CN115725634A

CN115725634A - 一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN115725634A
Application number: CN202111011568.XA
Authority: CN
Inventors: 吴燕; 田振华; 王舒; 唐静
Original assignee: Ecolab Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Ecolab Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用。其包括使用含有Fe离子和5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐的培养基培养本发明所述的毕赤酵母基因工程菌。其在含有豆血红蛋白基因表达载体的基因工程菌的培养液中加入了Fe离子和5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐(5‑ALA)，优化了豆血红蛋白诱导表达条件，提高了豆血红蛋白的表达量，相比未优化的培养方案，本发明的培养方案可将豆血红蛋白的表达量提升40％。

Description

一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用。

背景技术

豆血红蛋白是豆科植物根瘤中的血红蛋白，亦称为根瘤血红蛋白，于1939年首次发现。豆血红蛋白与固氮作用密切相关，其通过调节根瘤中游离O₂的浓度，保护由类菌体产生的易受O₂破坏的固氮酶。根瘤中豆血红蛋白的含量与固氮酶活性呈正相关性，根瘤菌侵染大豆根系诱导豆血红蛋白表达后，根瘤才能够正常的进行固氮作用，才能为宿主植物提供生长所需的氮源。豆血红蛋白中血(hemo-)的部分由根瘤菌合成，而球蛋白(globin)的部分则是由寄主(豆科植物)所合成。

随着现代发酵工程技术的发展，近年来科学家们试图通过制造“人造肉”(植物性肉制品)来作为动物来源肉食的替代品，以减少畜牧业带来的环境恶化。目前已有的传统干法挤压技术所生产的植物性肉制品，在颜色和风味方面与动物来源肉制品仍有较大差异，对消费者吸引力不足，拟真性有待提升。豆血红蛋白作为一种植物血红蛋白，是根瘤菌和豆科植物共生体系的特征产物。来自大豆的豆血红蛋白在烹饪过程中会释放血红素辅因子，催化一些生物分子的反应而产生具有肉香风味的化合物。因此，在植物性肉质品中添加大豆血红蛋白，能大幅提高“人造肉”颜色和风味的拟真性，极具应用前景。但是，从大豆根瘤中提取豆血红蛋白的工艺复杂，且植物种植周期长，土地使用效率低，使得大规模提取生产豆血红蛋白成本过高。为提高生产效率，可通过微生物发酵来生产大豆豆血红蛋白。

随着基因工程技术的发展，许多具有经济价值的植物蛋白通过重组技术大规模生产，酵母异源表达是研究基因功能的一种重要方法。目前常用的酵母表达菌株有酿酒酵母、毕赤酵母、耶罗维亚酵母等，其中毕赤酵母是近年来兴起的一个表达系统。据报道，毕赤酵母具有良好的翻译后修饰系统，能够使表达的蛋白形成正确的结构，保持蛋白的稳定性和活性；另一方面，毕赤酵母操作简单，且自身表达蛋白含量较低，降低了对表达蛋白的干扰，也有利于蛋白的纯化，同时毕赤酵母及其代谢产物对于任何哺乳动物均没有毒性，而且它能够进行高密度发酵，培养成本低廉，操作简单，极适合于工业化的大规模发酵生产。

目前，利用转基因合成技术生产的大豆血红蛋白，已经获得了FDA和澳大利新西兰食品标准局(FSANZ)的批准，我国还没有此项批准，相关研究和报道较少。从可持续发展角度来看，基于微生物培养技术制造豆血红蛋白以开发“人造肉”，解决了食品原料和生产方式过程存在的不可持续的问题，经济环保，十分具有应用潜力和科研价值。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用，其在含有豆血红蛋白基因表达载体的基因工程菌的培养液中加入了Fe离子和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，优化了豆血红蛋白诱导表达条件，提高了豆血红蛋白的表达量，相比未优化的培养方案，本发明的培养方案可将豆血红蛋白的表达量提升40％。

为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种豆血红蛋白的表达盒，所述表达盒包含编码如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供一种表达载体，所述表达载体包含如本发明第一方面所述的表达盒。

在某一较佳实施方案中，所述表达载体的骨架为质粒pPIC3.5K。

为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供一种毕赤酵母基因工程菌，其为在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达如本发明第二方面所述的表达载体的基因工程菌。

在本发明一具体实施方案中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供一种豆血红蛋白的制备方法，其包括使用含有Fe离子和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的培养基培养如本发明第二方面或第三方面所述的毕赤酵母基因工程菌。

本发明所述的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的CAS号为5451-09-2。

所述制备方法中，所述Fe离子的浓度较佳地为50-100mM。

所述制备方法中，所述5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的浓度较佳地为40mg/L-200mg/L。

本发明中所述Fe离子可为本领域常规，例如二价或者三价铁离子。

所述制备方法中，所述Fe离子较佳地通过FeCl₃提供。

所述制备方法中，所述FeCl₃的浓度较佳地为80mM。

所述制备方法中，所述5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的浓度较佳地为120mg/L。

所述制备方法中，所述培养基较佳地为BMGY培养基。

在某一较佳实施方案中，所述BMGY培养基的组分为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L，无氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Base Without Aminoacids，YNB)1.34％，生物素(Biotin)4×10^-5％，甘油1％，YNB和Biotin过滤除菌。

在本发明一具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)用含FeCl₃和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的BMGY培养基对所述毕赤酵母基因工程菌进行震荡培养；所述震荡培养的条件优选30℃，250r/min，培养时间为48h-72h；

(2)每隔24h向培养物中加入甲醇至其终浓度为1.5％继续培养，百分比为体积百分比。

以上制备方法中，若无特殊说明，所述浓度为物质在培养体系中的终浓度。

为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供一种诱导剂，其包含Fe离子和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，其中，Fe离子的浓度至少为50mM，5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的浓度至少为40mg/L。

为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供如本发明第五方面所述的诱导剂在制备豆血红蛋白中的应用。

在本发明的一具体实施方案中，所述豆血红蛋白为一种参与豆科植物共生结瘤的豆血红蛋白Lb。

本发明的积极进步效果在于：

在含有豆血红蛋白基因表达载体的基因工程菌的培养液中加入了Fe离子和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)，优化了豆血红蛋白诱导表达条件，提高了豆血红蛋白的表达量，相比未优化的培养方案，本发明的培养方案可将豆血红蛋白的表达量提升40％。

附图说明

图1为pPIC3.5K-Lb重组表达质粒图谱。

图2为豆血红蛋白基因工程菌菌泥图。

图3为SDS蛋白检测图(Line1、2:诱导48h全菌、上清；Line3、4：诱导72h全菌、上清)。

图4为5-ALA浓度对豆血红蛋白Lb表达量的影响。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和本发明的优选实施例进行详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

毕赤酵母GS115菌种购自北京天恩泽科技有限公司；pPIC3.5K购买自Novagen公司；BamH I酶、Not I酶、Sac I酶购买自Thermo Fisher公司；ExnaseⅡ酶购买至南京诺唯赞生物科技有限公司；E.coli Trans 10感受态细胞购买自北京全式金生物技术有限责任公司；2×PCR Master Mix(含Taq酶，buffer，dNTP)购自北京百奥莱博科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，SDS-PAGE试剂盒购买自上海雅酶生物科技有限公司。

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

YPD琼脂培养基：酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加双蒸水至1L，固体培养基需加20g琼脂。注：葡萄糖应在115℃条件下，灭菌15min后再混合，4℃保存。

MD培养基：葡萄糖2g，琼脂2g，90mLddH₂O，灭菌后加入10×YNB10mL和500×生物素0.2mL。

Buffered Glycerol-complex Medium(BMGY)培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L，无氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Base Without Aminoacids，YNB)1.34％，生物素(Biotin)4×10^-5％，甘油1％，YNB和Biotin过滤除菌。

实施例1重组质粒pPIC3.5K-Lb的构建

从NCBI上获得编码NCBI上已报道的豆血红蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot IDP02236.2，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的基因序列，将密码子优化为毕赤酵母(Pichiapastoris)偏好的密码子(优化后的序列如SEQ ID NO:2所示)，并在在序列5’末端加入BamHI限制性酶切位点，在3’末端加入Not I限制性酶切位点，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用引物(Lb-F：GGATCCATGGGTGCTTTCACCGAGAAG(SEQ ID NO:5)；Lb-R：GCGGCCGCTTAGAATGCCTTTTTGATTG(SEQ ID NO:6))对合成的豆血红蛋白Lb基因进行扩增，经ExnaseⅡ酶连接到线性化pPIC3.5K质粒上，重组质粒pPIC3.5K-Lb如图1所示，酶切位点BamH I&Not I。将酶连好的重组质粒转化至E.coli Trans 10感受态细胞，经含50μg/mL卡那霉素的LB平板筛选得到阳性菌株，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，按照生工质粒提取试剂盒对pPIC3.5K-Lb质粒进行提取，并通过乙酸钠沉淀法对质粒进行浓缩备用。

实施例2 pPIC3.5K-Lb转化至毕赤酵母GS115

2.1重组质粒pPIC3.5K-Lb转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中

取购自北京天恩泽科技有限公司的GS115菌种于YPD平板划线，30℃，培养3–4d。待菌落长出后，挑取单菌落于5mL的YPD培养基中，于30℃，250r/min振荡培养过夜至饱和。取100μL的GS115培养物接种于100mL新鲜YPD培养基中，于30℃，250r/min条件下振荡培养至OD600为1.3–1.5，大约培养20h。将100mL细胞培养物于4℃条件下5000r/min离心5min，去掉上清，用100mL冰预冷的无菌水将沉淀重悬，4℃条件下5000r/min离心5min，弃上清；然后再用100mL冰预冷的无菌水将洗涤沉淀一次，然后用10mL冰预冷的无菌1M山梨醇溶液将沉淀重悬，于4℃条件下5000r/min离心5min，弃上清，最后用300μL冰预冷的无菌山梨醇将沉淀重悬，得到毕赤酵母GS115菌体悬浮液，每80μL一管进行分装，置于冰上备用，或放至-80℃冰箱保存。

使用Sac I限制性核酸内切酶对重组质粒pPIC3.5K-Lb进行线性化，经胶回收试剂盒回收线性化片段。取10μg线性化的重组质粒pPIC3.5K-Lb加入80μL上述制备的毕赤酵母GS115菌体中，轻轻混匀，使用设置在1.5KV的Bio-Rad Micro Pulser电转仪和l mm间距Gene Pulser电转杯进行电击。电击完成后，迅速取1mL预冷的1M山梨醇溶液加入到电转杯中，混匀后转至无菌的1.5mL离心管中，30℃条件下摇床(转速为100r/min)培养2h后，5000r/min离心5min弃上清，菌体中加入0.5mL YPD培养基，于30℃、250rpm振荡培养1-2h后取200μL菌液涂板到MD筛选培养基上，将平板置于30℃培养3-5d，直至单个菌落出现。

2.2毕赤酵母菌落的PCR验证

挑取在含有MD筛选培养基上生长的毕赤酵母单菌落接种于5mL的YPD培养液中，在30℃，250r/min条件下振荡培养过夜。取1mL毕赤酵母培养液，12000r/min离心5min，弃上清，用无菌水将菌体洗涤一次，菌体用500μL PBS重悬，12000r/min离心5min，弃上清，用100μL无菌水悬浮沉淀，沸水浴10min，-20℃冷冻30min，再次沸水浴10min，然后15000r/m离心5min，取上清液为模板，以pPIC3.5K质粒通用引物进行PCR扩增，并以空载质粒pPIC3.5K作为阳性对照，以GS115作为阴性对照，引物及其序列如表1所示，PCR扩增体系以及条件如表2、表3。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证，并将验证正确的PCR产物送擎科生物公司进行测序验证。

表1 pPIC3.5K载体通用引物

引物名称	序列(5’到3’)	SEQ ID NO:
			AOX5	GACTGGTTCCAATTGACAAGC	3
AOX3	GGCAAATGGCATTCTGACAT	4

表2 PCR扩增体系

试剂	用量(μL)
		2×PCR Master Mix	25
AOX5引物	1
		AOX3引物	1
模板	1
		去离子水	22

表3 PCR扩增程序

实施例3高拷贝子的筛选

挑取PCR测序正确的阳性菌株均分别接种于含不同浓度抗生素G418的MD平板上进行G418梯度筛选，G418的浓度从0.5mg/mL、1.0mg/mL梯度增加至4.0mg/mL，并通过阳性菌株在G418梯度筛选下的生长状况来判断是否为高拷贝转化子。最终选择能够在高浓度即4.0mg/mL G418的MD平板上生长的转化子即为高拷贝转化子，可用于诱导表达。

实施例4豆血红蛋白Lb的诱导表达

从4.0mg/mL G418 MD平板上挑取较大的单菌落接种于15mL YPD培养基中，于30℃，250r/min条件下过夜(约18h)培养至OD600为2–6，然后取5mL菌液，将菌液离心(5000r/m,5min)去上清，用50mL BMGY培养基重悬沉淀，使每毫升菌液OD600约为1，在30℃，250r/min条件下震荡培养，开始诱导，每隔24h补加甲醇至甲醇终浓度为1.5％继续诱导。分别在48h、72h取样，12000r/min离心，收集菌泥，表达豆血红蛋白的菌株的表型发生了变化，72小时后摇瓶培养物的照片如图2所示，细胞团体颜色为红色说明豆血红蛋白在毕赤酵母GS115中得到表达。取适量菌泥用800μL0.1M PBS(PH7.0)重悬，然后用核酸提取仪进行细胞破碎(speed＝4m/s，10s，4-6个循环)获取胞内蛋白，并用SDS-PAGE检测蛋白表达情况，SDS-PAGE检测图谱如图3所示，豆血红蛋白可溶性较好，但表达量较低。下一步优化诱导表达条件，以期提高豆血红蛋白表达量。

实施例5诱导表达条件优化

从4.0mg/mL G418 MD平板上挑取较大的单菌落接种于15mL YPD培养基中，于30℃，250r/min条件下过夜(约18h)培养至OD600为2–6，然后取5mL菌液，将菌液离心(5000r/m,5min)，去上清，并使用含终浓度为80mM FeCl₃和不同终浓度5-ALA(0mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、180mg/L、200mg/L)的50mL BMGY培养基重悬菌体，使OD600为1，在30℃，250r/min条件下震荡培养，开始诱导，每隔24h补加甲醇至甲醇终浓度为1.5％继续诱导。分别在48h、72h取样，12000r/min离心，收集菌泥，取适量菌泥用800μL 0.1M PBS(PH7.0)重悬，然后用核酸提取仪进行细胞破碎(speed＝4m/s，10s，4-6个循环)获取胞内蛋白，使用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

实施例6豆血红蛋白Lb的活性检测

豆血红蛋白Lb属于细胞色素P450超家族酶，故Lb蛋白与CO结合后在波长420nm处会产生强烈的吸收峰，因此采用此法来检测表达的Lb蛋白是否具有活性。具体方法如下：取实施例4中不同条件下培养的2mL重组酵母GS115/pPIC3.5K-Lb诱导培养液离心，沉淀用PBS缓冲液(0.1M PH7.0)洗涤1次，后重悬于500μl缓冲液中，用核酸提取仪进行细胞破碎(speed＝4m/s，10s，4-6个循环，每个循环结束后冰浴2min)，4℃、10000rpm离心10min，取上清，将上清用缓冲液稀释成1倍(2ml)，并加入亚硫酸钠至终浓度2.5mg/mL，然后通入CO气体，用紫外可见光分光光度计在400nm-500nm波段扫描，然后根据吸光值换算不同5-ALA浓度下Lb蛋白的表达量，结果如图4所示，相比于对照(5-ALA浓度为0mg/l)蛋白含量均有提高，且当5-ALA浓度为120mg/L时蛋白含量最高。

SEQUENCE LISTING

<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用

<130> P21015737C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 145

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 豆血红蛋白氨基酸序列

<400> 1

Met Gly Ala Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Ser Ser Ser Phe

1 5 10 15

Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr

20 25 30

Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Ser Phe Leu

35 40 45

Ser Asn Gly Val Asp Pro Ser Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Gly Gln Leu Lys Ala Asn

65 70 75 80

Gly Thr Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys

100 105 110

Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser

115 120 125

Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala

130 135 140

Phe

145

<210> 2

<211> 435

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 豆血红蛋白核苷酸序列

<400> 2

atgggagctt ttactgagaa gcaagaagct ttggtttctt cttcttttga ggcttttaag 60

gctaacattc cacaatactc tgttgttttt tacacttcta tcttggaaaa ggctccagct 120

gctaaagatt tgttttcttt tttgtctaac ggtgttgatc cttctaatcc aaagttgact 180

ggacacgctg agaagttgtt tggtttggtt agagattctg ctggtcaatt gaaggctaat 240

ggtactgttg ttgctgatgc tgctttgggt tctattcatg ctcaaaaggc tattacagat 300

ccacaatttg ttgttgttaa ggaggctttg ttgaagacta ttaaggaagc tgttggagat 360

aaatggtctg atgaattgtc ttctgcttgg gaggttgctt acgatgaatt ggctgctgct 420

attaagaagg ctttt 435

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AOX5引物

<400> 3

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AOX3引物

<400> 4

ggcaaatggc attctgacat 20

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lb-F

<400> 5

ggatccatgg gtgctttcac cgagaag 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lb-R

<400> 6

gcggccgctt agaatgcctt tttgattg 28

Claims

1.一种豆血红蛋白的表达盒，其特征在于，所述表达盒包含编码如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的表达盒；较佳地，所述表达载体的骨架为质粒pPIC3.5K。

3.一种毕赤酵母基因工程菌，其为在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达如权利要求2所述的表达载体的基因工程菌。

4.如权利要求3所述的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

5.一种豆血红蛋白的制备方法，其包括使用含有Fe离子和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的培养基培养如权利要求3或4所述的毕赤酵母基因工程菌。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述Fe离子的浓度为50-100mM，和/或，所述5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的浓度为40mg/L-200mg/L。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其满足以下条件中的一种或多种：

所述Fe离子通过FeCl₃提供；

所述Fe离子的浓度为80mM；

所述5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的浓度为120mg/L；

所述培养基为BMGY培养基。

8.如权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

9.一种诱导剂，其包含Fe离子和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，其中，Fe离子的浓度至少为50mM，5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的浓度至少为40mg/L。

10.如权利要求9所述的诱导剂在制备豆血红蛋白中的应用。