CN103525784A - 一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用 - Google Patents

一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe；所述Phe突变为Arg。本发明所得的偏甘油酯脂肪酶突变体Phe278Arg对甘油单酯水解活性提高，更适合工业生物转化的应用。经改造后的SMG1Phe278Arg突变体对偏甘油酯有更好的选择性，对甘油单酯选择性因子的值为83.49，明显高于野生型的偏甘油酯脂肪酶SMG1-WT选择性因子的49.41，获得与原始酶基因的不同的底物选择特性，水解处理混合偏甘油酯可获得纯度大于98%的甘油二酯产物。

Description

一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种甘油单酯水解活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用。 
背景技术
脂肪酶（EC3.1.1.3）即三酰基甘油酰基水解酶，能够催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。而偏甘油酯脂肪酶是一种只水解甘油单酯和甘油二酯，而不水解甘油三酯的脂肪酶。脂肪酶参与的催化反应类型广泛，包括催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品行业、生物医药、日用化工等领域。 
甘油二酯(简称DAG)是由丙三醇（甘油）与两个脂肪酸酯化后得到的产物，具有明确的防止肥胖、降血脂等功能且食用安全，作为普通食用油的换代产品。脂肪酶可以在温和的条件下催化油脂改性制备甘油二酯，但现有的酶法合成甘油二酯合成工艺中一般含有甘油三酯和单甘油酯（MAG），由于甘油三酯与甘油二酯难以有效分离，使得产品中DAG的纯度较低，专利02827094.0公开了一种利用利用偏甘油酯脂肪酶通过酯化方法合成高纯度甘油二酯的方法，但其反应的副产物含有甘油单酯。虽然可以通过分子蒸馏等工艺将反应混合物中的MAG和未反应的酰基供体分离除去，但处理过程中高的蒸发温度，一方面导致能耗提高，同时使影响油脂的产品的品质。利用特异性的甘油单酯脂肪酶用于降解油脂产品中的MAG可以在温和的条件下获得高纯度的DAG，但是至今特异性甘油单酯脂肪酶酶制剂仍然缺乏。 
蛋白质工程是一种能够改善酶蛋白质特性的可行的方法，借助分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得底物选择性改变的酶突变体。 
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种选择性水解甘油单酯水解的SMG1脂肪酶突变体，可应用于制备高纯度的甘油二酯。通过理性选择突变位点，是由马拉色霉菌属（Malassezia globosa）SMG1脂肪酶基因（genbank登录号XM_001732152.1），通过对其蛋白结构（PDB：3UUE）的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。进行定点突变获得酶突变体，亲本SMG1-WT的氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为：Phe278Arg。 
本发明的技术方案具体如下： 
一种偏甘油酯脂肪酶突变体，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe；所述Phe突变为Arg。 
所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2。 
所述突变体的氨基酸序列为SEQ NO.3。 
所述偏甘油酯脂肪酶突变体在制备高纯度甘油二酯中的应用，首先，利用上述突变体制备突变质粒，再制备重组菌株，最后利用重组菌株表达制备偏甘油酯脂肪酶突变体，并将偏甘油酯脂肪酶突变体用于制备高纯度甘油二酯。 
所述利用上述突变体制备突变质粒的方法，包括如下步骤： 
（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段； 
（2）将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到含有偏甘油酯脂肪酶突变体基因质粒。 
所述PCR的引物序列如下： 
Figure BDA0000390759810000021
Figure BDA0000390759810000031
所述重组菌株的制备方法，包括如下步骤： 
（1）将上述质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞； 
（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。 
所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33。 
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 
本发明所得的偏甘油酯脂肪酶突变体Phe278Arg对甘油单酯水解活性提高，更适合工业生物转化的应用。经改造后的SMG1Phe278Arg突变体对偏甘油酯有更好的选择性，对甘油单酯选择性因子的值为83.49，明显高于野生型的偏甘油酯脂肪酶SMG1-WT选择性因子的49.41，获得与原始酶基因的不同的底物选择特性，水解处理混合偏甘油酯可获得纯度大于98%的甘油二酯产物。 
附图说明
图1为脂肪酶SMG1三维结构图，箭头指向的是278位氨基酸的Phe位点。 
图2为脂肪酶SMG1及突变体的蛋白纯化图，泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是纯化后的SMG1-WT，泳道三是纯化后的SMG1-Phe278Arg。 
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。 
实施例1 
脂肪酶SMG1野生型毕赤酵母表达载体的构建 
根据Genbank的球形马拉色偏甘油酯脂肪酶smg1基因（登录号：XM_001732152），委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根据毕赤酵母密码子偏好性对序列进行优化（序列SEQ ID NO：1）。基因合成后， 利用引物SMG For：5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’及SMG Rev：5’ACGCGTCGACTTAATGAGCACCAACCTGAGCT-3’扩增成熟肽序列，PCR扩增条件：94℃5min；94℃20s，53℃30s，72℃80s，25个循环；72℃7min。PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB（含25ug/ml zeocion）平板。挑取阳性克隆通过Kpn I和SalI双酶切鉴定并基因测序，结果表明获得野生型pGAPZαA-SMG1质粒。 
实施例2 
脂肪酶SMG1Phe278Arg突变体构建 
采用定点突变技术构建突变体SMG1Phe278Arg，利用重叠延伸PCR方法引入目的突变位点，以SMG1野生型基因pGAPZαA-SMG1为模板，定点突变反应条件： 
扩增突变上游片段： 
10X pfu buffer： 5
d NTP： 2.5
SMG for： 2.5
Phe278Ile rev： 2.5
Pfu DNA聚合酶： 1.5
双蒸水： 40
PGAPZαA-SMG1： 2
扩增突变下游片段： 
10X pfu buffer 5
dNTP： 2.5
Phe278Ile for： 2.5
3’AOX： 2.5
Pfu DNA聚合酶： 1.5
双蒸水： 40
[0036] 
PGAPZαA-SMG1： 2
扩增带有突变位点的全长基因片段： 
10Xpfu buffer： 10
dNTP： 5
SMG for： 5
3’AOX： 5
Pfu DNA聚合酶： 3
双蒸水： 8
上游片段： 5
下游片段： 5
使用的引物，见下表： 
Figure BDA0000390759810000051
PCR扩增条件：94℃5min；94℃20s，53℃30s，72℃80s，25个循环；72℃7min。重叠延伸PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB（含25ug/ml zeocion）平板。生长15h后，挑取平板上10个单菌落进行菌落PCR，挑取阳性克隆通过Kpn I和SalI双酶切鉴定并基因测序，结果表明获得了正确的突变质粒。 
实施例3 
脂肪酶SMG1及其突变体重组菌株及重组蛋白纯化 
将突变质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至毕赤酵母X-33感受态态细胞。将转化液涂布于YPD（100ug/ml Zeocin）平板，30℃培养3天后， 挑取平板上单菌落于100ml YPD培养基中发酵72小时后，离心并浓缩发酵液进行SDS-PAGE检测，获得能够表达脂肪酶SMG1突变体阳性重组菌株。 
将野生型菌株以及各脂肪酶突变体菌株，接种至100ml YPD培养基中，30℃，200rpm振荡培养48-72小时后，收集发酵上清液（10，000rpm，离心20min，4℃）。 
将SMG1野生型及其突变体菌株的发酵上清液用0.22um的滤膜抽滤。后用10KD膜胞（Vivaflow200，Sartorius）将发酵液置换成20mM pH8.0Tris-HCl缓冲液，并将发酵液浓缩到大约30ml。浓缩发酵上清利用Q SepharoseTM Fast Flow阴离子交换层析柱，流速5ml/min，最后用pH8.0含1M NaCl的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，目标蛋白在80mM盐离子浓度处被洗脱下来。利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定，纯化的酶蛋白纯度大于90%（见附图2）。 
实施例4 
高纯度甘油二酯的制备 
在25mL三角瓶中加入3.5mL的偏甘油酯（甘油单酯和甘油二酯的混合物）底物，加入经纯化后的SMG1-WT和SMG1Phe278Arg，酶液利用50mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液稀释至1.5mL，加酶量为100U/mL(U/v，相对于油脂体积)酶液，混合均匀后预热20min。反应温度为25℃，摇床转速为200rpm，反应过程中分别在1、3、5、7及16h进行取样。将所取100μL样品溶于1mL的流动相中，流动相的比例为：正己烷/异丙醇/甲酸=15:1:0.003(体积比)，震荡均匀后，于10000rpm下离心5min，除去下层水相，将上层有机相用0.45μm的有机相滤膜过滤后，取10μL进行HPLC-IR分析。 
HPLC检测的条件为：色谱柱为Luna5u Silica(2)100A，250×4.60mm，(phenomenex)，流动相为正己烷:异丙醇:甲酸=15:1:0.003(体积比)；流动相流速为1.0mL/min，柱温保持30℃；进样量为10μL，每个样品检测时间约为30min，数据处理软件为Breeze工作站。 
SMG1-WT和SMG1Phe278Arg对单甘油酯的选择性能力，使用选择性因子[α=（A-B）/（A+B），其中A为底物中甘油二酯的含量，B为甘油单酯的 含量]来衡量。实施例所用的水解油脂底物甘油单酯含量为14.93%,甘油二酯为85.07%。若偏甘油酯脂肪酶只水解甘油单酯，那么选择因子α的值为85.07，酶突变体的选择因子α越接近该值，表明对甘油单酯的选择性越高。同时限定，只在对甘油单酯的水解效率超过90%以上，选择性因子α才作为衡量酶对底物选择性的标准。SMG1-WT和SMG1Phe278Arg对偏甘油酯的水解效率数据见下表： 
Figure BDA0000390759810000071
SMG1-WT和SMG1Phe278Arg水解偏甘油酯16小时的选择因子α分别为49.41和83.49，结果表明SMG1Phe278Arg对甘油单酯偏好性明显优于SMG1-WT，同时水解获得甘油二酯的纯度达到98%以上。 
Figure IDA0000390759900000031
Figure IDA0000390759900000041

Claims (10)

1.一种偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe；所述Phe突变为Arg。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ NO.3。
4.一种利用权利要求1～3任意一项突变体制得的质粒。
5.权利要求4所述质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；
（2）将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到含有偏甘油酯脂肪酶突变体基因质粒。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR的引物序列如下：
Figure FDA0000390759800000011
7.一种重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求4的质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33。
9.权利要求7或8所述方法制备的重组菌株。
10.权利要求1或2或3所述偏甘油酯脂肪酶突变体在制备高纯度甘油二酯中的应用。
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