.coli BL21(DE3)/pET28为对照,对实施例4中获得的突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T和出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL培养获得湿菌体分别测定活力。反应体系组成:100mMTris-HCl(pH7.5),100mM 2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯,50mM Ca(OAc)2和20g/L的湿细胞,40℃、150r/min反应1h,取样200μL,并加50μL、1M的HCl水溶液终止反应,用乙酸乙酯萃取,取上层有机相用无水硫酸钠干燥后,采用气相色谱测定转化率和产物的对映体过量值(ee)。采用外标定量法来测定转化液中2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯、(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的含量。各成分的量用气相色谱岛津GC-14C测定,色谱柱类型:G-TA毛细管柱;色谱条件:柱温135℃,进样室温度220℃,FID检测器温度220℃,载气为高纯氦,流量为1mL/min,分流比为30:1。酶活单位(U)定义为:在40℃、pH 7.5条件下,在1min内催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成1μmol(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U。TTL及其突变体活力见表2,突变体活力较亲本明显提高,其中双突变体S58M/S83T的活力是亲本的545%,且突变后对映体选择性没有改变,ee保持在98%的水平。
表2:脂肪酶突变体与亲本脂肪酶的活力比较
实施例6:脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(一)
转化体系组成及转化操作如下:200mL反应体系中,加入98mL水,脂肪酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28-S58M/S83T湿菌体(见实施例4)10g,Ca(OAc)25.2g(150mM),底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯51g(底物浓度1.0M,即255g/L);反应条件:40℃、500rpm,反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0,期间取样用手性气相色谱监测反应进程(见图2),气相色谱检测条件同实施例5。由图2可知,终浓度50g/L的TTL脂肪酶突变体S58M/S83T湿菌体能催化1M的CNDE选择性水解,反应24h,转化率达到46.1%,并获得ee值为99%以上的产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。反应24h后,离心除去大肠杆菌细胞后,上清液减压蒸馏至1/3体积,将浓缩物离心后收集上清液,加入1/3体积的甲苯萃取除去残留底物,再减压蒸馏去除残留甲苯和水,得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(e.e.>99%)。
实施例7:脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(二)
转化体系组成及转化操作如下:底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯添加量为0.5mol/L,E.coli BL21(DE3)/pET28-S58M/S83T湿菌体(见实施例4)添加量为50g/L,Ca(OAc)2150mmol/L;反应条件:40℃、500rpm,反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0,期间取样用手性气相色谱监测反应进程,直至反应终点,气相色谱检测条件同实施例5。反应10h,转化率达到45.8%,产物e.e.>99%,后续处理同实施例6。
实施例8:脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(三)
转化体系组成及转化操作如下:底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯添加量为3.0mol/L,E.coli BL21(DE3)/pET28-S58M/S83T湿菌体(见实施例4)添加量为50g/L,Ca(OAc)2150mmol/L;反应条件:40℃、500rpm,反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0,期间取样用手性气相色谱监测反应进程,直至反应终点,气相色谱检测条件同实施例5。反应60h,转化率达到44.7%,产物e.e.>99%,后续处理同实施例6。
实施例9:脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(四)
转化体系组成同实施例6,所不同的是所用催化剂为表达单点突变体S83T的细胞,即E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T湿菌体,色谱检测条件同实施例5,转化操作条件同实施例6。反应48h,转化率达到46.9%,并获得ee值为99%以上的产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。反应结束的后续处理同实施例6。
本发明不受上述具体文字描述的限制,本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变,这些改变菌在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体,所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示,其特征在于所述脂肪酶突变体是将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。
2.一种权利要求1所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用,其特征在于所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源,以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物,以Ca(OAc)2为螯合剂,以水或缓冲液为反应介质构成pH值为6.0~8.0的转化体系,30~60℃、150~500r/min条件下进行转化反应,反应结束后,取反应液分离纯化,获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述底物的初始浓度为0.1~3.0mol/L反应体系,所述酶源的用量以湿菌体质量计,终浓度为10~50g/L反应体系,Ca(OAc)2终浓度为50~180mmol/L反应体系。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150r/min培养12h,再以体积浓度1%接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养至菌体浓度OD600为0.4~0.8,再向培养液中加入终浓度为0.1~1mM的IPTG,28℃诱导培养10h,取培养物离心,收集沉淀即获得湿菌体。
5.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述分离纯化的方法为:反应结束后,将反应液离心,取上清液减压蒸馏至原1/3体积,将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取,取萃取层减压蒸馏至干,得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410409072.1A CN104293744B (zh) | 2014-08-19 | 2014-08-19 | 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410409072.1A CN104293744B (zh) | 2014-08-19 | 2014-08-19 | 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104293744A CN104293744A (zh) | 2015-01-21 |
CN104293744B true CN104293744B (zh) | 2017-04-12 |
Family
ID=52313701
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410409072.1A Active CN104293744B (zh) | 2014-08-19 | 2014-08-19 | 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104293744B (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106591258B (zh) * | 2016-09-14 | 2019-06-04 | 新余学院 | 一种脂肪酶基因、载体、工程菌及其应用 |
CN108239626B (zh) * | 2016-12-27 | 2022-10-04 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 一种高酯化活力的脂肪酶突变体 |
CN106676084B (zh) * | 2017-02-09 | 2019-11-29 | 浙江工业大学 | 一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其应用 |
CN112048492B (zh) * | 2019-06-06 | 2023-12-22 | 尚科生物医药(上海)有限公司 | 一种酯水解酶突变体 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
CN118272341A (zh) * | 2022-12-21 | 2024-07-02 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 突变的脂肪酶 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2302043A3 (en) * | 1998-11-27 | 2011-07-20 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
ES2629334T3 (es) * | 2006-01-23 | 2017-08-08 | Novozymes A/S | Variantes de lipasa |
CN101454459A (zh) * | 2006-05-31 | 2009-06-10 | 特瓦制药工业有限公司 | 酶拆分在普加巴林的中间体制备中的用途 |
ES2603979T3 (es) * | 2008-02-29 | 2017-03-02 | Novozymes A/S | Polipéptidos con actividad lipásica y polinucleótidos que codifican los mismos |
US20100087525A1 (en) * | 2008-06-23 | 2010-04-08 | Lilach Hedvati | Stereoselective enzymatic synthesis of (s) or (r)-iso-butyl-glutaric ester |
CN102465157B (zh) * | 2010-11-04 | 2014-11-26 | 浙江九洲药业股份有限公司 | 生物酶法制备普瑞巴林手性中间体 |
CN103045559B (zh) * | 2012-10-23 | 2014-05-14 | 浙江工业大学 | 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用 |
-
2014
- 2014-08-19 CN CN201410409072.1A patent/CN104293744B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104293744A (zh) | 2015-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104293744B (zh) | 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 | |
WO2019154249A1 (zh) | 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用 | |
CN103045559B (zh) | 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用 | |
KR20090005052A (ko) | 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 효소적 제조 방법 | |
CN108118035B (zh) | 一种环己酮单加氧酶及其应用 | |
CN104962533B (zh) | 一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用 | |
CN109182298B (zh) | 一种重组脂肪酶突变体、工程菌及应用 | |
CN112626057B (zh) | 一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用 | |
CN103981160B (zh) | 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用 | |
CN106591258B (zh) | 一种脂肪酶基因、载体、工程菌及其应用 | |
CN106244569B (zh) | 一种酯酶EstC10及其编码基因和应用 | |
CN106754818B (zh) | 一种耐热酯酶突变体及其制备方法和应用 | |
CN111454918B (zh) | 一种烯醇还原酶突变体及其在制备(r)-香茅醛中的应用 | |
CN110358751B (zh) | 一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用 | |
CN106676084B (zh) | 一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其应用 | |
CN107177569A (zh) | 一种菜豆环氧化物水解酶及其异源表达方法 | |
CN105296513B (zh) | 一种海洋酯酶及其编码基因e22与应用 | |
CN103992992A (zh) | 硫磺矿硫化叶菌中(+)γ-内酰胺酶的编码基因及应用 | |
KR101426441B1 (ko) | 두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 ccmp637 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산의 생산방법 | |
CN105132394B (zh) | 一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用 | |
CN106119224B (zh) | 一种酯酶EstP00714及其编码基因和应用 | |
CN107287172B (zh) | 一种利用大肠杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法 | |
CN105238769B (zh) | 一种脂肪酶lipase7及其编码基因和应用 | |
CN108330114B (zh) | 一种利用epa的甘油二酯酰基转移酶及其应用 | |
CN108753810B (zh) | 一种转录调节蛋白基因orf2的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |