CN104293744A - 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸；本发明提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活力2～5倍，可用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于进一步合成普瑞巴林。

Description

来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用
(一)技术领域
本发明涉及脂肪酶编码基因的克隆和利用基因突变技术制备脂肪酶突变体的方法，所获得的突变体及其在普瑞巴林手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用。
(二)背景技术
脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，是一类既能催化酯水解，又具有催化酯合成、转酯化、氨解、醇解等反应的酶，在食品、洗涤、饲料、有机合成和生物能源等领域应用广泛(Curr.Opin.Biotech.2002,13:390-397)。脂肪酶催化的反应除具有选择性高、副反应少，产物光学纯度高等特点外，还具有催化反应条件温和、绿色环保等优势。这使得脂肪酶在光学纯化合物特别是手性药物的制备中具有独特的优势，已成为制备光学纯手性药物的重要技术手段(Coord.Chem.Rev.2008,252:659-701.)。
普瑞巴林(Pregabalin)是一种新型γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放，具有良好的抗焦虑和神经痛治疗效果(Angew.Chem.Int.Edit.2008,47:3500-3504)。由于疗效显著和适应症的扩大，普瑞巴林的销售额逐年递增，2013年达到45.95亿美元，列全球最畅销药物榜第13位，市场潜力巨大。2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)被脂肪酶/酯酶选择性水解，其产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要手性中间体。该中间体经脱羧、碱性水解、氢化即得到普瑞巴林(Org.Process Res.Dev.2008,12:392-398)。但目前只有来源于Novozymes公司的即商品化Thermomyces lanuginosus脂肪酶能满足工业化生产的需要。因此，开发能够高效拆分CNDE的新催化剂具有重要意义。
热稳定酶一般具有较强的溶剂稳定性，具有很好的生物技术和工业应用潜力(Environ.Technol.2010,31:1159-1167)。近年来，从嗜热菌中获得热稳定酶已成为学术和工业界的研究热点。嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)是一类分布广泛，生长温度上限较高的嗜热真菌，已成为具有工业应用价值热稳定酶的重要来源。
随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用分子改造的手段对酶分子进行改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，这项技术已被成功用于改造各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展(Curr.Opin.Struct.Biol.2011,21:473-480)。分子改造广泛应用于脂肪酶催化活力、底物特异性、热稳定性和对映体选择性等性质的改造。
(三)发明内容
本发明目的在于通过定点饱和突变技术对嗜热踝节菌的脂肪酶进行改造，提供脂肪酶突变体，其对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的水解活力明显提高，从而有利于该脂肪酶在普瑞巴林中间体制备中的应用。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列。本发明的再一目的在于将本发明的突变体应用于选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明采用的技术方案是：
本发明通过对来源于T.thermophilus ATCC 20186脂肪酶基因进行克隆表达，利用全质粒PCR技术对含有脂肪酶基因的表达载体进行定点饱和突变，构建突变文库，利用基于真实底物的96孔板高通量筛选方法进行筛选，获得了一系列对CNDE活力明显提高且对映体选择性严格的脂肪酶突变体，这些突变体能以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，在室温和较高的温度下高效生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。最终本发明提供一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体，所述来源于嗜热踝节菌(T.thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸(氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，核苷酸序列为SEQ ID No.3所示)，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸(氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，核苷酸序列为SEQ ID No.5所示)，优选所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸(氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，核苷酸序列为SEQ ID No.5所示)。
本发明还涉及一种所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用，具体所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为螯合剂(用于解除产物抑制剂)，以水或缓冲液(优选Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成pH值为6.0～8.0(优选pH值为7.0)的转化体系，30～60℃、150～500r/min条件下(优选40℃、500r/min)进行转化反应，反应结束后，取反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始浓度为0.1～3.0mol/L转化体系(优选1mol/L)，所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为10～50g/L转化体系(优选50g/L)，Ca(OAc)2终浓度为50～180mmol/L转化体系(优选150mmol/L)。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，再以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1～1.0mM(优选0.1mM)的IPTG，28℃诱导培养10h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。LB液体培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，溶剂为去离子水，pH值为7.0；LB平板培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂15，溶剂为去离子水，pH值为7.0。
本发明所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心除去菌体，取上清液减压蒸馏至原1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取(除去残留底物)，取萃取层减压蒸馏至干(去除残留甲苯和水)，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明所述的脂肪酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
此外，本发明的突变体较亲本活力大幅提高，即使使用该酶的粗提物或者工程菌全细胞，反应也会以较高的速率进行。此外，本发明的突变体可以在相对较高的温度例如40-60℃下用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，从而进一步合成普瑞巴林。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活力提高2～5倍，可用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于进一步合成普瑞巴林。
(四)附图说明
图1为实施例4中工程菌诱导表达的SDS-PAGE分析；其中泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1～3分别为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL，E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T，泳道4～6为IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL，E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T。
图2为实施例6中脂肪酶突变体S63M/S83T全细胞催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(1.0M)制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸反应进程曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：亲本基因的扩增及表达载体的构建
采用RT-PCR的方法从Talaromyces thermophilus ATCC 20186(购自美国典型微生物菌种保藏中心，American Type Culture Collection)中获得脂肪酶基因。根据文献报道的Talaromyce thermophilus CTM10.103脂肪酶基因序列(GenBank accession no.JF414585)设计引物TTL-F和TTL-R(见表1)，采用RT-PCR的方法从T.thermophilus ATCC 20186中分离脂肪酶基因。采用TRIzol法提取T.thermophilus ATCC 20186总RNA，使用Promega公司的GoScriptTM逆转录试剂盒进行cDNA第一链的的制备，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。以cDNA第一链为模板，在引物TTL-F和TTL-R作用下，利用PCR方法扩增脂肪酶cDNA序列。PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL)：10×Pfu DNA polymerase buffer10μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为50μM的引物TTL-F和TTL-R各0.5μL，cDNA 1μL，PfuDNA聚合酶2μL，无核酸水85μL。采用Biometra的TProfessional PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃3min，然后进入温度循环94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。0.9％琼脂糖凝胶电泳表明PCR产物大小约800bp。利用Axygen的PCR Cleanup Kit回收该PCR产物，经限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切与经同样限制性内切酶酶切处理的表达载体pET-28b(+)连接，构建含有脂肪酶基因的表达重组质粒pET28-TTL，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。随机挑取10个单克隆进行菌落PCR鉴定，挑取一个阳性克隆进行测序证实。经DNA测序证实，确定该被克隆的亲本脂肪酶的核苷酸序列，即序列表中的SEQID No.1，相应的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No.2，获得脂肪酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL。
实施例2：脂肪酶位点83的定点饱和突变
定点饱和突变技术参考(Current Protocols in Protein Science26.6.1-26.6.10,2011；Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述，阳性突变子的高通量筛选技术参考(Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述。具体过程如下：
为了将亲本氨基酸序列中的第83位点的Ser进行饱和突变，设计突变引物S83-F和S83-R(见表1)，以实施例1构建的质粒pET28-TTL为模板，进行全质粒PCR。PCR扩增体系为：5×PS buffer 10μL，dNTP(2.5mM each)4μL，突变引物S83-F和S83-R各0.5μL，质粒pET28-TTL 0.5μL，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL，补水至50μL。PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR反应液20μL，加入1μL DpnⅠ，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，获得约500个克隆的突变体库。挑取单菌落于装有LB培养基的96孔培养板，37℃培养至OD600约为0.6，加入终浓度0.1mM IPTG，28℃诱导10h。96孔板离心机上4,000g，15min离心，弃上清，加入100μL磷酸钾缓冲液(pH 7.2,10mM)重悬菌体。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以0.01％溴百里香酚蓝为指示剂，以突变前的工程菌细胞为参照，在96孔板上初筛活力提高的阳性克隆，根据反应体系颜色变化(蓝色→黄色)的速度进行粗筛，筛选出变色速度快于对照菌株的克隆。筛选出的阳性克隆再经活力测定验证，从阳性克隆中抽提质粒，经DNA测序确定引入的点突变，活力最高的阳性克隆DNA测序显示83位的Ser突变成了Thr(S83T)，获得脂肪酶突变体工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T。突变体S83T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.3，其中一种编码基因序列见序列表中的SEQ IDNo.4。
实施例3：对脂肪酶突变体S83T位点58的定点饱和突变
定点饱和突变技术参考(Current Protocols in Protein Science26.6.1-26.6.10,2011；Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述，阳性突变子的高通量筛选技术参考(Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98:2473-2483)的描述。具体过程如下：
在脂肪酶突变体S83T的基础上对位点58的Ser进行饱和突变，设计突变引物S58-F和S58-R(见表1)，以质粒pET28-S83T为模板(见实施例2)，进行全质粒扩增。PCR体系为：5×PS buffer 10μL，dNTP(2.5mMeach)4μL，突变引物S58-F和S58-R各0.5μL，质粒pET28-S83T 0.5μL，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL，补水至50μL。PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μL，加入1μL DpnⅠ，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，获得约500个克隆的突变体库。位点58的饱和突变库的筛选同实施例2，不同是所用对照为实施例2获得的S83T突变体细胞。筛选出的阳性克隆再经活力测定证实后从阳性克隆中抽提质粒，经DNA测序确定引入的点突变，活力最高的阳性克隆DNA测序显示58位的Ser突变成了Met(S58M)，获得脂肪酶突变体工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-S58T/S83T。突变体S58M/S83T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.5，其编码基因序列见序列表中的SEQ ID No.6。
表1：引物
注：N＝A/G/C/T,K＝G/T,M＝A/C.
实施例4：亲本脂肪酶和脂肪酶突变体工程菌诱导表达
将E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL(见实施例1)、E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T(见实施例2)和E.coli BL21(DE3)/pET28-S58T/S83T(实施例3)分别接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，再以1％接种量(v/v)转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，28℃诱导培养10h，诱导完成取样进行SDS-PAGE分析(图1)，表明诱导后目的蛋白大量表达。取样后的培养物于4℃、8000×g离心10min，收集菌体细胞，可用于酶活测定和生物催化制备普瑞巴林中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
实施例5：亲本脂肪酶和脂肪酶突变体的活性测定
以携带空质粒的宿主菌E.coli BL21(DE3)/pET28为对照，对实施例4中获得的突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E.coliBL21(DE3)/pET28-S58T/S83T和出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-TTL培养获得湿菌体分别测定活力。反应体系组成：100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM 2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，50mM Ca(OAc)2和20g/L的湿细胞，40℃、150r/min反应1h，取样200μL，并加50μL、1M的HCl水溶液终止反应，用乙酸乙酯萃取，取上层有机相用无水硫酸钠干燥后，采用气相色谱测定转化率和产物的对映体过量值(ee)。采用外标定量法来测定转化液中2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯、(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的含量。各成分的量用气相色谱岛津GC-14C测定，色谱柱类型：G-TA毛细管柱；色谱条件：柱温135℃，进样室温度220℃，FID检测器温度220℃，载气为高纯氦，流量为1mL/min，分流比为30:1。酶活单位(U)定义为：在40℃、pH 7.5条件下，在1min内催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成1μmol(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U。TTL及其突变体活力见表2，突变体活力较亲本明显提高，其中双突变体S58M/S83T的活力是亲本的545％，且突变后对映体选择性没有改变，ee保持在98％的水平。
表2：脂肪酶突变体与亲本脂肪酶的活力比较
实施例6：脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(一)
转化体系组成及转化操作如下：200mL反应体系中，加入98mL水，脂肪酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28-S58M/S83T湿菌体(见实施例4)10g，Ca(OAc)25.2g(150mM)，底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯51g(底物浓度1.0M，即255g/L)；反应条件：40℃、500rpm，反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0，期间取样用手性气相色谱监测反应进程(见图2)，气相色谱检测条件同实施例5。由图2可知，终浓度50g/L的TTL脂肪酶突变体S58M/S83T湿菌体能催化1M的CNDE选择性水解，反应24h，转化率达到46.1％，并获得ee值为99％以上的产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。反应24h后，离心除去大肠杆菌细胞后，上清液减压蒸馏至1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液，加入1/3体积的甲苯萃取除去残留底物，再减压蒸馏去除残留甲苯和水，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(e.e.>99％)。
实施例7：脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(二)
转化体系组成及转化操作如下：底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯添加量为0.5mol/L，E.coli BL21(DE3)/pET28-S58M/S83T湿菌体(见实施例4)添加量为50g/L，Ca(OAc)2150mmol/L；反应条件：40℃、500rpm，反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0，期间取样用手性气相色谱监测反应进程，直至反应终点，气相色谱检测条件同实施例5。反应10h，转化率达到45.8％，产物e.e.>99％，后续处理同实施例6。
实施例8：脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(三)
转化体系组成及转化操作如下：底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯添加量为3.0mol/L，E.coli BL21(DE3)/pET28-S58M/S83T湿菌体(见实施例4)添加量为50g/L，Ca(OAc)2150mmol/L；反应条件：40℃、500rpm，反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0，期间取样用手性气相色谱监测反应进程，直至反应终点，气相色谱检测条件同实施例5。反应60h，转化率达到44.7％，产物e.e.>99％，后续处理同实施例6。
实施例9：脂肪酶突变体全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用(四)
转化体系组成同实施例6，所不同的是所用催化剂为表达单点突变体S83T的细胞，即E.coli BL21(DE3)/pET28-S83T湿菌体，色谱检测条件同实施例5，转化操作条件同实施例6。反应48h，转化率达到46.9％，并获得ee值为99％以上的产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。反应结束的后续处理同实施例6。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变菌在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。
2.如权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。
3.一种权利要求1或2所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用，其特征在于所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为螯合剂，以水或缓冲液为反应介质构成pH值为6.0～8.0的转化体系，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后，取反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为0.1～3.0mol/L反应体系，所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为10～50g/L反应体系，Ca(OAc)2终浓度为50～180mmol/L反应体系。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，再以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，28℃诱导培养10h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液减压蒸馏至原1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取，取萃取层减压蒸馏至干，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
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