CN106434503B - 高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌 - Google Patents

高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一株高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌，该菌株分类命名为橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.12831。在链霉菌基因组中插入一段AO基因，再通过抗性筛选和发酵培养重组链霉菌。将经密码子优化的AO基因，通过phic31整合酶整合入基因组，再通过抗性筛选和基因型筛选，得到重组链霉菌菌株。本发明整合入新的基因后，可提高18.7％葡萄糖异构酶基因的表达。

Description

高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一株高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌及其应用。
背景技术
葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase,GI)，编号：EC 5.3.1.5(木糖异构酶)。具有将醛糖异构化为相应酮糖(比如转化葡萄糖成果糖)的活性。工业上普遍采用该酶，以葡萄糖浆为底物，将葡萄糖异构化为果糖后获得果葡糖浆产品。
葡萄糖异构酶的生产菌株多样，诺维信报道用凝结芽孢杆菌和鼠灰链霉菌生产葡萄糖异构酶，杰能科报道用米苏西里游动放线菌和锈赤链霉菌进行生产葡萄糖异构酶。国内曾经投入生产的菌株以山东省食品发酵工业研究设计院贺家明等人筛选出来的7号淀粉酶链霉菌为基础，后经中国科学技术大学徐冲等人进行基因工程改造，在中科大易元生物技术有限公司产业化。
用橄榄产色链霉菌生产葡萄糖异构酶早在1976年的US3957587里面已经提到，以橄榄产色链霉菌21114作为起始菌株，经紫外线照射诱变得到一系列的突变菌株，其中有几株菌株的产酶能力得到大幅提高。但是对于橄榄产色链霉菌的基因组测序和葡萄糖异构酶基因的测序一直未见报道，关于该菌株的基因工程也未见报道。
phic31重组酶发现后，有多篇文章将其应用到链霉菌的基因工程里面，pSET152载体为典型代表，其上面有phic31重组酶和attP位点，phic31重组酶可催化载体上的attP位点与基因组中的attB位点或假attB位点进行特异性重组，重组后可引导载体上的序列插入基因组中，由于潜在的多位点特异性重组，可能获得经多位点整合后的多拷贝重组菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌株及其应用。旨在提高现有橄榄产色链霉菌菌株的葡萄糖异构酶酶活，使所构建的菌株更适合工业生产需要。该菌株分类命名为橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.12831。
本发明的目的还在于提供一种构建高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌的方法。
本发明的目的还在于提供一种葡萄糖异构酶基因及重组载体。
本发明的目的还在于提供上述方法、基因及重组载体的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一株高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌株，该菌株分类命名为橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.12831。
上述的高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌株在生产葡萄糖异构酶中的应用。
一种构建高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌的方法，在链霉菌基因组中的attB或假attB位点插入一段AO基因得到重组链霉菌；所述的AO基因是指经密码子优化的葡萄糖异构酶基因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的AO基因上游可操作性连接双启动子，所述双启动子是由链霉菌强启动子kasop和SF14构成，顺序为kasop-SF14或SF14-kasop作为AO基因的启动子启动AO基因的表达。所述的双启动子kasop-SF14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体构建步骤为：将双启动子kasop-SF14连接于AO基因上游，将重组得到的基因kasopSF14-AO插入pSET152载体中，构成重组整合载体pSET152-kasopSF14-AO；用接合转移的方法将pSET152-kasopSF14-AO载体经大肠杆菌ET12567(pUZ8002)转入橄榄产色链霉菌中得到重组链霉菌。
一种序列优化的葡萄糖异构酶基因AO，其具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
一种重组载体，将上述的AO基因和双启动子kasopSF14插入pSET152载体中，构成的重组载体pSET152-kasopSF14-AO。
上述的方法、葡萄糖异构酶基因或重组载体pSET152-kasopSF14-AO在提高橄榄产色链霉菌葡萄糖异构酶酶活和生产葡萄糖异构酶中的应用。
一种生产葡萄糖异构酶的方法，发酵上述的重组链霉菌，得到葡萄糖异构酶。
本发明所述的提高橄榄产色链霉菌葡萄糖异构酶基因表达的方法，通过phic31重组酶将一段葡萄糖异构酶基因AO插入橄榄产色链霉菌基因组中，抗性筛选得到阳性转化子后，再通过发酵培养检测葡萄糖异构酶酶活。
具体的，将双启动子kasop-SF14连接于经密码子优化后的AO基因上游，然后将得到的重组基因插入pSET152载体的XbaI和BamHI位点中，重组载体转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。经接合转移大肠杆菌和橄榄产色链霉菌，用硫酸安普霉素进行抗性筛选。因为pSET152载体没有链霉菌的复制起始位点，所以不能进行自我复制，抗性筛选中非重组的转化子就会被筛选到，得到的转化子就应该是整合了重组pSET152载体的重组菌，为了保险起见，我们用PCR(巢式PCR)的方法鉴定转化子，确定转化子里面有AO基因。
用该方法我们也尝试了插入其他基因，如来自游动放线菌的葡萄糖异构酶基因，都可以得到阳性转化子。
attB为一段核心为23bp的基因片段，由于链霉菌基因组中有attB和其他一些相似性比较高的序列，所以可能会形成多个位点的特异性整合，可以进行重复的接合转化，以获得更多拷贝的重组菌。
使用非甲基化的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)作为携带重组整合载体的供体菌来进行，比其他的甲基化大肠杆菌效率更高，在转化后16-20h通过添加萘啶酮酸来杀死大肠杆菌，最后得到的转化子都为链霉菌。
再生培养基为2CMY培养基，接合转化混合液涂抹在2CMY平板或MS平板上16-20h后用硫酸铵普霉素连同萘啶酮酸进行抗性筛选。硫酸安普霉素的浓度为25ug/ml。
本发明所述的重组菌株的鉴定方法，是通过PCR和其他基因鉴定的方法，如果能够获得含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，则证明为本发明的重组菌株。
本发明所述的重组基因和重组菌株在提高橄榄产色链霉菌葡萄糖异构酶酶活中应用。
本发明的有益效果：
本发明获得了一株具有提高的葡萄糖异构酶生产能力和酶活的菌株。
附图说明
图1为重组载体pSET152-kasopSF14-AO的结构图
具体实施方式：
下面结合实例对本发明的构建过程做进一步阐述，下述说明中相关实例是说明性质的，不能限定本发明的保护范围。
实施例1重组载体的构建
在南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因kasopSF14-AO，上下游分别带有酶切位点Xba I和Bam HI序列，然后插入pUC57的EcoR V位点中。
用Xba I和Bam HI双酶切插入了kasopSF14-AO基因的pUC57载体。同时用Xba I和Bam HI双酶切pSET152载体。
回收酶切产物后，用TAKALA的DNA连接酶I进行连接，转化大肠杆菌DH5a，涂在含50ug/ml氨苄青霉素抗性的LB平板上进行抗性筛选。
对得到的平板转化子进行PCR鉴定，得到含有重组载体pSET152-kasopSF14-AO的大肠杆菌阳性转化子，载体结构见图1。
实施例2重组载体转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)
从DH5a重组菌中提取质粒pSET152-kasopSF14-AO，通过CaCl2法化学转化pSET152-kasopSF14-AO载体入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。
对得到的平板转化子进行PCR鉴定，得到含有重组载体的pSET152-kasopSF14-AO的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)阳性转化子。
实施例3大肠杆菌ET12567(pUZ8002)阳性转化子和橄榄产色链霉菌通过接合转化进行橄榄产色链霉菌重组菌构建
接菌重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002)于LB培养基中，培养基中含50ug/ml的卡那霉素，25ug/ml的氯霉素，50ug/ml的氨苄青霉素。37℃，220rpm过夜。然后取600ul过夜菌液于30ml含有以上三种抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm 5h。收集菌液，5000rpm离心10min后，去掉上清，收集菌体，用1ml的冰LB液体培养基重悬两次，4℃5000rpm离心3min后去上清，再次用500ul冰LB重悬，置冰上备用。
接橄榄产色链霉菌于YMS平板上，30℃培养3天。在平板上加9ml无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子，将孢子悬浮液收集于50ml离心管中，并在振荡器上尽可能激烈的震荡1min左右。然后将震荡后的悬浮液用装有两层滤纸的漏斗过滤，3000rpm 10min离心过滤液，迅速倒掉上清，震荡，使孢子沉淀物分散于残余的无菌水中。调节孢子悬浮液浓度至OD600＝2。
获得橄榄产色链霉菌孢子悬浮液后进行孢子预萌发处理。在无菌条件下，加500ul2*YT培养基于离心管中，将孢子悬浮液加入到离心管中，50℃10min，5000rpm离心5min，去上清。然后用500ul 2*YT培养基重悬得到预萌发的孢子悬浮液，备用。
接合转移：500ul大肠杆菌ET12567(pUZ8002)与500ul橄榄产色链霉菌孢子悬浮液颠倒混匀，离心去上清，用残余液体重悬菌体，取100ul菌液涂布于MS平板上，30℃培养。
30℃培养16h后用1ml无菌水含500ug萘啶酮酸和1mg硫酸安普霉素覆盖，30℃培养3天长出转化子。
实施例4 PCR鉴定
选取载体上的随机一段序列连同AO基因进行鉴定，可以是抗性筛选基因Ap的一段连同AO基因或者是phic31重组酶的一段序列连同AO基因，或者其他载体上片段连同AO基因。PCR之后回收PCR产物进行基因测序，鉴定阳性菌株。
实施例5发酵培养并进行筛选
1.阳性克隆的平板活化
平板活化培养基配方：可溶性淀粉0.4％，酵母粉0.4％，麦芽糖1％，六水氯化钴0.005％，琼脂粉1.7％。
划线或涂布后30℃培养72h至菌落生长良好。
2.菌种活化
菌种活化培养基配方：麦芽糊精1.0％，玉米浆3.6％，无水硫酸镁0.05％，七水硫酸钴0.024％，玉米芯粉1％
挑取平板上菌落接种于活化培养基后30℃培养48h至菌液生长良好。
3.摇瓶发酵
培养基配方为(g/mL)：无水硫酸镁0.05％(0.05g无水硫酸镁每100ml溶液中)，硫酸锰0.03％，玉米浆(pH7.0)5％，玉米芯粉5％，糊精2.5％，豆饼粉0.5％，蔗糖2.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，七水硫酸钴0.12％，硝酸铵0.2％。将活化的菌液以10％的比例接种于发酵培养基中，发酵控温30℃，培养96h测定葡萄糖异构酶酶活。
葡萄糖异构酶酶活测定方法为半胱氨酸-咔唑法。经酶活测试，筛选得到一株菌株1-4-7(该菌株分类命名为橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.12831)，酶活96h较原始菌提高18.5％。
原菌酶活(u/L) 1-4-7酶活(u/L) 提高比例
5122 6070 18.5％
Figure IDA0001114627090000011

Claims (9)

1.一株高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌株，该菌株分类命名为橄榄产色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes），于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO. 12831。
2.权利要求1所述的高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌株在生产葡萄糖异构酶中的应用。
3.一种构建高表达葡萄糖异构酶的重组链霉菌的方法，其特征在于在橄榄产色链霉菌基因组中插入一段AO基因得到重组链霉菌；所述的AO基因为一段经密码子优化的葡萄糖异构酶基因序列，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，且所述的AO基因用kasop和SF14两个链霉菌强启动子构成双启动子kasop-SF14或SF14-kasop，启动AO基因的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的双启动子kasop-SF14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求3~4中任一所述的方法，其特征在于将AO基因和双启动子kasopSF14插入pSET152载体中，构成重组整合载体pSET152-kasopSF14-AO；用接合转移的方法将pSET152-kasopSF14-AO载体经大肠杆菌ET12567（pUZ8002）转入橄榄产色链霉菌中得到重组链霉菌。
6.一种序列优化的葡萄糖异构酶基因AO，其具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
7.一种重组载体，其特征在于是将权利要求6所述的基因和双启动子kasop-SF14插入pSET152载体中，构成的重组载体pSET152-kasopSF14-AO。
8.权利要求1所述的重组链霉菌株，权利要求3~5中任一所述方法、权利要求6所述的基因或权利要求7所述的重组载体在提高橄榄产色链霉菌葡萄糖异构酶酶活和生产葡萄糖异构酶中的应用。
9.一种生产葡萄糖异构酶的方法，其特征在于发酵权利要求1所述的重组链霉菌，得到葡萄糖异构酶。
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