CN103952385A - 一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用 - Google Patents

一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；该热稳定脂肪酶基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明获得中性脂肪酶，在pH7.0具有最适酶活性，其对橄榄油的水解反应中，最适温度为70℃；对大豆卵磷脂为底物的水解反应中，最适反应温度为40℃。同时该脂肪酶还具有极好的热稳定性，60℃处理半小时仍然具有95％的酶活性剩余。对有机溶剂有较强的耐受性。本发明的脂肪酶可适用于高温下催化植物油进行甘油酯的水解和生成甘油二酯。采用所述方法得到的重组脂肪酶，具有较高的催化活性和热稳定性。

Description

一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体的说，涉及一种优化的海洋微生物来源的热稳定脂肪酶，其编码基因，及含有该编码基因的重组质粒和用于表达目标脂肪酶蛋白的重组菌株；本发明还涉及所表达的热稳定脂肪酶的应用。
背景技术
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是催化甘油酯酯键水解成更少酯键的甘油酯或者甘油及脂肪酸的一类酶。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性。另外，脂肪酶以其来源广泛、催化功能多样和催化底物类型广泛(酯、酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成为它的底物)等优点，以及对环境不会造成污染等特点，使它在食品、制革、水产、生物化工、造纸、油脂化工、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。目前脂肪酶已经成为重要的工业用酶之一，它们在工业研究中的发展相当迅速。
脂肪酶应用研究日益增加，目前在脂肪酶的应用中，主要的障碍包括如下几点：一是成本高，这一点已由固定化技术得到大大改进；二是稳定性与活性，这正是当今生化研究集中解决的问题。酶分子的稳定性作为一项重要性质，对酶催化功能的发挥有着重要的影响。可是，由于酶的稳定性往往受到诸多因素的共同影响而决定，因此对于稳定性酶的筛选一直是生物学和化学领域的难点。三是野生型产脂肪酶的微生物菌株代谢产物复杂，繁琐的提取纯化步骤提高了生产成本，降低了经济效益。因此如何寻找性能更加稳定的新型脂肪酶及构建高产酶水平的基因工程菌株是目前酶制剂行业关注的焦点。
微生物所产的脂肪酶种类最多，由于具有比动植物脂肪酶更广范围的反应温度、反应pH值、以及对底物的选择专一性，使其便于进行工业化生产和获得高纯度酶制剂，这些因素促进了微生物脂肪酶的研究，也极大地带动脂肪酶在各领域中的基础和实际应用等方面的研究。因此，从丰富的海洋微生物资源中开发新型脂肪酶，筛选具有应用前景的脂肪酶具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的海洋微生物来源的热稳定脂肪酶，以使其满足工业上的需要。
本发明的第一个方面公开了一种新型来自放线菌(Streptomyces sp.strainW007)的热稳定脂肪酶，其含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明的另一个方面，提供了一种编码上述脂肪酶的优化的核酸分子，获得在毕赤酵母高表达的热稳定脂肪酶。具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
本发明的第三个方面，提供了一种载体，其包含上述多核苷酸。
本发明的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有上述多核苷酸。
本发明的第五个方面，提供了上述脂肪酶的用途，可用于油脂加工。
本发明的第六个方面，提供了一种生产上述脂肪酶的方法，包括：培养上述宿主细胞，从培养物中分离出表达产物。
本发明的技术方案具体如下：
一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶，是在对放线菌(Streptomyces sp.strain W007)热稳定脂肪酶基因序列进行优化的基础上获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种热稳定脂肪酶基因，序列如SEQ ID NO:1所示。
包含权利要求2所述脂肪酶基因的表达载体。
一种细胞，包含权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的脂肪酶基因。
一种热稳定脂肪酶重组菌株的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备热稳定脂肪酶表达质粒：
a.人工合成权利要求2的基因序列；
b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和SalI分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒；
(2)利用表达质粒制备重组菌株：
a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
b.将转化液涂布于含有100mg/ml Zeocin的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为热稳定脂肪酶重组菌株。
步骤(1)所述PCR的引物序列如下：
MAS1For5’-TACTGGTACCGCCACGCCAGCTGCTGAGGC-3’
MAS1Rev5’-AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。
步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)。
一种生产上述脂肪酶的方法，包括：培养权利要求5所述的细胞，从培养物中分离出表达产物。
上述热稳定脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明获得的MAS1是首个海洋微生物来源的具有热稳定性的中性甘油三酯酶，在pH7.0具有最适酶活性，其对橄榄油的水解反应中，最适温度为70℃；对大豆卵磷脂为底物的水解反应中，最适反应温度为40℃。同时该脂肪酶还具有极好的热稳定性，60℃处理半小时仍然具有95％的酶活性剩余。对有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮)有较强的耐受性。
(2)本发明所得毕赤酵母表达菌株具有良好地水解TAG和DAG等甘油酯的活性，可用于植物油催化甘油酯的水解、生成甘油二酯和制备新型结构脂。采用所述方法得到的重组脂肪酶，具有较高的催化活性和热稳定性。因此，MAS1可作为生物催化剂，应用于食品化工、水解油和脂肪、洗涤剂生产和污水处理等领域中。
附图说明
图1为来自放线菌W007的编码脂肪酶的核酸序列MAS1及其优化后的编码脂肪酶的核酸序列MAS1-optimum(SEQ ID NO:1)。
图2为放线菌W007来源的脂肪酶MAS1在质粒pGAPZαA上的重组子结构图。
图3为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的最适反应温度，以温度对相对酶活力(％)作图。
图4为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的最适反应pH，以pH对相对酶活力(％)作图。
图5为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的热稳定性，以温度对残余酶活力(％)作图。
图6为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的pH稳定性，以pH对残余酶活力(％)作图。
图7为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的温度对脂肪酶酶活的影响。
图8为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的pH对脂肪酶酶活的影响。
图9为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的温度对磷脂酶酶活的影响。
图10为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶的pH对磷脂酶酶活的影响。
图11为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)表达放线菌W007来源的脂肪酶纯化后样品的SDS-PAGE电泳图。泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是纯化后的MAS1。
图12为脂肪酶的脂肪酸底物链长选择性图。
图13为脂肪酶的催化植物油水解反应随时间变化的图，A为富含甘油三酯的茶油水解反应后的各脂类组成，B为富含甘油二酯的油脂水解反应后的各脂类组成。
图14为脂肪酶催化植物油水解的标准色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
脂肪酶MAS1毕赤酵母表达载体的构建
根据Genbank的放线菌W007热稳定性脂肪酶mas1基因(GenBank登录号：WP_007448656)，委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根据毕赤酵母密码子偏好性对序列进行优化(序列SEQ ID NO:1)。基因合成后，利用引物MAS1For：5'-TACTGGTACCGCCACGCCAGCTGCTGAGGC-3'(SEQ ID NO:3)及MAS1Rev：5'-AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3'(SEQ ID NO:4)扩增成熟肽序列，PCR扩增条件：94℃5min；94℃20s，53℃30s，72℃80s，25个循环；72℃7min。PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA(购自Invitrogen)进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含25ug/ml Zeocin)平板。挑取阳性克隆通过Kpn I和Sal I双酶切鉴定及基因测序，结果表明获得了pGAPZαA-MAS1表达质粒。
实施例2
脂肪酶MAS1的重组表达及纯化
将脂肪酶MAS1表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至毕赤酵母X-33(购自Invitrogen)感受态细胞。将转化液涂布于YPD(100ug/mLZeocin)平板，30℃培养3天后，挑取平板上单菌落于100mL YPD培养基中发酵72小时后，离心并浓缩发酵液进行SDS-PAGE检测，获得能够表达脂肪酶MAS1阳性重组菌株。
将重组菌株接种至100mL YPD培养基中，30℃，200rpm振荡培养48-72小时后，收集发酵上清液(10,000rpm，离心20min，4℃)。
将MAS1重组菌株的发酵上清液用0.45μm的滤膜抽滤。后用10kD膜胞(Vivaflow200，Sartorius,Germany)将发酵液置换成20mM pH7.4含30mM咪唑的磷酸盐缓冲液，并将发酵液浓缩到大约30mL。浓缩发酵上清利用镍螯合亲和层析柱(HisTrap HP column,GE Healthcare)，流速1mL/min，最后用20mM pH7.4含500mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱目标蛋白。利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定(见图11)。
实施例3
最适温度及温度稳定性
温度对MAS1脂肪酶酶活的影响：在不同温度(20℃-75℃)条件下，采用比色法测定MAS1酶活。反应体系包括100mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)，1mM对硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenol caprylate，p-NPc)，10μL酶液，各温度下反应5min，测定405nm处的吸光值OD405。温度对MAS1酶活的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果表明MAS1的最适反应温度是40℃，在60℃达到了90％的相对酶活(见图3)。
测定MAS1在不同温度条件下的稳定性时，首先将MAS1在不同的温度(30℃、40℃、50℃、60℃和70℃)条件下温育，分别在0.5h、1h、1.5h、2h取样，采用比色法测定其剩余酶活。温度对MAS1稳定性的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果表明MAS1在30℃-50℃处理2h后，MAS1能保持95％以上的脂肪酶酶活力。在60℃处理1h后，能保持80％的酶活。表明MAS1是一个热稳定脂肪酶(见图5)。
实施例4
最适pH及pH稳定性
pH对MAS1酶活的影响：在不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)条件下，采用比色法测定MAS1酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。使用的各种pH溶液为：100mM NaAc-HAc溶液(pH3.0、pH4.0、pH5.0)，100mMNa2HPO4-NaH2PO4溶液(pH6.0,pH7.0)，50mM Tris-HCl溶液(pH8.0)。pH对MAS1酶活的影响用相对酶活来表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果表明MAS1的最适pH值是7.0(见图4)。
测定MAS1在不同pH条件下的稳定性时，首先将MAS1在不同的pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)条件下放置12h，测定MAS1的剩余酶活力。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。pH对MAS1稳定性的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果表明MAS1在pH3.0-9.0处理2h后，MAS1在pH6.0-9.0保持95％以上的脂肪酶酶活。表明MAS1是一个偏碱性的脂肪酶(见图6)。
实施例5
橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活
在对照组和实验组的100mL三角瓶中，各加底物溶液(4％PVA溶液:橄榄油,3:1)4.00mL和相应pH值缓冲液5.00mL，对照组中加入95％乙醇15.00mL，在特定温度下水浴预热5min，然后，在两瓶中各加待测酶液1.00mL，在特定温度水浴中准确反应15min，在实验组中立即补加95％乙醇15.00mL终止反应，取出。对照组和实验组溶液在自动滴定仪下用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定，以滴定曲线的拐点为滴定终点，记录消耗NaOH标准溶液的体积，按下式计算酶活力。
X＝(V－V0)×1/15×n×c/0.05×50＝200×(V－V0)×n×c/33-1
其中：X为样品的酶活力(U/mL)；
V为滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；
V0为滴定空白时消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；
c为NaOH标准溶液浓度(mol/L)；
0.05为NaOH标准溶液浓度换算系数；
50为0.5mol/LNaOH标准溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；
15为反应时间(min)；
n为稀释倍数。
脂肪酶活力的定义为：1mL酶液于特定温度与pH值的条件下，水解脂肪每分钟产生1微摩尔(μmol)的脂肪酸所需的酶量即为1个脂肪酶单位，以U/mL表示。
结果表明MAS1在以橄榄油为底物的反应中的最适温度为70℃，最适pH值是7.0(见图7和图8)。
实施例6
大豆卵磷脂法测定磷脂酶酶活
在对照组和实验组的100mL三角瓶中，各加底物溶液(4％无油磷脂溶于0.5％PVA)25.00mL，对照组中加入95％乙醇15.00mL，在特定温度下水浴预热5min，然后，在两瓶中各加待测酶液1.00mL，在特定温度水浴中准确反应15min，在实验组中立即补加95％乙醇15.00mL终止反应，取出。空白和样品溶液在自动滴定仪下用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定，以滴定曲线的拐点为滴定终点，记录消耗NaOH标准溶液的体积，按下式计算酶活力。
计算公式X＝(V－V0)*c*50*n/(0.05*t)＝103*(V－V0)*c*n/t式2-1
其中：X－样品的酶活力，U/mL；
V－滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积，ml；
V0－滴定空白时消耗的NaOH标准溶液体积，ml；
c－NaOH标准溶液的浓度，mol/L；
50－0.05mol/L NaOH标准溶液1.00ml相当于脂肪酸50μmol；
n－酶液样品的稀释倍数；
t－测定酶活时的反应时间。
磷脂酶酶活力定义为：在特定条件下1min水解磷脂产生1微摩尔(μmol)量游离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位(U)。Ultra为液体酶制剂，其磷脂酶活力表示为每mL酶液所测得的磷脂酶活力单位，即U/mL。
结果表明MAS1在以大豆卵磷脂为底物的反应中的最适温度为40℃，最适pH值是7.0(见图9和图10)。
实施例7
MAS1的脂肪酸底物链长选择性
不同脂肪酸链长的1mM对硝基苯酚酯作为底物，采用比色法测定MAS1酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。不同链长底物对MAS1酶活的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果表明MAS1对C8底物的水解活性最大(见图12)。
实施例8
富含TAG、DAG茶油的水解
在25mL具塞三角瓶中加入3mL的茶油和来源于茶油的甘油二酯(纯度达到96％以上)，加入经纯化后的MAS1，加脂肪酶量为100U/mL(U/v，相对于油脂体积)酶液，酶液利用20mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释至1mL，混合均匀后预热20min。反应温度为40℃，摇床转速为200rpm，反应过程中分别在0.5h,1h,2h,3h,4h,5h,6h,8h及12h进行取样。将所取10μL样品溶于1mL的流动相中，流动相的比例为：正己烷/异丙醇/甲酸＝15:1:0.003(体积比)，震荡均匀后，于10,000rpm下离心5min，除去下层水相，将上层有机相用0.45μm的有机相滤膜过滤后，取10μL进行HPLC分析。
HPLC检测的条件为：色谱柱为Luna5u Silica100A，250×4.60mm(phenomenex)，流动相为正己烷:异丙醇:甲酸＝15:1:0.003(体积比)；流动相流速为1.0mL/min，柱温保持30℃；进样量为10μL，每个样品检测时间约为30min，数据处理软件为Breeze工作站。脂肪酶MAS1对不同底物的水解反应后各脂类组分含量的变化(见图13)。在脂肪酶MAS1催化的水解甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)反应中，甘油三酯的含量可显著下降，同时生成1,3位甘油二酯和1,2-位甘油二酯(1,3-DAG和1,2-DAG)及自由脂肪酸(free fattyacids,FFA)。表明脂肪酶MAS1可催化水解甘油三酯。在脂肪酶MAS1催化的水解甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)反应中，甘油二酯含量显著下降，同时生成1位或者3位单甘油酯(1/3-monoacylglycerol,1/3-MAG)和自由脂肪酸，表明脂肪酶MAS1可催化水解甘油二酯。
实施例9
有机溶剂耐受性
在MAS1酶液中分别加入各种有机溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮，浓度为50％(v/v)，4℃，放置2h，采用比色法测定MAS1剩余酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。各种有机溶剂对MAS1稳定性的影响用相对酶活表示，未经有机溶剂处理过的MAS1的酶活定为100％。
表1.MAS1对有机溶剂的耐受性

Claims (10)

1.一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种热稳定脂肪酶基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.包含权利要求2所述脂肪酶基因的表达载体。
4.一种细胞，其特征在于，其包含权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的脂肪酶基因。
5.一种热稳定脂肪酶重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备热稳定脂肪酶表达质粒：
a.人工合成权利要求2的基因序列；
b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和SalI分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒；
(2)利用表达质粒制备重组菌株：
a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
b.将转化液涂布于含有100mg/ml Zeocin的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为热稳定脂肪酶重组菌株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR的引物序列如下：
MAS1For5’-TACTGGTACCGCCACGCCAGCTGCTGAGGC-3’
MAS1Rev5’-AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)。
8.权利要求5或6或7所述的方法制备的重组菌株。
9.权利要求1所述的脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括：培养权利要求5所述的细胞，从培养物中分离出表达产物。
10.权利要求1所述热稳定脂肪酶的应用，其特征在于，该脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯。
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