CN116855476A - 一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ ID NO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明利用蛋白质融合技术，在体外对扩展青霉来源的脂肪酶进行蛋白质融合，获得酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白。在国标法的反应条件下，RZⅠ‑WT的比酶活为188U/G，野生型脂肪酶WT的比酶活为138U/g，提高了36％。RZⅠ‑WT最适反应温度提高了5℃，最高比酶活为206U/g。

Description

一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程、酶工程及食品工程技术领域，涉及酶活性和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，尤其是一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用。
背景技术
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类能水解三酰甘油酯的酯酶。其在油水界面可以将三酰基甘油分解为脂肪酸、甘油等，而在有机相中，可以是脂类化合物分解、合成和酯交换。作为一种生物催化剂，脂肪酶参与的催化反应具有立体选择性高、副反应少、反应调节温和的特点。这些特性使得脂肪酶可以在医药、饲料、洗涤、食品加工等多个领域有这广泛的应用。
脂肪酶具有巨大的商业应用价值，是蛋白酶、糖酶之后第三大酶制剂，市场需求大。然而很少天然脂肪酶能够在生产便捷和经济节约等条件下，高效率地催化人们所期望的反应。现有的脂肪酶普遍存在产量低、酶活力不高且在高温条件下容易失活等问题。在食品加工等领域缺乏高催化活性和稳定性的脂肪酶。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ IDNO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
如上所述的脂肪酶融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：
将密码子优化后的融合蛋白基因合成到PPIC9K表达载体上；其中，融合蛋白基因的序列为SEQ ID NO.3所示。
编码如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因。
包含如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因的重组载体或重组菌株。
进一步地，所述重组载体采用的表达载体为通过基因重组制备蛋白质的表达载体PPIC9K、PPIC3.5K中的一种。
进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞是PichiapastorisGS115。
如上所述的重组载体或重组菌株在脂肪酶融合蛋白制备中的应用。
如上所述的脂肪酶融合蛋白在催化油脂水解中的应用。
进一步地，所述脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明利用蛋白质融合技术，在体外对扩展青霉来源的脂肪酶进行蛋白质融合，获得酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白。在国标法(GB/T 23535-2009)的反应条件下，RZⅠ-WT的比酶活为188U/G，野生型脂肪酶WT的比酶活为138U/g(如图3)，提高了36％。RZⅠ-WT最适反应温度提高了5℃，最高比酶活为206U/g(如图4)。
2、本发明主要通过蛋白组合，筛选获得了脂肪酶活性和稳定性提高的融合蛋白。脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
3、本发明脂肪酶融合蛋白较野生型比活性提高了36％，最适温度提高了5℃，提高了扩展青霉脂肪酶的催化效率和最适反应温度，更好的应用于工业生产中。
附图说明
图1为本发明中脂肪酶WT(左)与融合蛋白RZⅠ-WT(右)的表达质粒图谱；
图2为本发明中脂肪酶筛选平板图(红色为GS115空菌、黄色为融合蛋白、蓝色为WT)；
图3为本发明中融合蛋白和野生型在40℃时的比活性图；
图4为本发明中野生型脂肪酶WT与融合蛋白RZⅠ-WT不同下的温度比活性图(最适温度曲线图)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ IDNO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
如上所述的脂肪酶融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：
将密码子优化后的融合蛋白基因合成到PPIC9K表达载体上；其中，融合蛋白基因的序列为SEQ ID NO.3所示。
编码如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因。
包含如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因的重组载体或重组菌株。
较优地，所述重组载体采用的表达载体为通过基因重组制备蛋白质的表达载体PPIC9K、PPIC3.5K中的一种。
较优地，所述重组菌株采用的宿主细胞是PichiapastorisGS115。
如上所述的重组载体或重组菌株在脂肪酶融合蛋白制备中的应用。
如上所述的脂肪酶融合蛋白在催化油脂水解中的应用。
较优地，所述脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
具体地，相关的制备及检测如下：
本发明所用脂肪酶酶活测定方法如下：
脂肪酶的活力测定方法参照橄榄油乳化法(GB/T 23535-2009)：脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯和甘油。所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用酚酞指示剂指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。
酶活单位的定义：在温度为40℃，pH值为7.5的条件下，样品水解脂肪每分钟释放出的1μmol游离脂肪酸，即为1个脂肪酶活力单位(U)。
(1)测定步骤
取4mL橄榄油与PVA的乳化液加入到5mL、25mmol/L的磷酸盐缓冲液(PH7.5)，40℃水浴预热5分钟。实验组加入1mL适当稀释的酶液(公知)，在40℃水浴的条件下反应15分钟，加入15mL 95％的乙醇终止反应，对照的操作方法为：先加入15mL终止液再加1mL适当稀释过的酶液(公知)，用0.05MOL/LNaOH滴定样品和对照中生成的脂肪酸，计算消耗0.05mol/L的NaOH的量。
(2)计算公式
酶活力(U/mL)＝(B-A)×C/0.05×50×1/15×N
B：滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积，mL
A：滴定对照时消耗NaOH标准溶液的体积，mL
C:NaOH标准溶液浓度min/L
0.05：NaOH标准溶液浓度换算系数
50：0.05mol/LNaOH标准溶液1mL相当于脂肪酸50mMol
N：酶液的稀释倍数
1/15：反应时间15min，折算为1min的系数
计算公式为：比活力(U/mg)＝酶活力(U/ml)/蛋白浓度(mg)。
本发明提供高效生产脂肪酶方法，所述方法是在适宜条件下培养表达脂肪酶菌株，并从其培养物中收集脂肪酶。
根据本发明优选的实施方式，所述适宜条件是指培养温度30℃，转速200-220r/min及采用发酵培养基和种子液培养基分别为BMMY、BMGY培养基，其组成如下：
BMMY培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，加40mL水溶解，121℃灭菌20min。然后加5mL10×YNB(13.4％)，5mL磷酸钾缓冲液(pH6.0，1mol/L)，100μL500×生物素(0.02％)，250μL甲醇(终浓度0.5％)。
BMGY培养基(50mL)：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，1mL甘油，加40mL水溶解，121℃灭菌20min。然后加5mL10×YNB(13.4％)，5mL磷酸钾缓冲液(pH6.0，1mol/L)，100μL500×生物素(0.02％)。
酶纯化过程中涉及的部分缓冲液如下(所有溶液配制结束后用水系膜抽滤，纯化蛋白所用水均为过膜水)：
Lysis Buffer：20mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,10mMNaCl,1mMPMSF,pH＝7
Wash Buffer：300mM NaCl,20mM Tris-HCl,8mM咪唑，pH＝7
Elution Buffer：300mM NaCl,20mM Tris-HCl,250mM咪唑，pH＝7
以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：
1)脂肪酶表达载体的合成
通过NCBI数据库查找，得到扩展青霉酶来源的野生型脂肪酶基因序列(SEQ IDNO.1)，经密码子优化后送往苏州金唯智生物科技有限公司合成到pPIC9K表达载体上(如图1左所示)。
2)脂肪酶融合蛋白表达载体的合成
通过NCBI数据库查找，得到RzⅠ蛋白(WP_012738274.1)，将RzⅠ添加到野生型脂肪酶的N端，得到密码子优化后的融合蛋白基因序列(SEQ ID NO.3)送往苏州金唯智生物科技有限公司合成到pPIC9K表达载体上(如图1右所示)。
3)表达载体转入Pichia PastorisGS115
(1)将野生型和融合蛋白的表达载体用SalⅠ单酶切，酶切体系如表1所示：
表1SalⅠ单酶切体系
(2)将将制备完成的样品在50℃条件下反应1h。
(3)反应结束后用纯化回收试剂盒回收酶切产物，电转进入PichiaPastorisGS115中。
4)酶切产物电转到Pichia PastorisGS115中，方法如下：
(1)将80μL感受态细胞GS115与20μL线性化待转化质粒DNA混合，并将其转至预冷的0.2cm电转化杯中；
(2)将装有混合液的电转化杯冰浴5min；
(3)调整好基因导入仪的参数，电击一次，电压1500V，时间一般为5ms；
(4)立即往转化杯中加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀，并将其转至灭过菌的离心管中，30℃条件下孵育1-2h；
(5)将混合液涂于MD板上，每个MD板上约涂200μL的混合液；
(6)将MD板倒置于30℃培养箱中培养2-3d，筛选得到His+克隆，保存转化子。
实施例2：脂肪酶及其突变体在Pichia PastorisGS115中的摇瓶表达和酶学性质测定
1)产脂肪酶菌株的筛选
(1)从转化的MD板上用灭过菌的牙签挑取单菌落按照编号依次点到终浓度为0.5mg/L的遗传霉素(G418)抗性筛选平板上。将该平板倒置于30℃培养箱中培养2-3天。待菌落长出后，从0.5mg/L G418抗性筛选平板上，挑取单菌落直径较大的转化子再按编号点至终浓度为2mg/L的遗传霉素(G418)抗性筛选平板上。
(2)待2mg/L G418抗性筛选平板上的菌落长出后，挑取单菌落直径较大的转化子按编号用同一根灭过菌的的牙签分别点至YPD平板和三丁酸甘油酯筛选平板(酵母膏1％，蛋白胨2％，甲醇1％，三丁酸甘油酯乳液2％，琼脂2％)上。将YPD平板和筛选平板分别倒置于30℃培养箱中培养2-3天，期间每隔12个小时在筛选平板的平皿盖上滴加100uL甲醇。待菌落长出后，此时产脂肪酶的重组酵母菌菌落周围将会出现明显的水解圈(如图2所示)，从而筛选出产脂肪酶的酵母转化子。从YPD平板上相应编号位置，挑取具有较大直径水解的菌落进行摇瓶发酵。
2)摇瓶发酵
从YPD平板上挑取酶活较高的相应编号的转化子和只含有质粒pPIC9K的重组酵母(阴性对照)分别接种于装有30mLYPD液体培养基中，30℃，260r/min摇床振荡培养24h。
以2％的接种量接种于50mLBMGY培养基中，30℃，260r/min摇床振荡培养17h，将菌液转入50mL无菌的离心管中，5000r/min离心5min，尽量将上清去除干净。向离心管中加入20mL含0.5％甲醇的BMMY液体培养基，充分悬浮菌体沉淀，5000r/min离心5min，尽量将上清去除干净。反复用BMMY液体培养基洗2次菌体。
用50mLBMMY液体培养基重悬菌体，30℃，260r/min摇床振荡培养，每隔12h补加一次甲醇溶液，使其终浓度维持在0.5％左右。将诱导96h后的发酵液以8000r/min的转速离心10min，收集上清，按照国标GB/T 23535-2009方法测定脂肪酶活性检测酶活性并进行分离纯化。
2)脂肪酶蛋白的纯化回收
采用镍离子亲和层析的方法进行蛋白纯化，具体纯化步骤：
(1)镍离子层析柱用无菌水和Lysis Buffer过柱，将离心后的上清发酵液与镍离子在冰浴条件下磁力搅拌2h。
(2)结合结束后将上清倒入树脂管(公知)，使其自然流出，树脂沉淀下来。
(3)用枪头吹吸烧杯中残留的树脂，打入树脂管，自然流完，用两倍柱体积的WashBuffer(10mL)洗掉树脂中的杂蛋白，最后用10mL Elution Buffer洗脱目的蛋白，目的蛋白洗脱时先让Elution Buffer与树脂充分结合5min，再将其流出，接收流出的目的蛋白。
(4)选择30KD的置换管(公知)，先用过膜水(公知)充分冲洗置换管的滤膜，再加入过膜水离心20min，清洗干净后将目的蛋白倒入置换管进行浓缩，浓缩至1mL时加入10mLpH7.5的磷酸盐缓冲液进行置换，当置换液剩余1mL时重复上述操作，置换两次，收集收集管中的酶液为纯化后酶液，4℃保存用于酶学性质测定。
(5)对纯化后的脂肪酶WT、融合蛋白RZⅠ-WT进行脂肪酶酶活力检测，测得酶活力(U/mL)除以蛋白浓度(g/mL)获得比酶活(U/g)，野生型脂肪酶WT的比酶活为138U/g，融合蛋白的比酶活为188U/g(如图3)，比野生型脂肪酶WT的比酶活提高了36％。
3)野生型脂肪酶与融合蛋白的最适反应温度
将纯化后脂肪酶WT、RZⅠ-WT蛋白分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下测定酶活(pHxx)，以所测的不同反应温度下最高酶活力为100％，从图4中可以看出，RZⅠ-WT在25℃-45℃温度区间明显有提升，其最适反应温度从25℃提高到了30℃。
本发明中使用的相关序列如下：
氨基酸和DNA核酸序列的命名法：
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母/单字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
在本发明中，WT表示扩展青霉来源野生型脂肪酶的基因序列，如SEQ ID NO.1所示；
ATGGCATTGTCCCTTGCGCGCATGATGCGCCTGGCCCTGGTTGGGCTGGTGGCATTCACTTCAGTTGCCTCAGCGCTGCCTGCGAATCAACTTTCGCGCAGGACGGTTCAGCCTCCCGACAATGATCCGTTCTATCAGCCACCTGCTGGCTACGCATCCAAGGCGCCTGGGACAATCCTGAACCAACGGGACATCACTGCCGCATTCTTTGGTCTCGTCCCGGTTGACGTCGACGCCTATCAGCTGCTTTACCGCACGACTGCAGTCAATGGCTCCGCCATTGCAACAGTTACCACCGTGTTCAAGCCAAAGAACGCTAAACTCGATCGTCTTGTTTCCTTCGCCACAGCCTACGATAGCTCTTCAACGAAATGCCAGCCTAGCTACGCCTACCAGCTCGGTGCGTCGCAAGACAGTTTGATCGCTTCGGTCGAGCTACTGATCATTGAGATCTACCTTGCTCTTGGTTATACCGTCGTTTCTTCCGACTATGAGGGACCCGAGGCTGCCTTTGGACCTGGTCGCCTCGCAGGTATGGGTGTATTGGATGGTATCCGTGCCGCGAAGAGCTTCAAGACCTTGGGTATGACTGATAACCCCATGGTTGTCGGTGTCGGCTATTCAGGCGGTTCCATTGCTACTGGTTGGGCAGCCTCTTTACAGCCCAAGTACGCACCAGAGCTAAACATCAAGGGCTGGGTGCAGGGTGGAACTCCCGCGAACGTTACTGGCACATTGTTCCAGCTTGACAACACAGCCTTCAGTGGCTTACTTCCTCCAGCTTTTGTTGGTCTCTCAAAGCCTAGCGCCTACGGTGCCGACCTGGCCCCTTTCCTCGACAAGGTCGTAACAGCAGAAGGTCAGAAGAAATTGGCCAGCGCCGCCTCCCAATGCTTCACTGCGGATCTTGCATCGTTCTTCGAACAGTCAATCTTTGACACTAGCTTCCAAACTCTAGGCAAGGAGTTCATCTTCGACCCAATCGTTCAGTCAGTGTTGAAGCAGAACACCATGGGTGTCAACAAGGACGAGACCCCGACGGCACCAGCATTTATTTACCACGCCACAGACGATGAAGTTATCCCTTACGCAGATGCCAAAGCTATGGTTAATTCCTGGTGCAACTGGGATGCGACCGTCAAGTTTACTACGTATGCCAGCGGTGGTCACGCGACCACTGAAATCATTGCCATTCCTGAGACCATTCAATTTGTCCAGAATGCCTTTGCTGGCAAGACCAAGAGTGGCTGCACCACAAATACTGAGCTTGGCAGTATTCTCAACCCGCTTGCTCTTGGTGCGGCGCTCGAGCCTATTTTCATAAAGCTCATTGATGCACTGACCCATTTGGGTGATCAGGACTCGAAGGTCAAGAACGACCCCGTCACAGTGCTCAACACAAGCCTTTGA
WT表示扩展青霉来源野生型脂肪酶的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示：MKKLLTVMTMAVLTAGTLLLPAQSVTPAAHAVQISNSERELPFKAKHAYSTISQLSEAIGPRIAGTAAEKKSALLIASSMRKLKLDVKVQRFNIPDRLEGTLSSAGRDILLQAASGSAPTEEQGLTAPLYNAGLGYQKDFTADAKGKIALISRGDLTYYEKAKNAEAAGAKAVIIYNNKESLVPMTPNLSGNKVGIPVVGIKKEDGEALTQQKEATLKLKAFTNQTSQNIIGIKKPKNIKHPDIVYVTAHYDSVPFSPGANDNGSGTSVMLEMARVLKSVPSDKEIRFIAFGAEELGLLGSSHYVDHLSEKELKRSEVNFNLDMVGTSWEKASELYVNTLDGQSNYVWESSRTAAEKIGFDSLSLTQGGSSDHVPFHEAGIDSANFIWGDPETEEVEPWYHTPEDSIEHISKERLQQAGDLVTAAVYEAVKKEKKPKTIKKQMKAKASDIFEDIK。
脂肪酶融合蛋白编码基因经密码子优化后序列如SEQ ID NO.3所示：ACTTCTAAGCAATCTGTTTCCCAGTGCGTTAAGCCACCACCACCACCAGCTTGGATTATG CAACCACCACCAGATTGGCAAACTCCATTGAACGGTATTATTTCCCCCTCCGAGAGAGGTTTGCCAGCTAACCAATTGTCTAGAAGAACTGTTCAACCACCAGATAACGATCCATTTTACCAACCACCAGCTGGTTACGCTTCTAAGGCTCCAGGTACTATTTTGAACCAAAGAGATATTACCGCTGCCTTCTTCGGTTTGGTTCCAGTTGATGTTGATGCTTACCAATTGTTGTACCGCACCACTGCTGTTAACGGTTCTGCTATTGCTACTGTTACTACTGTTTTTAAGCCAAAGAACGCCAAGTTGGATAGATTGGTTTCTTTTGCCACCGCCTACGATTCTTCTTCTACTAAGTGTCAGCCATCTTACGCTTACCAATTGGGTGCTTCTCAAGATTCTTTGATTGCCTCTGTTGAATTGTTGATCATCGAGATCTACTTGGCCTTGGGTTACACCGTCGTTTCTTCTGATTACGAGGGTCCAGAAGCTGCTTTTGGTCCAGGTAGATTGGCTGGTATGGGTGTTTTGGATGGTATTAGAGCTGCTAAGTCTTTTAAGACCTTGGGCATGACTGATAACCCAATGGTTGTTGGTGTTGGTTACTCTGGTGGTTCTATTGCTACTGGTTGGGCTGCTTCTTTGCAACCAAAGTACGCTCCAGAATTGAACATTAAGGGTTGGGTTCAAGGTGGTACTCCAGCTAACGTTACTGGTACTTTGTTTCAATTGGACAACACCGCTTTTTCCGGTTTGTTGCCACCAGCTTTTGTTGGTTTGTCTAAGCCATCTGCTTACGGTGCTGATTTGGCTCCATTTTTGGATAAGGTTGTTACTGCCGAAGGTCAGAAGAAGTTGGCTTCTGCTGCTTCTCAATGTTTTACTGCTGATTTGGCTTCTTTCTTCGAGCAGTCCATCTTCGATACTTCCTTCCAAACTTTGGGTAAGGAATTTATCTTCGACCCCATCGTCCAGTCCGTCTTGAAGCAGAACACTATGGGTGTTAACAAGGATGAAACTCCAACTGCTCCAGCTTTTATTTACCATGCTACTGATGATGAGGTCATCCCATACGCTGATGCTAAGGCTATGGTTAACTCTTGGTGTAACTGGGATGCTACTGTTAAGTTTACTACCTACGCTTCTGGTGGTCATGCTACTACTGAAATTATTGCCATTCCAGAAACCATTCAGTTCGTCCAGAACGCCTTTGCCGGTAAGACCAAGTCTGGTTGTACTACTAACACTGAGTTGGGTTCTATTTTGAACCCATTGGCTTTGGGTGCTGCTTTGGAACCAATTTTTATTAAGTTGATCGACGCCTTGACCCACTTGGGTGACCAAGATTCTAAGGTCAAGAACGATCCAGTTACTGTTTTGAACACTTCCTTGCATCATCACCACCACCATTAA
脂肪酶融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
TSKQSVSQCVKPPPPPAWIMQPPPDWQTPLNGIISPSERGLPANQLSRRTVQPPDNDPFYQPP
AGYASKAPGTILNQRDITAAFFGLVPVDVDAYQLLYRTTAVNGSAIATVTTVFKPKNAKLDR
LVSFATAYDSSSTKCQPSYAYQLGASQDSLIASVELLIIEIYLALGYTVVSSDYEGPEAAFGPG
RLAGMGVLDGIRAAKSFKTLGMTDNPMVVGVGYSGGSIATGWAASLQPKYAPELNIKGW
VQGGTPANVTGTLFQLDNTAFSGLLPPAFVGLSKPSAYGADLAPFLDKVVTAEGQKKLASA
ASQCFTADLASFFEQSIFDTSFQTLGKEFIFDPIVQSVLKQNTMGVNKDETPTAPAFIYHATD
DEVIPYADAKAMVNSWCNWDATVKFTTYASGGHATTEIIAIPETIQFVQNAFAGKTKSGCTT
NTELGSILNPLALGAALEPIFIKLIDALTHLGDQDSKVKNDPVTVLNTSLHHHHHH
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (9)

1.一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，其特征在于：所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ ID NO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
将密码子优化后的融合蛋白基因合成到PPIC9K表达载体上；其中，融合蛋白基因的序列为SEQ ID NO.3所示。
3.编码如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白的基因。
4.包含如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白的基因的重组载体或重组菌株。
5.根据权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于：所述重组载体采用的表达载体为通过基因重组制备蛋白质的表达载体PPIC9K、PPIC3K中的一种。
6.根据权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于：所述重组菌株采用的宿主细胞是PichiapastorisGS115。
7.如权利要求4至6任一项所述的重组载体或重组菌株在脂肪酶融合蛋白制备中的应用。
8.如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白在催化油脂水解中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
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