CN118006583A - 一种在鸡的腺胃和肌胃环境下高活性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种在鸡的腺胃和肌胃环境下高活性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的技术方案中，通过定点突变和插入片段序列的生物技术改造玉米赤霉烯酮降解酶分子结构，获得玉米赤霉烯酮降解酶突变体，该突变体在pH 4.0左右的酸性环境下具有更高的酶活性，使得玉米赤霉烯酮在鸡的腺胃和肌胃里能够被充分降解。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种在鸡的腺胃和肌胃环境下高活性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法。
背景技术
中国是养殖大国，鸡的养殖数量巨大。蛋鸡、肉鸡等养殖数量居于世界前列，鸡蛋、鸡肉也成为国民生活的大宗消费品。在鸡的养殖过程中，玉米、豆粕等成为主要的饲料原料。
霉菌毒素对玉米、豆粕的污染已经成为一种普遍现象。用来饲喂鸡的玉米、豆粕在贮藏的过程中，也可能会造成霉菌毒素的污染。不仅粮食类作物污染霉菌毒素较为普遍，一些中草药也会被霉菌毒素污染。例如，艾草在收割或贮藏的过程中，在多雨、潮湿、高温的环境下会被一些霉菌污染。污染的霉菌有一些会产生霉菌毒素，例如玉米赤霉烯酮等。
玉米赤霉烯酮是霉菌毒素的一种，对人类的危害较大，对鸡的养殖也有非常大的影响，降低产品的品质，降低产品的产量。鸡粪便中的玉米赤霉烯酮会进入到环境中，对环境形成污染。
玉米赤霉烯酮的去除，已有的物理方法工艺繁琐、成本较高；化学方法需要额外添加化合物，化合物一般对鸡的养殖不利，而且也不可能全部去除玉米赤霉烯酮。酶法降解玉米赤霉烯酮具有绿色、安全、高效等潜在的有点。酶法降解玉米赤霉烯酮最简单、便利、高效的方式是在鸡胃进行高效降解。鸡的腺胃和肌胃的食物成糜状，并在不停的蠕动，有利于酶充分作用于玉米赤霉烯酮，从而有利于全部降解。
鸡的腺胃和肌胃pH在4.40或4.02左右(樊红平，候永生。鸡、鸭消化道pH值和消化酶活的比较研究。畜牧兽医学报，2006。)。现有的报道的玉米赤霉烯酮降解酶的最适pH在7.0以上，在pH在4.40或4.02的活性较低。因此，构建在酸性环境pH 4.0具有较高酶活的玉米赤霉烯酮降解酶具有重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种在鸡的腺胃和肌胃环境下高活性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法，旨在提供一种在酸性环境下具有较高酶活的玉米赤霉烯酮降解酶。
为实现上述目的，本发明提出一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
可选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本，分别将亲本第18位突变为丝氨酸、第27位突变为亮氨酸、第34位突变为亮氨酸、第46位突变为亮氨酸，以及于第236位和第237位之间插入丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸得到的。
本发明还提出一种编码如上所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体的基因，所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提出一种载体，所述载体含有如上所述的基因。
本发明还提出一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的载体，或基因组中含有如上所述的基因。
本发明还提出一种在鸡的腺胃和肌胃环境下高活性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第18位突变为丝氨酸、第27位突变为亮氨酸、第34位突变为亮氨酸、第46位突变为亮氨酸，以及于第236位和第237位之间插入丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸。
本发明还提出一种在鸡的腺胃和肌胃高稳定性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第18位突变为丝氨酸、第27位突变为亮氨酸、第34位突变为亮氨酸、第46位突变为亮氨酸，以及于第236位和第237位之间插入丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸。
本发明还提出如上所述突变体，或如上所述基因，或如上所述载体，或如上所述宿主细胞在酸性环境下降解玉米赤霉烯酮的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的技术方案中，通过定点突变和插入片段序列的生物技术改造玉米赤霉烯酮降解酶分子结构，获得玉米赤霉烯酮降解酶突变体，该突变体在pH 4.0左右的酸性环境下具有更高的酶活性，使得玉米赤霉烯酮在鸡的腺胃和肌胃里能够被充分降解。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，以下将做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。
1、材料和仪器说明
(1)试验材料
E.coli BL21和E.coli DH5α在Luria Bertani培养基(10.0g NaCl、10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母提取物)中培养。pET-28a(+)是被用作构建表达含目的基因的质粒，E.coliDH5α作为质粒克隆的宿主，E.coli BL21作为表达宿主菌株。玉米赤霉烯酮购于成都普思生物科技股份有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Mut II快速突变试剂盒V2购买于诺唯赞生物科技有限公司；其他试剂和化学品均购自上海生工生物有限公司(中国上海)。
(2)试验仪器
实施例1野生型玉米赤霉烯酮降解酶的载体构建
玉米赤霉烯酮降解酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的编码序列为SEQ IDNO.2)的氨基酸序列NCBI获得。根据E.coli密码子的偏好，优化玉米赤霉烯酮降解酶的基因序列并委托生物公司合成。以合成的序列为模板，利用引物ZHD-F/ZHD-R进行扩增，扩增引物如下表1所示，PCR扩增体系如下表2所示，PCR反应程序如下表3所示。扩增产物用EcoR I和HindⅢ双酶切，pET28a(+)双酶切体系如下表4所示。酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收得到目的条带。
表1玉米赤霉烯酮降解酶扩增引物
表2玉米赤霉烯酮降解酶PCR扩增体系
表3玉米赤霉烯酮降解酶PCR反应程序
表4pET28a(+)双酶切体系
SEQ ID NO.1：
MRTRSTISTPNGITWYYEQEGTGPDVVLVPDGLGECQMFDSSVSQIAAQGF
RVTTFDMPGMSRSAKAPPETYTEVTAQKLASYVISILDALDIKHATVWGCS
SGASTVVALLLGYPDRIRNAMCHELPTKLLDHLSNTAVLEDEEISKILANV
MLNDVSGGSEAWQAMGDEVHARLHKNYPVWARGYPRTIPPSAPVKDLEA
LRGKPLDWTVGAATPTESFFDNIVTATKAGVNIGLLPGMHFPYVSHPDVFA
KYVVETTQKHL
SEQ ID NO.2：
GGAATTCCATGCGCACGCGTAGCACCATTTCGACTCCGAATGGTATTACC
TGGTATTATAGCCAGGAAGGTACCGGCCCGGATGTTCTGCTGGTGCCGGA
TGGTCTGCTGGAATGCCAGATGTTTGATAGCAGCGTGAGCCAGCTGGCG
GCGCAGGGCTTCCGCGTGACCACCTTTGATATGCCGGGTATGAGCCGCT
CAGCCAAAGCGCCGCCGGAAACCTATACCGAAGTCACCGCGCAGAAAC
TGGCCAGCTACGTGATTAGCATCCTGGATGCGCTGGATATTAAACACGCG
ACCGTGTGGGGCTGCAGCAGCGGCGCGAGCACCGTGGTGGCGCTGCTG
CTGGGCTATCCGGATCGCATTCGTAACGCGATGTGCCATGAACTGCCGAC
CAAACTGCTGGATCATCTGTCAAACACCGCGGTGCTGGAAGATGAAGA
AATCAGCAAAATCCTGGCGAATGTTATGCTGAATGATGTGAGCGGCGGC
AGCGAAGCGTGGCAGGCGATGGGCGATGAAGTCCACGCCCGCCTGCAT
AAAAATTATCCGGTGTGGGCCCGTGGCTATCCGCGCACGATCCCGCCGA
GCGCGCCGGTGAAAGATCTGGAAGCGTTACGCGGCAAACCGCTGGATT
GGACCGTGGGTGCGGCGACCCCGACCGAATCATTCTTTGATAATATTGTT
ACCGCGACCAAAGCCGGCGTGAACATTGGCAGCCTGGTGAGCAGCAGC
CTGCTGCCGGGCATGCATTTTCCGTATGTGAGCCATCCGGACGTTTTCGC
GAAATATGTGGTGGAAACCACCCAGAAACACCTGTAACAAGCTTG
质粒pET-28a(+)用EcoR I和HindⅢ双酶切，将酶切完全的线性化质粒切胶回收。
将回收后的片段和线性化质粒用连接酶连接，得到连接产物。将连接产物转入E.coli DH5α，经菌落PCR验证后转入E.coli BL21(DE3)中表达玉米赤霉烯酮降解酶。
将连接产物化学转化到E.coli DH5α感受态细胞中，具体转化步骤如下：
(1)提前将恒温水浴锅打开，温度调至42℃。
(2)提前将感受态细胞DH5α/BL21(DE3)从-80℃冰箱拿出置于盛有冰的冰盒内让其自然解冻，解冻后即可转化。
(3)将2-5μL质粒加入盛有100μL感受态细胞DH5α/BL21(DE3)的EP管中，将EP管插入冰中冰浴20min。该步骤的目的是让质粒在低温条件下与感受态细胞接近并吸附在感受态细胞表面。
(4)将EP管插入泡沫浮漂中，放入42℃水浴锅内热激90s。该步骤的目的是从低温到42℃的温度变化过程中，感受态细胞的细胞膜通透性发生了变化，通透性由弱变强，质粒得以进入感受态细胞内部。
(5)热激结束后立即将EP管插入冰中，冰浴3～5min。
(6)向EP管中加入800μL的无抗LB，放置于37℃恒温摇床中，250rpm，复苏45min。
(7)12000rpm离心1min，结束后弃上清700uL，用余下的200uL LB将感受态细胞沉淀重悬起来并轻轻吹打均匀。将重悬起来的菌液用移液器移至含50μg/mL的固体LB平板上，用灼烧过的涂布棒将菌液均匀地涂抹开，正置30min直到菌液完全吸收。然后倒置放置在37℃恒温培养箱内过夜培养。
将长出的单菌落进行双酶切鉴定：挑取上述LB固体培养基上长出的单菌落，接种于5.0mL含卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃、200r/min条件下培养过夜，取部分菌液用甘油管保存菌种，各自取适量菌液按质粒抽提试剂盒说明书提取重组质粒。将提取到的重组质粒用EcoR I和HindⅢ进行双酶切，与pET-28a(+)双酶切的体系相同，双酶切后的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析目标基因片段与载体片段。
实施例2突变玉米赤霉烯酮降解酶的编码序列合成和载体构建构建
化学合成插入氨基酸片段的玉米赤霉烯酮降解酶的编码序列SEQ ID NO.4(对应的氨基酸序列SEQ ID NO.3)。插入氨基酸片段的降解酶的编码序列经过酶切、酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收得到目的条带。目的条带与线性化的质粒链接，得到构建的质粒。构建的质粒转化E.coli DH5α(操作同实施例1)。
SEQ ID NO.3：
MRTRSTISTPNGITWYYSQEGTGPDVLLVPDGLLECQMFDSSVSQLAAQGF
RVTTFDMPGMSRSAKAPPETYTEVTAQKLASYVISILDALDIKHATVWGCS
SGASTVVALLLGYPDRIRNAMCHELPTKLLDHLSNTAVLEDEEISKILANV
MLNDVSGGSEAWQAMGDEVHARLHKNYPVWARGYPRTIPPSAPVKDLEA
LRGKPLDWTVGAATPTESFFDNIVTATKAGVNIGSLVSSSLLPGMHFPYVSH
PDVFAKYVVETTQKHL
SEQ ID NO.4
GGAATTCCATGCGCACGCGTAGCACCATTTCGACTCCGAATGGTATTACC
TGGTATTATAGCCAGGAAGGTACCGGCCCGGATGTTCTGCTGGTGCCGGA
TGGTCTGCTGGAATGCCAGATGTTTGATAGCAGCGTGAGCCAGCTGGCG
GCGCAGGGCTTCCGCGTGACCACCTTTGATATGCCGGGTATGAGCCGCT
CAGCCAAAGCGCCGCCGGAAACCTATACCGAAGTCACCGCGCAGAAAC
TGGCCAGCTACGTGATTAGCATCCTGGATGCGCTGGATATTAAACACGCG
ACCGTGTGGGGCTGCAGCAGCGGCGCGAGCACCGTGGTGGCGCTGCTG
CTGGGCTATCCGGATCGCATTCGTAACGCGATGTGCCATGAACTGCCGAC
CAAACTGCTGGATCATCTGTCAAACACCGCGGTGCTGGAAGATGAAGA
AATCAGCAAAATCCTGGCGAATGTTATGCTGAATGATGTGAGCGGCGGC
AGCGAAGCGTGGCAGGCGATGGGCGATGAAGTCCACGCCCGCCTGCAT
AAAAATTATCCGGTGTGGGCCCGTGGCTATCCGCGCACGATCCCGCCGA
GCGCGCCGGTGAAAGATCTGGAAGCGTTACGCGGCAAACCGCTGGATT
GGACCGTGGGTGCGGCGACCCCGACCGAATCATTCTTTGATAATATTGTT
ACCGCGACCAAAGCCGGCGTGAACATTGGCAGCCTGGTGAGCAGCAGC
CTGCTGCCGGGCATGCATTTTCCGTATGTGAGCCATCCGGACGTTTTCGC
GAAATATGTGGTGGAAACCACCCAGAAACACCTGTAACAAGCTTG
实施例3玉米赤霉烯酮降解酶的表达
(1)制备种子液：超净工作台中用接种环沾取保存在-20℃E.coli BL21(DE3)菌株，在含有卡那霉素的LB平板上三区划线，在37℃下的恒温培养箱中倒置培养12h。挑取平板上单菌落接种至50mL含有卡那霉素的LB中。
(2)诱导培养：向含有卡那霉素的LB摇瓶培养基中加入1mL种子液，放置于37℃，220rpm摇床震荡培养，待OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导重组菌表达蛋白，温度降低至18℃，转速降至120rpm。低温诱导蛋白表达16h，6500rpm离心5.0min收集诱导的菌体。用0.9％的生理盐水洗涤菌体两次。同时以未加IPTG的重组菌为对照，操作相同。
(3)超声破碎：将湿菌体：破菌缓冲液(50mM的Tris-HCL，pH8.0)按1：10的比例混合，充分搅拌，使菌体充分悬浮；在冰浴条件下超声破碎菌体，超声条件为：功率70W，工作20min，运行2s，停3s；超声两次，在12000rpm，4℃的条件下离心30min，分别收集上清和沉淀。
实施例4玉米赤霉烯酮降解酶的纯化
经SDS-PAGE验证，表达后的玉米赤霉烯酮降解酶为可溶性蛋白。
重组蛋白C端带有6×组氨酸，组氨酸的咪唑环可与金属离子结合，用Ni2+亲和层析柱可对其进行纯化。目的蛋白选择性的与镍填料进行结合，与杂蛋白进行了分离，而高浓度的咪唑竞争性的与Ni2+结合，从而达到洗脱目的蛋白的作用。Ni-柱亲和层析法具体步骤如下：
(1)用3-5倍柱体积的蒸馏水除去柱中的保护乙醇；
(2)用至少5倍柱体积的结合缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡柱子；
(3)将上清全部加入柱子，收集的流出液再次加入柱子中，使目的蛋白充分与填料结合；
(4)用至少5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子，直到没有黄色液体流出；
(5)用10-20倍柱体积的不同梯度的洗脱缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5-500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，分别收集洗脱液；
(6)洗脱完成后用3-5倍柱体积的结合缓冲液洗涤平衡镍柱，即可用于下一次纯化；
(7)纯化完成后用3-5倍柱体积的ddH2O冲洗柱子，用20％的乙醇填充柱子，4℃保存备用。
上述收集的洗脱液用截留分子量为10.0kDa的超滤浓缩管(超滤浓缩管的规格取决于蛋白分子量，一般为分子量的1/3)对目标蛋白进行浓缩收集，4℃，3000-3500xg/min，离心20min，收集约1.5mL左右目标酶液，弃去收集管内液体，更换Buffer除盐(50mM Tris-HCl，pH 8.0)，重复上述离心步骤3～5次，结束后吸取超滤管中蛋白于EP管内，置于液氮速冻20s后立即取出，-80℃冷冻保存。
实施例5酶活测定
重组酶酶活定义为：单位时间内消耗1μg底物所需要的酶的量为1U。
酶反应总体积为500μL，包含：10μL酶液(浓度0.5mg/mL)、10μL底物ZEN(浓度1mg/mL)、480μL缓冲液(pH 4.0,苯二甲酸氢钾10.12g溶于蒸馏水中，并定容至1L)。上述酶反应体系置于37℃，反应10min后立即用500μL甲醇灭活，冰浴10min，用0.22μm有机滤膜过滤，通过HPLC检测酶活力大小。
HPLC检测条件为：检测器为荧光检测器，激发波长274nm，发射波长440nm，色谱柱为WondaSil-C18色谱柱(150×4.6mmol/L，5μm)，流动相为乙腈:水＝5:5，流速为1mL/min，柱温为30℃。
标准曲线制作：1mg/mL ZEN母液，稀释至0.5，1，2，4，8，16，32μg/ml，用0.22μm滤膜过滤。
实施例6玉米赤霉烯酮降解酶热稳定性的测定
玉米赤霉烯酮降解酶在50℃下孵育0min、2min、5min、7min和10min，然后冰浴60s后测量酶活性。孵育前的活性设定为100％，剩余酶活为起始酶活的50％所需要的时间为半衰期。
(1)玉米赤霉烯酮降解酶最适温度测定
玉米赤霉烯酮降解酶在温度为26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃测定酶活。比酶活最高的温度，为酶的最适温度。
测得本发明突变体玉米赤霉烯酮降解酶比酶活为168.80U/mg，测得最适温度为33℃，测得半衰期为16min。
对比例1
初始序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1，碱基序列为SEQ ID NO.2)表达、纯化同本发明实施例，测得比酶活为146.05U/mg，测得半衰期为1.6min，测得最适温度为37℃。
综上所述，本发明通过定点突变生物技术改造玉米赤霉烯酮降解酶分子结构，突变体在pH 4.0的酸性条件下具有更高的酶活。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本，分别将亲本第18位突变为丝氨酸、第27位突变为亮氨酸、第34位突变为亮氨酸、第46位突变为亮氨酸，以及于第236位和第237位之间插入丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸得到的。
3.一种编码如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求3所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的载体，或基因组中含有如权利要求3所述的基因。
6.一种在鸡的腺胃和肌胃环境下高活性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第18位突变为丝氨酸、第27位突变为亮氨酸、第34位突变为亮氨酸、第46位突变为亮氨酸，以及于第236位和第237位之间插入丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸。
7.一种在鸡的腺胃和肌胃高稳定性的玉米赤霉烯酮降解酶的构建方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第18位突变为丝氨酸、第27位突变为亮氨酸、第34位突变为亮氨酸、第46位突变为亮氨酸，以及于第236位和第237位之间插入丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸。
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