CN101454459A - 酶拆分在普加巴林的中间体制备中的用途 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供了酶拆分在普加巴林的中间体，包括(3S)－氰基－5－甲基己酸及其盐和R－(－)－3－(氨基甲酰基甲基)－5－甲基己酸及其盐制备中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求了如下美国临时申请序列的优先权：Nos.60/809,978，2006年5月31日提交；60/831,591，2006年7月17日提交；60/836,730，2006年8月9日提交；60/860,360，2006年11月20日提交；60/879,870，2007年1月10日提交；60/919,201，2007年3月20日提交，以及60/926,059，2007年四月23日提交，它们都被引入作为参考。
发明领域
本发明包括酶拆分在普加巴林的中间体，包括(3S)-氰基-5-甲基己酸及其盐和R-(+)-3-(氨基甲酰基甲基)-5-甲基己酸及其盐制备中的用途。
发明背景
(S)-普加巴林(Pregabalin)，(S)-(+)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸，是一种具有如下化学结构的化合物，
其又名γ-氨基丁酸或(S)-3-异丁基GABA。已经发现(S)-普加巴林能够激活GAD(L-谷氨酸脱羧酶)。(S)-普加巴林对癫痫具有剂量依赖性保护效应，并且是一种CNS-活性化合物。(S)-普加巴林能够用于抗惊厥治疗中，原因是其活化了GAD，促进GABA的产生，该GABA是一种脑部主要的抑制性神经递质，其在30％的脑部突出中释放。
(S)-普加巴林的非不对称制备公开在美国专利No.5,616,793和DRUGS OF THE FUTURE，24(8)，862-870(1999)中，并且是通过获得中间体(±)3-(氨基甲酰基甲基)-5-甲基己酸(“CMH”或“CMH-外消旋物”)进行的，然后将其光学拆分从而得到R-(+)3-(氨基甲酰基甲基)-5-甲基己酸(“R-CMH”)，然后将其转化为(S)-普加巴林，如以下方案1中所描述。
方案1：
另一种非不对称方法报道在美国专利No.5,637,767中，其中(S)-普加巴林的制备是通过如下步骤实现的，将如下结构的产物II水解和脱羧：
从而得到如下结构的3-氰基-5-甲基己酸乙酯(“II-CN-单酯”)
其进一步经过氢化从而获得如下结构的外消旋普加巴林(“PRG-外消旋物”)：
接着通过光学拆分从而获得普加巴林的S-对映异构体。
美国公开No.2005/0283023描述了中间体(3S)-氰基-5-甲基己酸(“(S)-普加巴林腈”或“S-PRG-腈”)的制备，其是通过酶动力学拆分氰基-二烷基酯，接着将拆分的对映异构体转化成多种中间体，然后将其转化成S-PRG-腈而实现的。
仍然需要其它方法用于制备普加巴林的中间体，尤其是S-PRG-腈及其盐和R-CMH及其盐。
发明概述
在一个实施方式中，本发明包括一种制备下式I的普加巴林中间体的方法：
所述方法包括在缓冲剂和任选地碱的存在下酶水解下式II的酯，
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基；并且M是金属。
在另一个实施方式中，本发明包括一种制备下式I的普加巴林中间体的方法：
所述方法包括：a)将下式II的酯、水解酶、缓冲剂和任选地碱混合，从而获得混合物；
和b)将该混合物保持在约5℃到约60℃的温度下，从而获得式I的普加巴林中间体，其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基；并且M是金属。
在另一个实施方式中，本发明包括一种制备下式I-CN的普加巴林中间体的方法：
所述方法包括：a)通过将其与碱性氢氧化物混合而将下式的(±)-2-羧基烷基-3-氰基-5-甲基己酸烷基酯脱羧
从而获得下式II-CN-单酯的酯；
II-CN-单酯
b)分离所获得的式II-CN-单酯化合物；c)将式II-CN-单酯化合物、水解酶、缓冲剂和任选地碱混合，从而获得混合物；c)将该混合物保持在约5℃到约60℃的温度下，从而获得下式I-CN的化合物；
其中R’是C1-6烃基；并且M是金属。
在另一个实施方式中，本发明包括一种制备下式I-酸的普加巴林中间体的方法
I-酸
所述方法包括酶酯化下式III的化合物，
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基并且R”是氢或C1-6烃基。
在另一个实施方式中，本发明包括一种制备下式I-酸的普加巴林中间体的方法
I-酸
所述方法包括将下式III的化合物，
醇或酯与酶混合，从而获得式I-酸的普加巴林中间体，其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基并且R”是氢或C1-6烃基。
在另一个实施方式中，本发明包括一种制备(S)-普加巴林的方法，其包括通过上述方法任意一项制备式I或式I-酸的普加巴林中间体，然后将该普加巴林中间体转化成(S)-普加巴林。
发明详述
如本文中所使用的，除非另有定义，术语“PRG”指的是普加巴林。
如本文中所使用的，除非另有定义，术语“外消旋物”指的是含有等量对映异构体的混合物。
本发明包括通过酶拆分制备普加巴林中间体的方法，其中所述方法是一种动力学拆分方法。优选地，本发明包括通过酶拆分制备普加巴林中间体S-PRG-腈及其盐和R-CMH及其盐的方法。所述方法可以通过以下一般方案2得到举例说明。
方案2：
1、水解
酯 对映异构体A 对映异构体B
2、酯化
酸 对映异构体A 对映异构体B
所述拆分是一种酶拆分，其可以通过水解或酯化而进行。
众所周知，由于存在于它们的活性位点上的氨基酸不同的原因，酶的功能都是非常特殊的。同时，酶是手性的并且具有不对称结合位点，该不对称性导致酶的立体特异性，这使得其在结合一种对映异构体时会具有选择性。此外，由于它们的结构在反应期间没有发生变化，所以酶可以循环使用，进而，由于从反应混合物中分离酶是简单的，所以使用酶可以简化方法。
用对这些中间体进行光学拆分来代替对普加巴林外消旋物进行拆分的好处是明显的，因为可以容易地循环不期望的对映异构体，而循环不期望的普加巴林对映异构体是非常困难的。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备式I的普加巴林中间体的方法，其可以通过以下方案3进行举例说明。
方案3：
酯
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基；R’是C1-6烃基；并且M是金属，其中所述金属是通过缓冲剂或碱提供的。优选地，所述CH2CONR”2是CH2CONH2。优选地，所述CH2CO2R’是CH2CO2Me，CH2CO2Et，CH2CO2-乙烯基，CH2CO2-丙基或CH2CO2-异丙基，更优选为CH2CO2Me，CH2CO2Et或CH2CO2-乙烯基。最优选地，R是CN或CH2CONH2。优选地，所述C1-6烃基是C1-3烃基，更优选为乙基或甲基。优选地，M是碱金属，更优选为钾或钠。
所述方法包括：(a)将式II的酯与水解酶、缓冲剂和任选地碱混合，从而获得混合物；和(b)将该混合物保持在约5℃到约60℃的温度下，从而获得式I的普加巴林中间体，其中所述金属是通过缓冲剂或碱提供的。所述缓冲剂和碱优选含有相同的金属。
所述方法使用了水解酶，即通过仅与式II酯的一种对映异构体反应提供式I的手性普加巴林中间体而进行立体选择水解反应的酶。因而，式I的手性普加巴林中间体可以通过动力学拆分而被选择性制备。
当R是CN并且R’是乙基时，式II的化合物是如下结构的(±)-3-氰基-5-甲基己酸-乙酯(“II-CN-单酯”)：
I-CN-单酯
并且当R是CN，M是Na时，式I的化合物是如下结构的S-PRG-腈钠(“I-CN-Na”)：
I-CN-Na
当R是CH2CONH2并且R’是乙基时，式II的化合物是如下结构的(±)3-(氨基甲酰基甲基)-5-甲基己酸乙酯(“II-酰胺-单酯”)：
II-酰胺-单酯
并且当R是CH2CONH2，M是Na时，式I的化合物是如下结构的R-CMH-钠(“I-酰胺-Na”)：
I-酰胺-Na
优选地，所述水解酶是酯酶，脂肪酶或蛋白酶。优选地，所述酯酶选自大肠杆菌(E.Coli)中的酯酶PF2重组体，大肠杆菌中的酯酶BS1重组体，大肠杆菌中的酯酶BS2重组体，大肠杆菌中的酯酶BS2CLEA重组体，大肠杆菌中的酯酶BS3重组体，大肠杆菌中的酯酶BS4重组体，来自猪肝脏中的酯酶PL，大肠杆菌中的酯酶SD重组体，酯酶RO和米曲霉(Aspergillus oryzae)中的酯酶TL重组体。
优选地，所述脂肪酶选自来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的脂肪酶，来自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶P2，来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的脂肪酶PS，来自酒曲酶属(Rhizopus sp.)的脂肪酶RS，来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶PF，来自卡门柏青霉(Penicilliumcamenbertii)的脂肪酶PC，来自洋葱假单胞菌的脂肪酶P1，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶AN，来自无色菌属(Achromobacter sp.)的脂肪酶A，来自产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)的脂肪酶AS1，来自产碱杆菌属的脂肪酶AS2，来自圆柱假丝酵母(Candida cylindracea)的脂肪酶C2，来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C1，脂肪酶lipozym TL IM，脂肪酶lipozym TL 100L，南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)，CHIRAZYME E-1猪肝酯酶，来自假单胞菌属L-6的脂肪酶，南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)，皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(L-3)，胰脂肪酶USP Grade，脂肪酶QLM和脂肪酶TL。
优选地，所述蛋白酶是胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)。
更优选地，所述水解酶是CALB，CHIRAZYME E-1猪肝酯酶，大肠杆菌中的酯酶BS3重组体或来自猪肝的酯酶PL。
一般地，酶是与缓冲剂结合使用的。所述缓冲剂提供了适合于酶活性的pH。优选地，所述缓冲剂是以足以提供约6到约9，更优选约6.5到约8，更优选为约7的pH的量存在的。
一般地，加入碱是用来帮助控制步骤a)混合物的pH的。所述碱可以是碱金属氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或碱土金属氢氧化物。优选地所述碱是碱金属的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐，更优选地，所述碱是碱金属氢氧化物，最优选为NaOH或KOH。
一般地，首先将水解酶、缓冲剂和任选地碱混合，接着加入式II的酯从而获得混合物。式II的酯可以是外消旋物或者是对映异构体任意比例的混合物。可以向缓冲剂中加入共溶剂以促进底物的溶解。适宜的共溶剂包括，但不限于亚砜，酰胺，醇，酮和腈。优选地，所述亚砜是C2-4亚砜，更优选为二甲基亚砜(“DMSO”)。优选地所述酰胺是C3-6酰胺，更优选为二甲基甲酰胺(“DMF”)。优选地，所述醇是C1-6醇，更优选为异丙醇。优选地所述酮是C2-6酮，更优选为丙酮。优选地，所述腈是C1-5腈，更优选为乙腈。
优选地，在搅拌下保持所述混合物，从而获得式I的普加巴林中间体，更优选地，保持所述混合物约8到约32小时，甚至更优选约24小时。优选地，在约20℃到约27℃的温度下，更优选地在约22℃到约25℃的温度下搅拌所述混合物。
式I的普加巴林中间体可以通过本领域普通技术人员已知的任意方法回收。这样的方法包括，但不限于，萃取。
由此制备的式I的普加巴林中间体可以任选地被转化成下式I-酸的中间体
I-酸
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基；R’是C1-6烃基。所述转化可以通过包括将式I的中间体与无机酸混合的方法进行，所述无机酸选自HBr、H2SO4、H3PO4和HCl。优选地，所述无机酸是HCl。
由此制备的式I或式I-酸的普加巴林中间体可以被转化成(S)-普加巴林。所述转化可以按照例如美国公开No.2007/0073085或美国专利No.5,637,767中所公开的方法而进行，在此它们都被引入作为参考。
在一个优选的实施方式中，当R式CN时，式II的酯(“II-CN-单酯”)可以通过将(±)-2-羧基烷基-3-氰基-5-甲基己酸烷基酯(“PRG-腈二酯”)脱羧来制备。该方法可以通过以下方案4得到举例说明。
方案4：
PRG-腈二酯 II-CN-单酯
其中R’是C1-6烃基。优选地，所述C1-6烃基是C1-3烃基，更优选为乙基或甲基。
所述方法包括：(a)将PRG-腈-二酯和碱性氢氧化物混合从而获得具有II-CN-单酯的混合物；和(b)从混合物中分离II-CN-单酯。
一般地，所述PRG-腈-二酯和碱性氢氧化物是在溶剂的存在下被混合的。优选地，所述溶剂选自水，极性有机溶剂，以及它们的混合物。优选地，所述极性有机溶剂是极性质子有机溶剂。优选地，所述极性质子有机溶剂是C1-5醇。优选地，所述C1-5醇是C1-3醇，更优选为C1-2醇。优选地，所述C1-2醇是甲醇或乙醇。
优选地，所述碱性氢氧化物是氢氧化钾。
优选地，将PRG-腈-二酯和碱性氢氧化物的混合物加热，从而将PRG-腈-二酯脱羧并且获得具有II-CN-单酯的混合物。优选地，将所述混合物加热到约60℃到约180℃的温度，更优选地为约80℃到约140℃的温度。优选地，将所述混合物加热约8到约24小时。
由此制备的II-CN-单酯可以通过本领域普通技术人员已知的任意方法分离。这样的方法包括，但不限于，用溶剂从混合物中萃取出II-CN-单酯并且蒸发溶剂。优选地，所述II-CN-单酯是通过如下方法回收的，所述方法包括：冷却混合物；除去溶剂；向所获得的有机相中加入选自二氯甲烷(“DCM”)，乙醚，乙酸乙酯和乙腈的溶剂；用水萃取有机相，并且从有机相中除去溶剂，从而获得II-CN-单酯的残余物。优选地，将混合物冷却到约40℃到约10℃的温度。所述溶剂可以通过减压蒸发而除去。优选地，所述溶剂是DCM。
分离的II-CN-单酯是结构如下的对映异构体混合物：
该混合物可以以任意比例含有所述对映异构体。优选地，该混合物是对映异构体的外消旋混合物。
任选地，II-CN-单酯的分离残余物是可以被纯化的。优选地，所述残余物是通过蒸馏进行纯化的。优选地，所述蒸馏是在约1到约10mmHg的压力下，在约80℃到约100℃的温度下进行的。
然后可以将II-CN-单酯转化成式I-CN的化合物，如以下方案5所示。
方案5：
II-CN-单酯 I-CN
如上所述，该转化可以通过如下方法进行，所述方法包括将式II-CN-单酯化合物、水解酶、缓冲剂和任选地碱混合，从而获得混合物；和将该混合物维持在约5℃到约60℃的温度下。
由此获得的I-CN可以被转化成(S)-普加巴林。所述转化可以例如按照美国专利No.5,637,767中所描述的方法进行。
在另一个实施方式中，本发明包括一种制备式I-酸的普加巴林中间体的方法，其可以通过以下方案6得到举例说明。
方案6：
III I-酸
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基。优选地，所述CH2CONR”2是CH2CONH2。优选地，所述CH2CO2R’是CH2CO2Me、CH2CO2Et、CH2CO2-乙烯基、CH2CO2-丙基或CH2CO2-异丙基，更优选为CH2CO2Me、CH2CO2Et或CH2CO2-乙烯基。最优选地，R是CN或CH2CONH2。优选地，所述C1-6烃基是C1-3烃基，更优选为乙基或甲基。
所述方法包括：将式III的化合物、醇或酯与酶混合，从而获得式I-酸的普加巴林中间体。
当R是CN时，式III的化合物是如下结构的(±)-3-氰基-5-甲基己酸(“III-CN-酸”)。
III-CN-酸
并且式I-酸的化合物是如下结构的S-PRG-腈(“I-CN-酸”)。
I-CN-酸
当R是CH2CONH2时，式III的化合物是如下结构的CMH(“III-酰胺-酸”)。
III-酰胺-酸
并且式I-酸的化合物是如下结构的R-CMH(“I-酰胺-酸”)。
I-酰胺-酸
一般地，式III化合物，醇或酯以及酶是在溶剂的存在下混合物的。优选地，所述溶剂是有机溶剂。优选地，所述有机溶剂选自芳香烃，醚，酮，腈，氯代烃，酰胺，以及它们的混合物。优选地，所述芳香烃是C6-8芳香烃，更优选为甲苯，优选的醚是C2-8直链、支链或环状醚。更优选的C2-8直链、支链或环状醚是C2-6直链、支链或环状醚，最优选的C2-8直链、支链或环状醚是二异丙基醚，甲基叔丁基醚或四氢呋喃。优选地，所述酮是C2-8酮。更优选的C2-8酮是C2-4酮，最优选的C2-8酮是甲基乙基酮，甲基异丁基酮或丙酮。优选地，所述腈是C2-5腈，更优选为乙腈。优选地，所述氯代烃是C1-4氯代烃，更优选为二氯甲烷或四氯化碳。优选地，所述酰胺是C3-6酰胺，更优选为二甲基甲酰胺。最优选的有机溶剂是甲苯、甲基叔丁基醚或甲苯和丙酮的混合物。
一般地，式III的起始化合物是结构如下的对映异构体混合物：
该混合物可以以任意比例含有对映异构体。优选地，该混合物是所述对映异构体的外消旋混合物。
所述酶是适合于酯化或酯交换反应的任意的酶。优选地，所述酶是水解酶，更优选为酯酶，脂肪酶或蛋白酶。优选地，可以用于该反应中的酶是如上所述的。
优选地，所述醇选自甲醇，乙醇，丙醇和正丁醇，以及它们的混合物。优选地，所述酯是乙酸乙烯酯或丁酸乙烯酯。
一般地，将式III化合物、醇或酯以及酶的混合物保持在约5℃到约70℃的温度下，从而获得式I-酸的普加巴林中间体。优选地，将所述混合物保持在约25℃到约37℃的温度下。优选地，将所述混合物保持约2到约96小时，更优选为约48小时。
所述酯或醇可以以对应于式III起始酸的化学计算量使用，或者以过量的量使用，这样其还可以作为溶剂。当以化学计算量使用时，所述酯或醇与式III的化合物是以约1摩尔酯或醇比约1摩尔式III化合物的比例使用的。优选地，所述酯或醇以过量的量使用。优选地，所述醇或酯与式III起始酸的摩尔比分别为约3到约10。优选地，所述比例分别为约2:1到约3:1。
在此期间，所述酶以选择性的方式与式I-酸化合物的S-对映异构体结合，由此促进了S-对映异构体相对于R-对映异构体的酯化。
式I-酸的普加巴林中间体可以通过本领域普通技术人员已知的任意方法回收。优选地，式I-酸的普加巴林中间体是通过如下方法回收的：过滤；用碱萃取滤液从而获得式I-酸化合物的盐；加入酸从而将所述盐转化成游离酸，即式I-酸化合物，并且将其过滤。所述碱可以是无机碱，优选为无机碱的水溶液。优选地，所述无机碱是氢氧化钠。优选地，在加入酸之前，用有机溶剂萃取水相。优选地，所述有机溶剂是甲苯。所述酸可以是无机酸。优选地，所述无机酸是HCl、HBr、H2SO4或H3PO4。优选地，向水相中加入所述酸从而提供约1到约4，更优选约2到约3的pH。
由此制备的式I-酸的普加巴林中间体可以被转化成(S)-普加巴林。所述转化可以例如按照美国公开No.2007/073085或美国专利No.5,637,767中所描述的方法进行。
已经参考某些优选实施方式对本发明进行了描述，通过参照本说明书，其它实施方式对于本领域技术人员来说是显而易见的。本发明通过参考如下实施例而被进一步定义。在不脱离本发明范围的情况下可以实现多种改进，包括材料或方法方面，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例
酶水解
实施例1：(±)3-(氨基甲酰基甲基)-5-甲基己酸乙酯(CMH-乙酯)的
酶水解
在反应器(1.5l)中加入缓冲剂(250ml)，水(200ml)和脂肪酶。获得透明溶液之后，向溶液中加入CMH-乙酯。在室温下将所产生的混合物搅拌24小时。向混合物中加入NaOH(30％的溶液)从而将pH调节到7。然后分离有机相，并且用甲苯将水相萃取两次(2×78g)。水相中含有(3S)-氰基-5-甲基己酸钠盐，其被用于酶酯化步骤中。
实施例2：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(3ml)，CMH-乙酯(215mg)和来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(100mg)。将所产生的混合物在室温下搅拌2天。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例3：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(3ml)，CMH-乙酯(215mg)和来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(100mg)。将所产生的混合物在37℃下搅拌4天。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例4：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(3ml)，CMH-乙酯(215mg)，来自黑曲霉的脂肪酶AN(20mg)和四氢呋喃(0.6ml，20％)。将混合物在室温下搅拌3天。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例5-10：CMH-乙酯的酶水解
重复实施例4的过程，用以下酶中的一种代替来自黑曲霉的脂肪酶AN：来自无色菌属的脂肪酶A(实施例5)；来自产碱杆菌属的脂肪酶AS1(实施例6)；来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C2(实施例7)；来自产碱杆菌属的脂肪酶AS2(实施例8)；来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C1(实施例9)；和来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C2(实施例10)。
实施例11：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(3ml)，CMH-乙酯(215mg)，来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C2(20mg)。将混合物在室温下搅拌2-3天。用乙酸乙酯萃取所产生的溶液(6ml)。分离有机层并且蒸发至干燥。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例13：CMH-乙酯的酶水解
重复实施例12的过程，用来自产碱杆菌属的脂肪酶AS1(实施例13)代替来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C2。
实施例14：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(3ml)，CMH-乙酯(215mg)，来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(100mg)和四氢呋喃(0.6ml，20％)。将所产生的混合物在37℃下搅拌4天。向混合物中加入甲苯(6ml)从而形成两相混合物。分离有机相并蒸发至干燥。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例15：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(3ml)，CMH-乙酯(215mg)，来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(100mg)和二甲基亚砜(0.6ml，20％)。将所产生的混合物在37℃下搅拌4天。向混合物中加入甲苯(6ml)从而形成两相混合物。分离有机相并蒸发至干。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例16：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(0.1M的K2HPO4，pH＝7，9ml)，CMH-乙酯(600mg)和CHIRAZYME E-1(151mg)。将该混合物(黄褐色)在室温下搅拌3天。用甲苯萃取所产生的溶液。蒸发水层，获得R-CMH(光学纯度为60％)。
实施例17：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(0.1M的K2HPO4，pH＝7，9ml)，CMH-乙酯(613.4mg)和CAL B(153mg)。将该混合物(白色浆料)在室温下搅拌3天。用甲苯萃取所产生的溶液。蒸发水层，获得R-CMH(光学纯度为98％)。
实施例18：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(0.1M的K2HPO4，pH＝7，9ml)，CMH-乙酯(ge-1349-3，606.21mg)和大肠杆菌中的酯酶BS3重组体(156.12mg)。将该黄色乳液在室温下搅拌3天。用甲苯萃取所产生的溶液。蒸发水层，获得S-CMH(光学纯度为79％)。
实施例19：CMH-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(0.1M的K2HPO4，pH＝7，9ml)，CMH-乙酯(606.21mg)和来自猪肝的酯酶PL(150mg)。将该褐色乳液在室温下搅拌3天。用甲苯萃取所产生的溶液。蒸发水层，获得R-CMH(光学纯度为68％)。
实施例20：3-氰基-5-甲基己酸-乙酯的酶水解
在反应器(1.5l)中加入缓冲剂(250ml)，水(200ml)和水解酶。获得透明溶液之后，加入3-氰基-5-甲基己酸-乙酯。在室温下将所产生的混合物搅拌24小时。向混合物中加入NaOH(30％的溶液)从而将pH调节到7。然后分离有机相，并且用甲苯萃取水相两次(2×78g)。水相中含有(3S)-氰基-5-甲基己酸钠盐，其被用于酶酯化步骤中。
实施例21：3-氰基-5-甲基己酸-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(2.5ml)，氰基乙酯(183mg)，USP Grade胰脂肪酶(Pancrelipase)(20mg)和四氢呋喃(0.5ml，20％)。将混合物在室温下搅拌4天。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例22-24：3-氰基-5-甲基己酸-乙酯的酶水解
重复实施例22的过程，用以下酶中的一种代替USP Grade胰脂肪酶：脂肪酶TL Meito sangyo(实施例22)；脂肪酶QLM(实施例23)；以及来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(实施例24)。
实施例25：3-氰基-5-甲基己酸-乙酯的酶水解
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入缓冲剂(2.5ml)，氰基乙酯(186mg)和来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)。将所产生的混合物在室温下搅拌3天。通过HPLC分析CMH的存在。
实施例26：(±)-2-羧基乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的脱羧化
在反应器(0.51)中装入乙醇(225ml)和KOH(31.8g)。将混合物冷却到室温，并且加入(±)-2-羧基乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(150g)。该混合物在回流下加热21小时，然后冷却到室温。减压蒸发溶剂，将残余物溶于CH2Cl2(600ml)中。用水(600ml)萃取该溶液，分离有机相并且蒸发。以黄色油状物的形式获得产物(±)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(77g)。通过蒸馏进行纯化之后(80-100℃，1mm Hg)，获得了57g浅黄色油状物。
酶酯化
实施例27：CMH的酶酯化
在反应器(1.5L)中加入甲苯(250ml)，乙酸乙烯酯(300mmol)，酶(2g)和CMH-外消旋物(100mmol)。将混合物在室温下搅拌48小时。过滤溶液，并用NaOH(30％的溶液)萃取滤液。分离有机相并且用甲苯萃取水相。酸化水相至pH为2从而沉淀出R-CMH，过滤R-CMH并且用水进行洗涤。
实施例28：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲苯(3ml)，丁醇(0.25ml，2.76mmol)，USP Grade胰脂肪酶(Pancrelipase)(20mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将所产生的混合物在室温下搅拌3天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例29-31：CMH的酶酯化
重复实施例28的过程，使用以下酶中的一种代替USP Grade胰脂肪酶：来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(实施例29)；来自Meito Sangyo的脂肪酶QLM(实施例30)；以及来自Meito Sangyo的脂肪酶TL(实施例31)。
实施例32：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲苯(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，USP Grade胰脂肪酶(Pancrelipase)(20mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将该混合物在室温下搅拌6天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例33-35：CMH的酶酯化
重复实施例32的过程，使用以下酶中的一种代替USP Grade胰脂肪酶：来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(实施例33)；脂肪酶QLM(实施例34)；以及脂肪酶TL(实施例35)。
实施例36：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲苯(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将该混合物在室温下搅拌4天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例37：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲苯(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)，四氢呋喃98％(0.3ml，10％)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将所产生的混合物在室温下搅拌4天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例38：CMH的酶酯化
使用来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶重复实施例37的过程。
实施例39：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入异丙基醚99％(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将所产生的混合物在室温下搅拌4天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例40：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入叔丁基醚(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将所产生的混合物在室温下搅拌4天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例41：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入异丁基酮(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将所产生的混合物在室温下搅拌4天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例42：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲苯(3ml)，乙酸乙烯酯(0.255ml，2.76mmol)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(100mg)，四氢呋喃98％(0.6ml，20％)和CMH-外消旋物(187mg，0.092mmol)。将混合物在37℃下搅拌4天。从混合物(0.5ml)中取出样品，并且用N2流进行干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例43：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的三口50ml烧瓶中加入甲苯(4ml)，absEtOH(0.3ml，5mmol)，CAL B(300mg)和CMH-外消旋物(187mg，1mmol)。将所产生的混合物在50℃下搅拌4天。从混合物(1ml)中取出样品，并且蒸发至干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例44：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲苯(4ml)，乙酸乙烯酯(0.25ml，5mmol)，CAL B(144.5mg)和CMH-外消旋物(0.1g，0.535mmol)。将所产生的混合物在50℃下搅拌4天。从混合物中取样(1ml)，并且蒸发至干燥。通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例45：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入异丁基酮(10ml)，乙酸乙烯酯(0.46ml，5mmol)，CAL B，稳定化的(～400mg)，分子筛(3
，～100mg)和CMH-外消旋物(187mg，0.647mmol)。将该混合物在50℃下搅拌47小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例46：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入丙酮30％和甲苯70％的溶液(10ml)，乙酸乙烯酯(0.46ml，5mmol)，CAL B，稳定化的(～400mg)，分子筛(3，～100mg)和CMH-外消旋物(193mg，1mmol)。将该混合物在50℃下搅拌47小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例47：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入丙酮30％和甲苯70％的溶液(10m1)，丁酸乙烯酯(0.46ml，3.6mmol)，CAL B，稳定化的(～400mg)，分子筛(3，100mg)和CMH-外消旋物(199mg，1mmol)。将该混合物在50℃下搅拌47小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例48：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲基异丁基酮(10ml)，丁酸乙烯酯(0.46ml，3.6mmol)，CAL B，稳定化的(～400mg)，分子筛(3，100mg)和CMH-外消旋物(189.5mg，1mmol)。将该混合物在50℃下搅拌47小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例49：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入丙酮70％和甲苯30％的溶液(10ml)，乙酸乙烯酯(0.46ml，5mmol)，CAL B稳定化酶(823.5mg)，分子筛(3，113mg)和CMH-外消旋物(186mg，1mmol)。将该混合物在～50℃下搅拌64小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例50：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入丙酮50％和甲苯50％的溶液(10ml)，乙酸乙烯酯(0.46ml，5mmol)，CAL B稳定化酶(802mg)，分子筛(3，100mg)和CMH-外消旋物(201.3mg，1mmol)。将该混合物在～50℃下搅拌64小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例51：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入丙酮30％和甲苯70％的溶液(10ml)，乙酸乙烯酯(0.46ml，5mmol)，TL稳定化酶(802.5mg)，分子筛(3，105.5mg)和CMH-外消旋物(194mg，1mmol)。将该混合物在～50℃下搅拌48小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例52：CMH的酶酯化
在装有磁力搅拌器的小瓶(20ml)中加入甲基乙基酮的溶液(10ml)，乙酸乙烯酯(0.46ml，5mmol)，TL稳定化酶(825mg)，分子筛(3，107mg)和CMH-外消旋物(183mg，1mmol)。将该混合物在～50℃下搅拌48小时。从混合物中取样(1ml)，通过HPLC分析样品中CMH-酯的存在。
实施例53：(S)-普加巴林的制备：来自美国专利No.5,637,767的
实施例(第12栏第46行到第13栏第32行)
在800l的蒸馏釜中加入(S)-3-氰基-5-甲基己酸-乙酯(50.1kg，273mol)和乙基醇2B(53kg)。加入氢氧化钾(17.8kg，317mol)的水(56l)溶液，控制加入速率以保持料液温度低于25℃。将该混合物在20℃到25℃下搅拌1.5小时。将料液转移到含有海绵镍(15.0kg，50％的水重)的氢化发生器中，接着用乙基醇2B(27kg)进行漂洗。在约50psi下用氢气处理混合物约19小时(氢气吸收停止)。
通过过滤除去镍，用39kg乙基醇2B和111l水的混合物漂洗滤饼。向滤液中加入冰醋酸(22.8kg，380mol)，同时保持料液温度低于40℃。将料液加热到70℃到75℃，从而将固体溶解。将料液缓慢冷却到0℃到5℃，从而使产物结晶。
通过离心收集固体，用160l预先冷却到0℃到5℃的异丙醇漂洗。
将潮湿的固体在真空盘状干燥器中在减压下在35℃到45℃的温度下进行干燥(28小时)，从而得到(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。
实施例54：(R)-CMH向(S)-普加巴林的转化：美国公开No.
2007/0073085的实施例12
在反应器(0.5L)中装入水(165ml)和NaOH(35.5g)从而获得溶液。将该溶液冷却到15℃并加入(R)-CMH(33g)。滴加Br2(28.51g)同时保持温度低于25℃。在60℃下加热混合物15分钟，然后冷却到15℃。加入异丁醇(100ml)，然后加入H2SO4(66％)溶液(33ml)。分相，用异丁醇(83ml)萃取水相。向混合的有机相中加入Bu3N(34.2g)，并将混合物冷却到2℃，搅拌2小时。过滤固体，洗涤并且在55℃下减压干燥，从而提供了(S)-普加巴林，总纯度通过HPLC峰面积测定为99.86％。
Claims (52)
1.一种制备下式I的普加巴林中间体的方法
所述方法包括：
a)将下式II的酯
水解酶、缓冲剂和任选地碱混合从而获得混合物；和
b)将该混合物保持在约5℃到约60℃的温度下，从而获得式I的普加巴林中间体，
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基；并且M是金属。
2.权利要求1的方法，其中R是CN或CH2CONH2。
3.权利要求1或2的方法，其中R’是乙基或甲基。
4.权利要求1到3任意一项的方法，其中M是碱金属。
5.权利要求1到4任意一项的方法，其中所述水解酶是酯酶、蛋白酶或脂肪酶。
6.权利要求5的方法，其中所述酯酶选自大肠杆菌中的酯酶PF2重组体，大肠杆菌中的酯酶BS1重组体，大肠杆菌中的酯酶BS2重组体，大肠杆菌中的酯酶BS2 CLEA重组体，大肠杆菌中的酯酶BS3重组体，大肠杆菌中的酯酶BS4重组体，来自猪肝脏中的酯酶PL，大肠杆菌中的酯酶SD重组体，酯酶RO和米曲霉中的酯酶TL重组体。
7.权利要求5或6的方法，其中所述脂肪酶选自来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自洋葱假单胞菌的脂肪酶P2、来自施氏假单胞菌的脂肪酶PS、来自酒曲酶属的脂肪酶RS、来自荧光假单胞菌的脂肪酶PF、来自卡门柏青霉的脂肪酶PC、来自洋葱假单胞菌的脂肪酶P1、来自黑曲霉的脂肪酶AN、来自无色菌属的脂肪酶A、来自产碱杆菌属的脂肪酶AS1、来自产碱杆菌属的脂肪酶AS2、来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C2、来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C1、脂肪酶lipozym TL IM、脂肪酶lipozym TL 100L、南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)、CHIRAZYMEE-1猪肝酯酶、来自假单胞菌属L-6的脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)、皱褶假丝酵母脂肪酶(L-3)、胰脂肪酶USP Grade、脂肪酶QLM和脂肪酶TL。
8.权利要求5到7任意一项的方法，其中所述蛋白酶是胰凝乳蛋白酶。
9.权利要求5到8任意一项的方法，其中所述酯酶是CALB、CHIRAZYME E-1猪肝酯酶、大肠杆菌中的酯酶BS3重组体或来自猪肝的酯酶PL。
10.权利要求1到9任意一项的方法，其中所述缓冲剂是以足以提供约6到约9的pH的量存在的。
11.权利要求1到10任意一项的方法，其中所述碱是碱金属氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或者是碱土金属氢氧化物。
12.权利要求1到11任意一项的方法，其中所述碱是氢氧化钠或氢氧化钾。
13.权利要求1到12任意一项的方法，其中将水解酶、缓冲剂和任选地碱混合，然后加入式II的酯从而获得混合物。
14.权利要求1到13任意一项的方法，其中其中将共溶剂与缓冲剂混合。
15.权利要求14的方法，其中所述共溶剂选自亚砜、酰胺、醇、酮和腈。
16.权利要求14或15的方法，其中所述共溶剂选自C2-4亚砜、C3-6酰胺、C1-6醇、C2-6酮以及C1-5腈。
17.权利要求14到16任意一项的方法，其中所述共溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、异丙醇、丙酮和乙腈。
18.权利要求1到17任意一项的方法，其中将所述混合物保持在约20℃到约27℃的温度下，从而获得式I的普加巴林中间体。
19.权利要求1到18任意一项的方法，其中R是CN。
20.权利要求19的方法，其中式II的酯是通过将下式的(±)-2-羧基烷基-3-氰基-5-甲基己酸烷基酯脱羧而制备的
所述脱羧是通过将其与碱性氢氧化物混合而实现的；其中R’是C1-6烃基。
21.权利要求20的方法，其中R’是乙基或甲基。
22.权利要求20或21的方法，其中所述碱性氢氧化物是氢氧化钾。
23.权利要求20到22任意一项的方法，其中(±)-2-羧基烷基-3-氰基-5-甲基己酸烷基酯和碱性氢氧化物是在溶剂的存在下混合的。
24.权利要求23的方法，其中所述溶剂选自水、极性有机溶剂以及它们的混合物。
25.权利要求24的方法，其中所述极性有机溶剂是C1-5醇。
26.权利要求25的方法，其中所述C1-5醇是甲醇或乙醇。
27.权利要求20到26任意一项的方法，其中所述脱羧是在加热的情况下进行的，从而获得式II的酯。
28.权利要求27的方法，其中所述加热是加热到约60℃到约180℃的温度。
29.一种制备下式I的普加巴林中间体的方法：
所述方法包括在缓冲剂和任选地碱的存在下酶水解下式II的酯，
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；R”是氢或C1-6烃基；并且M是金属。
30.一种制备下式I-酸的普加巴林中间体的方法：
I-酸
所述方法包括：
a)通过权利要求1到29任意一项的方法制备下式I的普加巴林中间体；和
b)将式I的普加巴林中间体转化成式I-酸的普加巴林中间体。
31.一种制备(S)-普加巴林的方法，所述方法包括：
a)通过权利要求1到29任意一项的方法制备下式I的普加巴林中间体；
和
b)将式I的普加巴林中间体转化成(S)-普加巴林。
32.一种制备下式I-酸的普加巴林中间体的方法：
I-酸
所述方法包括混合下式III的化合物，
醇或酯，以及酶以获得式I-酸的普加巴林中间体，其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；且R”是氢或C1-6烃基。
33.权利要求32的方法，其中R是CN或CH2CONH2。
34.权利要求32或33的方法，其中式III化合物、醇或酯以及酶是在溶剂的存在下混合的。
35.权利要求34的方法，其中所述溶解选自芳香烃、醚、酮、腈、氯代烃、酰胺以及它们的混合物。
36.权利要求34或35的方法，其中所述溶剂选自：C6-8芳香烃，C2-8直链、支链或环状醚，C2-8酮，C2-5腈，C1-4氯代烃，C3-6酰胺，以及它们的混合物。
37.权利要求34到36任意一项的方法，其中所述溶剂选自甲苯、二异丙基醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、丙酮、乙腈、二氯甲烷、四氯化碳、二甲基甲酰胺以及它们的混合物。
38.权利要求34到37任意一项的方法，其中所述溶剂是甲苯或者甲苯和丙酮的混合物。
39.权利要求32到38任意一项的方法，其中所述酶是水解酶。
40.权利要求39的方法，其中所述水解酶是酯酶、蛋白酶或脂肪酶。
41.权利要求40的方法，其中所述酯酶选自大肠杆菌中的酯酶PF2重组体、大肠杆菌中的酯酶BS1重组体、大肠杆菌中的酯酶BS2重组体、大肠杆菌中的酯酶BS2 CLEA重组体、大肠杆菌中的酯酶BS3重组体、大肠杆菌中的酯酶BS4重组体、来自猪肝脏的酯酶PL、大肠杆菌中的酯酶SD重组体、酯酶RO和米曲霉中的酯酶TL重组体。
42.权利要求40的方法，其中所述脂肪酶选自来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自洋葱假单胞菌的脂肪酶P2、来自施氏假单胞菌的脂肪酶PS、来自酒曲酶属的脂肪酶RS、来自荧光假单胞菌的脂肪酶PF、来自卡门柏青霉的脂肪酶PC、来自洋葱假单胞菌的脂肪酶P1、来自黑曲霉的脂肪酶AN、来自无色菌属的脂肪酶A、来自产碱杆菌属的脂肪酶AS1、来自产碱杆菌属的脂肪酶AS2、来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C2、来自圆柱假丝酵母的脂肪酶C1、脂肪酶lipozym TL IM、脂肪酶lipozym TL 100L、南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)、CHIRAZYMEE-1猪肝酯酶、来自假单胞菌属L-6的脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)、皱褶假丝酵母脂肪酶(L-3)、胰脂肪酶USP Grade、脂肪酶QLM和脂肪酶TL。
43.权利要求40的方法，其中所述蛋白酶是胰凝乳蛋白酶。
44.权利要求40的方法，其中所述酯酶是CALB、CHIRAZYME E-1猪肝酯酶、大肠杆菌中的酯酶BS3重组体或来自猪肝的酯酶PL。
45.权利要求32到44任意一项的方法，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇以及它们的混合物。
46.权利要求32到45任意一项的方法，其中所述酯是乙酸乙烯酯或丁酸乙烯酯。
47.权利要求32到46任意一项的方法，其中式III的化合物、醇或酯与酶的混合物被保持在约5℃到约50℃的温度下，从而获得式I-酸的普加巴林中间体。
48.权利要求32到47任意一项的方法，其中所述酯或醇与式III的化合物是以约1摩尔酯或醇比约1摩尔式III化合物的比例混合的。
49.权利要求32到48任意一项的方法，其中所述酯或醇与式III化合物是以大于约1摩尔酯或醇比约1摩尔式III化合物的比例混合的。
50.权利要求32到49任意一项的方法，其中所述酯或醇与式III化合物是以约3到约10摩尔酯或醇比约1摩尔式III化合物的比例混合的。
51.一种制备下式I-酸的普加巴林中间体的方法
I-酸
所述方法包括，对下式III的化合物进行酶酯化，
其中R是CH2CONR”2、CH2CO2R’或CN；R’是C1-6烃基；并且R”是氢或C1-6烃基。
52.一种制备(S)-普加巴林方法，所述方法包括：
a)通过权利要求32到51任意一项的方法制备下式I-酸的普加巴林中间体；
I-酸
和
b)将式I-酸的普加巴林中间体转化成(S)-普加巴林。
Applications Claiming Priority (8)
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