CN108373985B - 一株降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和微生物代谢工程技术领域，公开了一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用，申请人将咖啡因降解的5个基因ndmA，ndmB，ndmC，ndmD和ndmE加上枯草芽胞杆菌168的启动子P43和淀粉酶终止子TamyL，通过同源重组整合解淀粉芽胞杆菌LX‑12的基因组噬菌体位点,筛选后，得到整合菌株解淀粉芽胞杆菌HZ‑12::ndmABCDE，成功实现咖啡因降解。该菌株在500mg/L咖啡因的基础培养基中，对咖啡因的降解率为52.6%，比原始菌株提高31.5%，为低咖啡因茶和咖啡的制作及其废弃物再利用奠定了基础。

Description

一株降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物代谢工程技术领域，涉及一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用。

背景技术

咖啡因又称1,3,7-三甲基黄嘌呤，化学式为C₈H₁₀N₄O₂，属于嘌呤碱，广泛存在于茶，咖啡，巧克力，制药产品及多种饮料产品中。长期摄入咖啡因可导致头痛，肾上腺刺激，肌肉活动不规律，心律失常，骨质疏松，并对心脏病患者有不良影响。怀孕期间摄入咖啡因导致胎儿畸形，降低生育率。因而，开发脱咖啡因饮料和食品非常重要。除了对健康的担忧之外，咖啡因给环境的带来很大影响。茶和咖啡产业的固体废弃物如茶渣、咖啡渣、咖啡壳含有高浓度的咖啡因，咖啡因作为主要有毒物质之一，导致这些富含碳水化合物和蛋白质的固体废弃物无法作为饲料或肥料再利用，茶和咖啡加工厂的流出液由于含有高浓度咖啡因，因此不允许流入湖泊河流。

研究发现，多种真菌和细菌可降解咖啡因，真菌主要包括曲霉，青霉，根霉等，目前对真菌的研究较少；细菌主要包括假单胞菌株，不动杆菌，产碱杆菌属等，其中恶臭假单胞菌株是研究最多的咖啡因降解菌株。WoolfolkCA从1975年开始研究恶臭假单胞菌降解咖啡因途径。Summers等人于2012，2013年找出恶臭假单胞菌株中降解咖啡因至嘌呤的5个基因，分别为ndmA，ndmB，ndmC，ndmD和ndmE，NdmA和NdmB是两个独立的Rieske非血红素铁单氧酶分别具有N-1和N-3专一脱甲基活性。NdmA和NdmB均依赖从NADH转移电子给Rieske还原酶NdmD。NdmC为N-7专一脱甲基酶,与NdmD和NdmE组成一种新型的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)复合蛋白,催化7-甲基黄嘌呤脱甲基生成黄嘌呤，黄嘌呤再由细胞进一步代谢。

恶臭假单胞菌株具有腥臭味，应用在生产低咖啡因茶和咖啡时，对茶和咖啡的风味造成影响，而在解淀粉芽胞杆菌整合表达可解决上述问题；且上述ndmABCDE在恶臭假单胞菌株中诱导表达，当培养基有多种碳氮源时，恶臭假单胞菌株对咖啡因的降解效率降低，不宜工业应用。

本发明提供的整合菌株解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE其整合基因带有强启动子，组成表达咖啡因降解酶达到高效降解咖啡因目的。为生产低咖啡因茶和咖啡以及茶渣等废弃物的再利用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株可高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，所述解淀粉芽胞杆菌于2017年12月18日送至武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017805，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)HZ-12::ndmABCDE, 地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE在降解咖啡因中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一株可高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，申请人通过从已筛选得到的咖啡因降解菌株恶臭假单胞菌株克隆ndmABCDE5个基因，通过SOE，在基因ndmA，ndmB分别加上枯草芽胞杆菌168启动子P43和(淀粉酶)终止子以及各自的上下游同源臂；ndmCDE 三个基因串联作为一个整体进行上述操作，利用同源重组的方式将上述5个基因整合到解淀粉芽胞杆菌LX-12(保藏编号为CCTCC NO：M2015234)的噬菌体位点上，再经过阳性筛选，咖啡因降解率的筛选，最终获得了一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，该菌株已于2017年12月18日送至武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017805，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HZ-12::ndmABCDE, 地址：中国武汉武汉大学。

解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE在降解咖啡因中的应用，包括利用本领域的常规方式，利用本发明提供解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE对咖啡因进行降解，或制备成咖啡因降解剂。

以上所述的应用中，优选的应用步骤包括：

将解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE种子液接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方包括：10-60g/L玉米淀粉，10-60g/L硝酸钠，0.5-1g/L咖啡因，0.1-1.5g/L KH₂PO₄， 0.1-1.5g/LMgSO₄·7H₂O，0.1-1.5g/L无水CaCl₂，0.1-1.5g/L Na₂HPO₄，0.1-1.0g/L FeSO₄·7H₂O； pH 6.0-8.0；

发酵培养条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为容器体积的10-30％，摇床转速200-260rpm，发酵周期34-38h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

恶臭假单胞菌株由于具有腥臭味，不宜应用在制作低咖啡因茶和咖啡上；且其以多种碳氮源作为营养物质，咖啡因降解酶为诱导酶，应用在茶和咖啡的固体废弃物如茶渣脱咖啡因上时，不能专一利用咖啡因，效果甚微。将恶臭假单胞菌株的咖啡因降解相关基因加上强启动子，在解淀粉芽胞杆菌中组成表达脱甲基酶，可有效解决上述问题。整合菌株优化后咖啡因降解率为52.6％，比亲本菌株提高了31.5％，对脱咖啡因茶叶，咖啡的生产和含高浓度咖啡因固体废弃物再利用具有重要意义。

附图说明

图1为ndmA，ndmB，ndmCDE基因琼脂糖电泳图。

其中，泳道M：DL5000DNA分子量Maker；泳道1：基因ndmA扩增产物(片段长度1056bp)；泳道2：基因ndmB扩增产物(片段长度1068bp)；泳道3：基因ndmCDE扩增产物(片段长度3331bp)。

图2为解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE中，利用双交换引物验证的5个基因整合琼脂糖电泳图。

其中，泳道M：DL5000DNA分子量Maker；泳道1：ndmA双交换引物在野生菌株中的扩增产物(片段长度1821bp)；泳道2：ndmA双交换引物在整合菌株中的扩增产物(片段长度3021bp)；泳道3：ndmB双交换引物在野生菌株中的扩增产物(片段长度1722bp)。泳道4：ndmB双交换引物在整合菌株中的扩增产物(片段长度3010bp)；泳道5：ndmCDE双交换引物在野生菌株中的扩增产物(片段长度3026bp)。泳道6：ndmCDE双交换引物在整合菌株中的扩增产物(片段长度5371bp)。

图3为整合ndmA所构建载体T2ndmA质粒图谱。

图4为解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE和起始菌株在发酵培养基中发酵终点测定的咖啡因降解率图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE的获得：

1.重组载体中表达元件的克隆

上述ndmA整合所用上游同源臂ndmA-up是以解淀粉芽胞杆菌LX-12(保藏编号为CCTCC NO：M2015234)的总DNA为模板，通过PCR的方法扩增出ndmA-up的序列SEQ ID NO:1，引物分别为ndmA-upF/R，序列SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3；启动子P43是以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出启动子P43的序列SEQ ID NO:4，引物分别为P43-F/R，序列SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6；上述ndmA基因根据GenBank: JQ061127.1已报道的基因及其附近碱基序列设计简并引物得到，ndmA基因序列SEQ ID NO:7，简并引物分别为ndmA-JF/JR，序列SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9，特异性引物分别为ndmA-F/R，序列SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11，该基因在解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组的737352-737840处整合；终止子以解淀粉芽胞杆菌的总DNA为模板，扩增出的终止子 TamyL序列SEQ ID NO:12，引物分别为TamyL-F/R，序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14； ndmA整合所用下游同源臂ndmA-down，是以解淀粉芽胞杆菌LX-12的总DNA为模板，通过PCR的方法扩增出ndmA-down的序列SEQ IDNO:15，引物分别为ndmA-downF/R，序列 SEQ ID NO:16和NO:17。ndmB与ndmCDE基因与ndmA基因的启动子、终止子相同，相对应的序列所用模板相同。ndmB整合上游同源臂ndmB-up的序列SEQ ID NO:18，引物分别为ndmB-upF/R，序列SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20；ndmB基因由GenBank:JQ061128.1 获得，序列SEQ ID NO:21，简并引物分别为ndmB-JF/JR，序列SEQID NO:22和SEQ IDNO:23，特异性引物分别为ndmB-F/R，序列SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25，该基因在解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组的731083-731595处整合；ndmB整合下游同源臂ndmB-down的序列SEQ ID NO:26，引物分别为ndmB-downF/R，序列SEQ ID NO:27和SEQIDNO:28；ndmCDE整合上游同源臂ndmCDE-up的序列SEQ ID NO:29，引物分别为ndmCDE-upF/R，序列SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31；ndmCDE基因由GenBank:JQ061129.1，GenBank:JQ061130.1， GenBank:KC778191.1得到，序列SEQ ID NO:32，简并引物分别为ndmCDE-JF/JR，序列 SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34，特异性引物分别为ndmCDE-F/R，序列SEQ ID NO:35和 SEQ IDNO:36，ndmCDE基因在解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组的723568-725188处整合；ndmCDE整合下游同源臂ndmCDE-down的序列SEQ ID NO:37，引物分别为 ndmCDE-downF/R，序列SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:39。

对整合表达菌株解淀粉芽胞杆菌HZ-12：：ndmABCDE中表达元件进行了琼脂糖凝胶电泳检测，其琼脂糖凝胶图如图2所示。

2.以T2(2)-ori为初始载体构建ndmA基因整合载体

先将上游同源臂ndmA-up，启动子P43，ndmA，终止子TamyL，下游同源臂ndmA-down5个片段通过SOE-PCR的方法连到一起。通过BamHⅠ/XbaⅠ双酶切，纯化回收后与同样经过BamHⅠ/XbaI双酶切的T2(2)-ori空质粒酶连，酶连温度为4℃，时间为12h，酶连产物随后转化E.coli DH5α，挑转化子进行菌落PCR验证，将PCR验证正确的转化子挑菌接至含有5mLLB培养基的PA瓶中(20ug/mL卡那霉素)，抽质粒并测序，所得质粒为T2ndmA，其质粒图谱如图3所示。

3解淀粉芽胞杆菌高效降解咖啡因工程菌株HZ-12：：ndmABCDE的构建

测序正确的整合质粒T2ndmA转化感受态解淀粉芽胞杆菌LX-12。首先制作感受态解淀粉芽胞杆菌，在LB平板上活化保存菌种，挑取单菌落至含有5mL LB的PA瓶中，37℃过夜培养，2％接种量转接至生长培养基中，37℃，180rpm培养至OD₆₀₀到0.85左右6000rpm 离心6min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，6000rpm离心6min，重复洗涤三次后加入1mL 洗涤培养基重悬菌体，每100μL分装至灭过菌的1.5mLEP管中，-80℃保存。

电转化：8μL质粒DNA加入100μL解淀粉芽胞杆菌感受态细胞，轻柔混匀后转移至预冷的电转杯中，冰浴2-3min，用电脉冲转化仪2.4kV电击，迅速加入800μL电转化恢复培养基，30℃，100rpm恢复培养3h，涂布至含20μg/mL卡那霉素抗性平板，30℃培养24h，筛选阳性转化子单菌落，在含卡那霉素的平板上划线，培养10-12h。挑取适量菌体与30μL 无菌水中，混匀，沸水中煮约15min；12000rpm离心2min，依据菌体量吸取5-10μL作为 PCR模板，进行PCR反应。挑选转入T2ndmA质粒的解淀粉芽胞杆菌。

单交换的菌株的筛选：上述验证正确的B.amyloliquefaciensLX-12阳性克隆子转接于含 20μg/mL卡那霉素的LB培养基的PA瓶中，45℃震荡培养12h，培养物稀释10^-6倍涂布含 20μg/mL卡那霉素的平板，45℃恒温培养箱培养，挑取单菌落在20μg/mL卡那霉素的平板划线，45℃恒温培养箱培养8-10h。

单交换菌株的验证：挑取上述菌体于装有50μL无菌水的1.5mL EP管中，混匀，煮沸15min，离心取上清作为模板，用验证引物进行PCR验证。上游验证引物设计在B.amyloliquefaciensLX-12基因组DNA中距离上游同源臂ndmA-up上游大约100-300bp处，下游验证引物设计在载体多克隆位点下游约100bp处。

双交换菌株的筛选及验证：获得单交换菌株在5mL LB培养基中培养8-10h,稀释10^-4-10^-6，涂布LB平板；对其长出的单菌落分别对应点种于LB平板和Kan的平板上；选取在LB平板生长而在含kan的平板不生长的单菌落进行PCR验证，验证引物分别为B.amyloliquefaciens LX-12基因组DNA中位于ndmA-up上游100-300bp处和ndmA-down下游100-300bp处；若未成功整合，则继续传代，直至出现整合菌株B.amyloliquefaciensHZ-12：： ndmA。

在整合菌株B.amyloliquefaciens HZ-12::ndmA中，按上述步骤整合ndmBCDE基因。最终得到B.amyloliquefaciens HZ-12::ndmABCDE。整合菌株双交换PCR产物琼脂糖电泳图如图2所示。在电泳验证正确的多株整合菌株中，将验证正确的菌株活化后接种至发酵基础培养基中，测定咖啡因降解率，挑选咖啡因降解率最高的菌株保藏。

最终获得了一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，该菌株已于2017年12月 18日送至武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017805，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HZ-12::ndmABCDE,地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE在降解咖啡因中的应用：

挑取解淀粉芽胞杆菌HZ-12：：ndmABCDE单菌落分别接种于5mL LB培养基的PA瓶培中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以2％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到发酵培养基，37℃，240rpm，发酵时间36h。所述发酵培养基的配方为：40g/L玉米淀粉，30g/L硝酸钠，500mg/L咖啡因，1.3g/L KH₂PO₄， 1.0g/LMgSO₄·7H₂O，0.3无水CaCl₂，0.15g/L FeSO₄·7H₂O，0.12g/L Na₂HPO₄。

以起始菌株解淀粉芽胞杆菌LX-12为对照。

解淀粉芽胞杆菌LX-12和HZ-12：：ndmABCDE菌株在发酵培养基中对咖啡因降解率分别为21.1％，52.6％，如图4所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

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gacgatattg ccgacccagc gcggaatgcc gtaagtgccg ctgccgattt ttaagtgaat 60

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgagtctac gtccagtccg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcgctaactt tgattcagac 20

<210> 21

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgaacgaac aactcaagcc tctcctggac gacaagacct acctccgcca tttctggcac 60

cccgtatgca ctctcaatga atttgagcgt gccaattcga gcgggcatgg cccgatgggg 120

gttaccctgc taggagagcg gctggtactc gccaggctga actcgaaaat cgttgctgcg 180

gcagaccgat gcgcgcatag gtctgcccag ttgtccatcg ggcgagtttg cagccatgca 240

gggaaagatt atctggagtg cccttatcac ggctggcgct acgatgagga aggcgcttgc 300

aagctgattc cagcttgccc agacaagagc atctctcctc gcgccaaaat cagttcgtat 360

gattgtgaag tgaagtacgg gatcgtgtgg gttcggctag ataatagttt tgactgcaca 420

cagattccgt atctgagcga ctacgacaac cccgacatgc aggttatagt tgcagactcc 480

tatatctgga ataccgtggc cgagcggcgt tgggagaact tcacagactt ttctcatttc 540

gccttcgttc atccaggcac cttgtacgac ccattctttg ctagtcaccc cacggtttat 600

gtaaatcgag ttgacgggga aatgcagttc aaacttgctc cgccgcgaga aatgaagggt 660

attcccccag aagcccccat gggtgatttt acctaccgct gcaccatgcc gtactccgta 720

aaccttgaaa tcaaattgtg gaaagacgac tcccgcttca ttttgtggac taccgccagt 780

ccggtcgatg cctcgacctg tcgtaacttc atgattatcg tccgtgagaa agataaccaa 840

ccggatcata tgcatttggc tttccaaaag cgtgtgttgg atgaagatca gccagtcatt 900

gaatctcagt ggccgctgga gatccaaacg tccgaggtct ccgtggcgac tgataaagtc 960

tccatccaat tccgtaaatg gcataaggaa ctgtctcttg cagcggttga agggcgcgat 1020

gcgtttcgtg agtcggtttt gacaacggtt atcgaagaag agcagtaa 1068

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ytcngcdaty tcnckytcrt t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtraangtna cncccatcat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtgaacgaac aactcaagcc 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttactgctct tcttcgataa c 21

<210> 26

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcactttctg tccctgccca tcgcgaaggc gtttaatgaa tgcggcaaat gtcgctttca 60

gctgatcgtt ttccgcgaca ggaagagcga tgacatcgaa attctccgtt tcagccgcag 120

ctaaaaaatc cgtatagtct gagttgaccg gtgctttatc agttcctccc gcgagacgga 180

tgcctgcctg cgggtttaac gtttccccgg attcttcctc agtgcctgtc agcgggatgg 240

aagccgacag ttcgcccgtt cccgtaaatg tgacatagcc gtttgctttt aattcttcgg 300

cttttttcac cgtttgtttg tcaacttccg cttcatccat gtaagtggtc acatcgaaag 360

aggtctgatc aaggacgttt tcactgatgc ggatgatgat gtcattccct tttgaacccc 420

cgtacaaagc ggttgcttta acaccttgcg aaagatctgc gctcgctctg attccctctg 480

tcagacggta catcaaaacg gtttttgctt tctttttcgc ctcacgaagc agaatcagtg 540

acggatcttc aatactgagc 560

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcactttctg tccctgccca tc 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gctcagtatt gaagatccgt 20

<210> 29

<211> 581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttgtcgtgat ctttcagttt cagctcgagc ggcgaaacgg aggtcacttc ggccggcatc 60

agctccaccg gcgcttcagc gtcaaccgct ccgacagcta aatgtttaat ggcatcactt 120

aatctcatca ggctgtcccc tccggaagtg aatttttctc cgtgacgtca atcgtcatgg 180

tatgttttgt tccttggaat tcatggcggt ccgtatctac ataataggtt ttcttcagcc 240

cgatttccgg aattgaaata tagacgggca atccgctttc caacccagga ataccgatcg 300

cctgtatatt tttcagctct ttcttaatgc cttttttctc agcctgcttc acttttgcgc 360

gctgtttcag ctgggcttcg ttaatgtcgt cagaaaccgt ttcggtatac tgcaaaacgc 420

cgaatgtttt catgccggcg ctgtctgagg cggaagcctt tatcgtttta ttgtcttttt 480

gcagccgcat gacgacacgg gttgcggtgt catcaattga ggtgctgtat tgataccctg 540

taatattaac tcctgtttcc agcacccata tgtcagacgg c 581

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttgtcgtgat ctttcagttt c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gccgtctgac atatgggtgc 20

<210> 32

<211> 3331

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atgtcctctg atgaagttat tttcaatgat tggcatccag tcgctgcttt ggatgatgtg 60

gcactggata agcgctatcg ctgccgactg ctcgggcgaa ctgtcagcta cgtaaaaagc 120

gttgaaggtg tgaacgcctt ttgggagcag agtgaagaat ccgtatcccg cattcgcgcc 180

agggaaattt atggagttct ctggttgtca tttgccgagc agcccacgga aatgtttgac 240

attccggaat ttaacgaagc ggatcgccgt attgttagtg cgggttctgt acgtgtcaat 300

gtgtccggcc tgcgcgccat cgagaatttt ctggttatgg cgcacttccc atttgtgcat 360

accgatattc tcggagctga gccattgacc gaggttgaac cttacaaggt tcaccacgat 420

gaagagaaag atgagatatt cgcgacagaa tgtcgatttc ctcagcccaa gggttctgct 480

acagcagtag aacctattga catgcagtac atttaccgag ttactcggcc atattcagca 540

attctttata aaacttgtcc cccacagccg gatcgttggg atgctttggg gctctttatc 600

cagcctgtcg atgaggattg gtgcatcgct cacaccatca tgtgttacgt cgatgaggtc 660

aactcgggtc agcagcttcg acacttccag caaacgatct tcggccaaga cctgatgatc 720

ctgatcaacc aggtacccaa acgtcttccc ttggctgcta gtcgtgaaag cccagtgcgt 780

gctgatgtct tggccacggc ctatcgtcga tggatgcgtg agaagggcgt gcagtacgga 840

actctgcggg actgaataac aagaattgat aaagaggtaa gtgccgtgaa taaaattgac 900

ttgaaccagt ggttccccat cgccactcct gaagatcttc ccaaacgaca tgtatatcac 960

gcgacgctga tggggcaaga gatggcgatc tggcgagacg acaacggagt cgttaacgtc 1020

tgggaaaacc gttgtcctca ccgcggtctc cgcctgaccc tgggagcgaa taccggcacc 1080

gagctccgct gccaatacca cggttggact tatgaaaccg ggacgggcgg atgcacgttc 1140

gtccctgcac atcgcgatgc caccgagccc agtaaagccc gagtgaatac attccctgcg 1200

cgtgagaagc atggtctgat ttggacgtca ttggggcagc cagagggaga gccaatttcc 1260

attcttgacg atgcgcaatt agtcaatgct gtaaaaacca atcttcacag cactgttgta 1320

gctactgata gcgaccttct gatcagtgtc ttgcgagcaa acctgtctgc gttcgtcgat 1380

gtctttggag tcaccgatgt cgatgatttg cacttgaaaa ccatgcagca cgaccgagcg 1440

atactcgtca cgagggtggg ctcgcttgca atccatcttt acctgcagcg cgctacggtt 1500

acaaagacgc tcgtccatgc ccaggccttg acgtcaggtc gctcaggtta tgagctgcag 1560

aaaagtttcg cggtcgccat gaactctatc cgacgattgt cagaggctgc gacgtcgcag 1620

ctaattcata tcaaggacat cagtgagcag actgtcgaca acgttgaggc ggtgaaagag 1680

aacctgacta aagcgcctcc tagtgaatat atctgtgaag tcgtgaaccg tgctcaggag 1740

accagtgaca tctgctcgta ctggctcaag cctattgggc acccgttgcc ggcattcaca 1800

gcgggcatgc acatcagtat caccacgccc gaagggtgca tccggcagta ttcgttagtg 1860

aatgcaccag gggagcaaga gtccttcatc attggcatca aaaaagaact gcagtcgcgc 1920

ggcggttcga aatcgatgca tgaacaggtg aaagtcggca cccagttgaa ggtaacgctc 1980

cctcgaaacg gcttcccttt cgtagagacg ggtaagcatc ccatcctagt ggctggcggg 2040

atcggcatta ctccgatcct ctgtatggct caagcgctga gtcagcaagg ggcgccattt 2100

gagatccact atttcgcccg cggtgaggag tacgttcctt tcctggagcg gctgaccgcc 2160

ttgggcgaga atttgaacct gcacttcggc cttgggcctg atgaaaccaa ggcaaagccc 2220

gctgatatct tatgggagca cgagcctcag agtatcgaca tttatacttg tggcccgcag 2280

ccgatgattg aaaccgtttc ggctgtggcc attgcccatg gtgtggctga agagtcaatt 2340

cggttcgagt ttttcagtaa gaaaaatgat actcctgttt ctgacgagga gtacgaagtt 2400

gaacttggaa aatctggtca aagcttcatc gtgccggcag gttcaacgct attgcaggct 2460

tgcttggaca ataatgtgca gattgaggtt tcctgcgagc agggcgtctg cggcacctgc 2520

ataactgcgg ttatttctgg cgatctcgaa caccacgata cctatctttc caaaaaggaa 2580

agagaaagtg gcaagtggat catgccgtgt gtttcacgct gcaaatccaa gaaaattgtt 2640

ctcgacctgt gaggccctaa ccgtgattac actctatgac tatgagcttt ccggaaactg 2700

ctacaaggtg agactatttc tgtcgatcct taacttggat tacaagaccg agcctgtgga 2760

gttctatcct tcccgtgaac gcaagtcgga gaaattcctt aaaataaatc cgctcggaca 2820

gcttccggca atcagtgatg gtgatctcgt cctgcgcgat gcccaagcca ttttggttta 2880

cttagccacg cagtgcgacg agaccggata ctggtaccca accgcacgac ccgatctgat 2940

ggccgaagtg cagatgtgga tggcctttgc tgacagcctg accagcacca tctctgcggc 3000

tcggctgcat gatcttttct tcttcgagtt cgatgtacag tcctgccgtc atcgcgctca 3060

tgatctgctc agaattctgg acgagcatct ctggttctgt gatctgaagg ggcttcagta 3120

catctgtagc tcgttgcatc cgacgattgc tgatatcgct tgcttcccct acatcgcatt 3180

ggccgatgaa ggtggggtgt cacttgagga ctatccggct atccgtcgct gggtagatcg 3240

cgtcaagcgt cttccagggt tcaccgtcat gtcaggcgtc ttccccacat cgttggcttt 3300

cgacagttca gcgaagcaga tcagcgcgtg a 3331

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaygtnttyt tyaayggntt ygg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccngcyttyt gcatraartt ytc 23

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atgtcctctg atgaagttat 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tcacgcgctg atctgcttcg 20

<210> 37

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gacattgctg atcgagccgt atcggctttt aatatagccg atagcggcag cggcgttgtg 60

gattggattt ctgatatcat tcatgcccgg cgctttgtga tcttcaaagg tgctcggaat 120

cgtctgcata agcccctgtg acgggtgtcc ggctttggcg ttgctgtccc atagattaat 180

ggaattaggg ttgccgcctg actcatgctg tgcgatcgtc attaatcccg gaagccagct 240

gatcggcgta ttggttgctt tcattgcggc caaaagccat tctttgacgc ttccttccgc 300

tgcacccatg ccggaaaagg ctgctgcaag cgagcctgcc tgtttttccg catatttttt 360

cacgtcaact gagctgagac ctttgacgac gccgactgaa gcaaagcgtc cgagactcat 420

catgacacgg gaaggagagt gaatatcaag ctcttccctg aatgcgtcct cgactttttt 480

ggccatatct ttggccgcct gtttgacttc gcttcctttt gcagtcatcc ctgatacgaa 540

gtg 543

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gacattgctg atcgagccgt a 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cacttcgtat cagggatgac tg 22

Claims (5)

1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC No:M2017805，命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HZ-12::ndmABCDE。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在降解咖啡因中应用。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备咖啡因降解剂中的应用。

4.利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌降解咖啡因的方法，其步骤包括：

（1）将解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HZ-12::ndmABCDE种子培养液接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：10-60g/L玉米淀粉，10-60g/L硝酸钠，0.5-1g/L咖啡因，0.1-1.5 g/L KH₂PO₄，0.1-1.5 g/L MgSO₄·7H₂O，0.1-1.5 g/L无水CaCl₂，0.1-1.5 g/L Na₂HPO₄，0.1-1.0 g/L FeSO₄·7H₂O；pH 6.0-8.0；

所述发酵培养条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为容器体积的10-30％，摇床转速200-260rpm，发酵周期34-38h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述种子培养的条件为：培养温度为30-39℃，装液量为容器体积的15-25％，摇床转速160-240rpm，培养时间为7-10h。

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