CN114107146A - 一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用 - Google Patents

一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal，构建了D‑丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌WS9DAL。以枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌WS9DAL为表达宿主，构建了三株表达麦芽糖淀粉酶的基因工程菌WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3。在无抗生素添加的条件下，对三株基因工程菌进行摇瓶发酵培养，发酵培养60h时MAase酶活分别达到714U/mL，519U/mL和892U/mL。

Description

一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为芽孢杆菌属中的模式生物，是芽孢杆菌属中最早被用作基因工程表达宿主的菌种。枯草芽孢杆菌是一种食品安全菌种，被美国食品和药物管理局列为原则上认为安全的微生物(GRAS)。枯草芽孢杆菌作为外源蛋白表达宿主具有一些优良的性质：非致病性，蛋白分泌能力较强，遗传背景清晰，密码子没有明显偏好性，发酵培养简单，被广泛的用于外源蛋白的表达。
筛选标记是对微生物菌株进行遗传改造所必需的重要工具，枯草芽孢杆菌遗传改造中常用的筛选标记主要为抗生素抗性筛选。目前大量研究结果显示，人们使用抗生素造成的危害日益明显。环境中残留的抗生素不仅污染环境，更会危害人类的健康。此外，与抗生素抗性筛选相比，利用功能互补的营养缺陷型筛选标记具有生物安全性高，假阳性率低的优势，在食品及饲料工业对于重组蛋白的生产具有更广泛的应用。因此，开发无抗性筛选标记并将其用于构建食品安全菌种对于实现食品领域蛋白的生产具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种食品安全的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal，减少了菌株WS9生长代谢过程中D-丙氨酸的产生，使其仅在外源D-丙氨酸存在的条件下才能正常生长。
在一种实施方式中，所述丙氨酸消旋酶基因dal的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌WS9菌株是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS的srfC，spoIIAC，amyE，nprB，nprE，aprE，bpr，mpr和epr这9个基因，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生；所述枯草芽孢杆菌WS9公开于论文《枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究》中。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌WS9DAL的构建方法为：
(1)设计用于敲除基因dal的sgRNA双链寡核苷酸序列，根据靶序列sgRNA软件设计出一系列的sgRNA，选取其中一个脱靶率低的，并且在阅读框前面的作为sgRNA，以质粒PHY300dsrf为模板，PCR扩增获得替换sgRNA后的质粒PHY300d；
(2)以枯草芽孢杆菌WS9基因组为模板，PCR扩增丙氨酸消旋酶基因dal的同源修复臂上游片段、同源修复臂下游片段，并通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来，得到完整的同源修复臂；所述同源修复臂是根据靶序列设计的，缺失了靶基因序列中的938个碱基，造成阅读框的缺失突变；
(3)将步骤(2)构建的同源修复臂片段通过重组酶连接到步骤(1)构建的载体PHY300d上，再转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子，并验证转化子，得到敲除质粒PHY300ddal；
(4)将步骤(3)构建的敲除质粒PHY300ddal利用化学转转化法转化至枯草芽孢杆菌WS9，通过菌落PCR筛选转化子，验证正确的转化子为带有敲除质粒PHY300ddal的dal敲除菌株；
(5)将步骤(4)构建的带有敲除质粒PHY300ddal的dal敲除菌株进行热处理，消除敲除质粒PHY300ddal，获得D-丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌WS9DAL。
在一种实施方式中，所述质粒PHY300dsrf公开于论文《枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究》。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌还表达了麦芽糖淀粉酶。
在一种实施方式中，编码所述麦芽糖淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述麦芽糖淀粉酶通过启动子amyE’起始转录。
在一种实施方式中，所述启动子amyE’的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌WS9DAL在表达用于食品生产的蛋白方面的应用。
在一种实施方式中，所述用于食品生产的蛋白包括但不限于淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、多酚氧化酶、脂肪酶、脂氧合酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶。
在一种实施方式中，所述应用是用于构建生产麦芽糖淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌。
在一种实施方式中，所述应用是将dal基因表达盒克隆到携带麦芽糖淀粉酶基因的质粒上，具体为麦芽糖淀粉酶表达盒下游位置，获得重组质粒pUB110-HpaII+amyE，再转化至枯草芽孢杆菌WS9DAL；所述麦芽糖淀粉酶基因来源于Bacillus stearothermophilus；所述携带麦芽糖淀粉酶基因的质粒是pUB110-maase。
在一种实施方式中，所述应用是将携带麦芽糖淀粉酶基因的质粒上麦芽糖淀粉酶表达盒上游启动子HpaII删掉，获得重组质粒pUB110-amyE，再转化至枯草芽孢杆菌WS9DAL；所述麦芽糖淀粉酶基因来源于B.stearothermophilus；所述携带麦芽糖淀粉酶基因的质粒是pUB110-HpaII+amyE。
在一种实施方式中，所述应用还对携带麦芽糖淀粉酶基因的质粒元件进行改造，具体是将麦芽糖淀粉酶表达盒插入载体pUB110的protein1基因位点，再将dal基因序列替换Kan抗生素抗性基因，获得重组质粒pUB110-HpaII+amyE’，然后转化至枯草芽孢杆菌WS9DAL；所述麦芽糖淀粉酶基因来源于B.stearothermophilus；所述携带麦芽糖淀粉酶基因的质粒是pUB110-amyE。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在食品工业或饲料工业中的应用。
有益效果：本发明利用D-丙氨酸营养缺陷型筛选标记构建的重组枯草芽孢杆菌菌株WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3不含有抗性基因筛选标记，将其用于麦芽糖淀粉酶的发酵生产，实现了麦芽糖淀粉酶的食品级的高效表达，可使发酵60h的重组枯草芽孢杆菌菌株WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3 MAase酶活分别达到714U/mL，519U/mL和892U/mL。对于麦芽糖淀粉酶应用于淀粉糖化，食品烘焙以及面粉改性等领域具有重要价值。
附图说明
图1：敲除质粒PHY300ddal质粒图谱；
图2：dal基因敲除菌落PCR验证；
图3：表达质粒pUB110-HpaII+amyE质粒图谱；
图4：表达质粒pUB110-amyE质粒图谱；
图5：表达质粒pUB110-HpaII+amyE’质粒图谱；
图6：重组菌株MAase酶活比较。
具体实施方式
培养基配方：
(1)10×最低盐溶液：K2HPO4 14g(K2HPO4·3H2O 18.34g)，KH2PO4 6g，(NH4)2SO42g，柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)1g，MgSO4·7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水定容至100mL。
(2)L-trp溶液，10mg/mL，贮于棕色瓶内于115℃，30min条件下灭菌，灭菌后避光保存。
(3)GMⅠ溶液：1×最低盐溶液500μL，20％葡萄糖125μL，5％水解酪蛋白20μL，10％酵母汁50μL，10mg/mL L-trp 25μL，ddH2O 4.28mL。
(4)GMⅡ溶液：1×最低盐溶液2mL，20％葡萄糖500μL，5％水解酪蛋白16μL，10％酵母汁8μL，1M MgCl2 50μL，1M CaCl2 10μL，10mg/mL L-trp 20μL ddH2O 17.4mL。
枯草芽孢杆菌转化方法
用接种环沾取甘油管中保存的枯草芽孢杆菌WS9或实施例1构建的WS9DAL的菌液，在LB平板上划线并于37℃，200rpm条件下过夜培养，活化菌株。挑取LB平板上单菌落接种于5mL的GMⅠ培养基中于37℃，200rpm条件下过夜培养。次日，以5％接种量将GMⅠ发酵液转接至5mL的GMⅠ培养基中于37℃，200rpm条件下培养4-5h，使其生长至对数期。取2mL GMⅠ发酵液转接至20mL GMⅠI培养基中37℃，200rpm条件下培养1.5h。将发酵液冰浴10min后于4000rpm，7min离心，弃上清剩2mL，轻吹混匀后500μL/支分装至EP管中置于-80℃冰箱保存备用。
将500μL感受态细胞置于冰上融化后，将1μg质粒(10-20μL)加入至感受态中混匀，置于冰上孵育20min；再转至37℃水浴20min；将体系置于摇床于37℃，200rpm条件下培养1.5h；5000rpm，4min离心弃部分上清，使体系缩小至100μL并重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃培养过夜。
麦芽糖淀粉酶的酶活测定：采用3,5-二硝基水杨酸法(3,5-Dinitrosalicylicacid，DNS)。淀粉的水解产物(还原糖)在加热条件下能与3,5-二硝基水杨酸生成棕红色氨基络合物，利用其颜色的深浅即可表征水解活力的大小。用1.0％(m/v)可溶性淀粉溶液作为底物(用水溶解)。缓冲液为pH 5.5，50mM的磷酸缓冲液。反应具体步骤为：可溶性淀粉溶液1mL与缓冲液900μL混匀后置于60℃水浴锅中预热10min；加入适当稀释后的酶液样品100μL，震荡混匀，反应10min；加入3mL DNS终止反应，反应体系置于沸水中7min显色；置于冰上冷却，加入10mL蒸馏水，振荡混匀后在紫外分光光度计540nm下测量吸光值。酶活单位的定义：1U被定义为每分钟催化产生1μmol葡萄糖所需的酶量。
实施例1：构建D-丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌菌株
(1)以PHY300dsrf作为敲除质粒(公开于论文《枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究》中)，根据dal的基因序列设计用于特异性靶向dal基因的sgRNA，用表2所述引物P1和P2以敲除质粒PHY300dsrf为模板进行PCR扩增获得敲除质粒PHY300d。
(2)以步骤(1)构建的敲除质粒PHY300d为模板，用表2所示引物P3和P4进行PCR扩增，对质粒PHY300d进行sgRNA序列进行替换，获得载体骨架片段Frag1。
(3)以枯草芽孢杆菌WS9基因组为模板，用表2所述引物P5和P6进行PCR扩增获得同源修复臂上游片段Frag2。以枯草芽孢杆菌WS9基因组为模板用表2所述引物P7和P8进行PCR扩增获得同源修复臂下游片段Frag3。通过重叠PCR将上游片段Frag2和下游片段Frag3连接起来，获得Frag4。
上述反应体系如表1。
表1反应体系
2×Phanta Max Master Mix 25μL
模板DNA 1μL
上游引物(20μM) 1μL
下游引物(20μM) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 将体系补足至50μL
反应程序如下：95℃预变性3min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃延伸相应时间，进行34个循环；72℃延伸10min，降温至4℃。
表2引物序列
Figure BDA0003340478950000051
(4)采用
Figure BDA0003340478950000052
II One Step Cloning Kit连接2个片段Frag1和Frag4。
Figure BDA0003340478950000053
II One Step Cloning Kit连接体系如表3：
表3连接体系
连接成分 连接用量
线性化载体 3μL
插入片段 1μL
5×CE II Buffer 4μL
Exnase II 2μL
ddH<sub>2</sub>O 将体系补足20μL
线性化载体片段Frag1和插入片段Frag4的摩尔比为1：2，用水补足20μL体系，37℃连接30min，降至4℃或立即置于冰上冷却，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序验证。验证正确的质粒即为PHY300ddal。
(5)验证正确的质粒PHY300ddal通过化学转化法转化枯草芽孢杆菌WS9感受态细胞，涂布至LB固体培养基(含100μg/mL四环素，200μg/mL丙氨酸)，37℃过夜培养。挑取克隆子进行菌落PCR验证，阳性克隆子提取质粒，进行菌落PCR验证(验证引物：P9和P10)及测序验证，验证正确的转化子即为D-丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌菌株WS9DAL，置于甘油管中于-80℃保藏。
实施例2：构建表达麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶的菌株
(1)以pUB110-maase(公开于论文《嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及发酵优化》中)为模板，用表4所示引物P11和P12进行PCR扩增获得质粒的载体片段Frag5，用表4所述引物P13和P14进行PCR扩增获得dal基因片段Frag6，反应体系参照实施例1，再通过POE-PCR扩增得到重组质粒聚合物，反应体系如表5。
表4引物序列
Figure BDA0003340478950000061
Figure BDA0003340478950000071
表5 POE-PCR反应体系
Figure BDA0003340478950000072
线性化载体片段Frag5以及和插入片段Frag6的摩尔比为1：1，反应程序如下：95℃预变性3min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃延伸相应时间，进行30个循环；72℃延伸10min，降温至4℃。
将POE-PCR反应产物转化枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含100μg/mL Kan)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序验证。验证正确的质粒命名为pUB110-HpaII+amyE。
(2)验证正确的质粒pUB110-HpaII+amyE通过实施例2的方法转化枯草芽孢杆菌WS9DAL感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含100μg/mL Kan)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行质粒酶切验证，验证正确的转化子即为麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶表达菌株WS9DAL1。
实施例3：构建表达麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶的菌株
按照步骤(1)、(2)相同的策略构建麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶表达菌株，区别在于，还删除质粒pUB110-HpaII+amyE中的启动子HpaII，具体步骤为：以质粒pUB110-HpaII+amyE为模板，用表4所述引物P15和P16进行PCR，扩增获得质粒pUB110-amyE，并转化至枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞，验证正确的质粒转化枯草芽孢杆菌WS9DAL感受态细胞获得麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶表达菌株WS9DAL2。
实施例4：建表达麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶的菌株
按照步骤(1)、(2)相同的策略，构建麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶表达菌株，区别在于，用启动子amyE’促进麦芽糖淀粉酶基因的表达。具体步骤为：以实施例3构建的质粒pUB110-amyE为模板，用表4所述引物P17和P18以及P19和P20进行PCR扩增分别获得质粒的载体片段Frag7和MAase基因片段Frag8。以本实验室保藏的质粒pHY300PLK-Δ109-H207L(公开于论文《Clostridium cellulolyticum H10 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的分子改造、表达优化及稳定性研究》中)为模板，用表4所述引物P21和P22进行PCR扩增获得amyE’基因片段Frag9。利用POE-PCR依次将，Frag8和Frag9与Frag7连接，转化枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞，获得验证正确的质粒，命名为pUB110-amyE’。
以验证正确的质粒pUB110-amyE’为模板，用表4所述引物P23和P24进行PCR扩增获得质粒的载体片段Frag10，以枯草芽孢杆菌WS9基因组为模板用表4所述引物P25和P26进行PCR扩增获得dal基因片段Frag11。利用POE-PCR连接Frag10和Frag11，将dal基因替换Kan基因，然后转化枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞，验证正确的质粒pUB110-HpaII+amyE’转化枯草芽孢杆菌WS9DAL感受态细胞获得麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶表达菌株WS9DAL3。
实施例5：表达麦芽糖淀粉酶及丙氨酸消旋酶的菌株用于发酵生产麦芽糖淀粉酶
培养基配方：
LB：种子培养基:5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨1％，10g/L氯化钠；
TB：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO4 2.31g/L。
将实施例2～4构建的重组枯草芽孢杆菌菌株WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3分别进行发酵培养，以2‰的接种量从甘油管中吸取菌液接种于10mL LB培养基中，37℃，200rpm，培养8-10h；以5％的接种量将种子液接入50mL TB发酵液体培养基中，37℃，200rpm，培养2h后转至中，33℃，200rpm条件下培养60h。结果显示：发酵培养60h时，重组枯草芽孢杆菌菌株WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3 MAase酶活分别达到714U/mL，519U/mL和892U/mL。上述结果表明麦芽糖淀粉酶在本发明的D-丙氨酸营养缺陷型菌株WS9DAL中获得了功能性表达，用启动子amyE’可进一步促进MAase酶活的提高。
在淀粉行业，麦芽糖淀粉酶可以单独或者与其他的支链淀粉脱支酶一起用于生产高麦芽糖浆；麦芽糖淀粉酶用于食品烘焙工业中时，可以适量在面团中加入，能够明显提高面包的抗老化能力；另外，在面粉中添加麦芽糖淀粉酶，可以改变面粉制品如馒头等的组织结构，增大体积降低硬度，在面粉改性及加工中都具有非常良好的作用。枯草芽孢杆菌具有食品级地位和成熟的遗传操作系统，本发明将该原本含有抗性基因的枯草芽孢杆菌表达系统开发成一种麦芽糖淀粉酶的食品级表达系统，在消除抗生素抗性的同时，提高了酶活表达量，使构建的食品级表达系统可以被人体服用，或作为食品用酶的表达生产平台。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
<130> BAA211186A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagcacaa aaccttttta cagagatacg tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag 60
gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg 120
aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt 180
gcttcatgct tggccgtggc cattttggat gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg 240
aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag 300
tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg 360
aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta 420
aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag 480
tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta 540
atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc 600
cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga 660
ttcggcatcg gcatgtatgg ccttcgcccg tctgctgaca tgtcggacga gataccgttt 720
cagctgcgtc cggcatttac cctgcattcg acactgtcac atgtcaaact gatcagaaaa 780
ggcgagagcg tcagctacgg agccgagtac acagcggaaa aagacacatg gatcgggacg 840
gtgcctgtag gctatgcgga cggctggctc cgaaaattga aagggaccga catccttgtg 900
aagggaaaac gcctgaaaat tgccggccga atttgcatgg accaatttat ggtggagctg 960
gatcaggaat atccgccggg cacaaaagtc acattaatag gccggcaggg ggatgaatat 1020
atttccatgg atgagattgc aggaaggctc gaaaccatta actatgaggt ggcctgtaca 1080
ataagttccc gtgttccccg tatgtttttg gaaaatggga gtataatgga agtaagaaat 1140
cctttattgc aggtaaatat aagcaattaa 1170
<210> 2
<211> 2061
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcttcttctg caagcgttaa aggcgacgtt atctaccaga tcatcattga tcgcttttac 60
gacggtgaca ctaccaacaa caacccggct aagtcctacg gtctgtatga cccgaccaag 120
tccaaatgga aaatgtattg gggtggcgat ctggaaggtg ttcgtcagaa actgccgtat 180
ctgaaacagc tgggtgtgac caccatctgg ctgtccccgg ttctggacaa cctggacacc 240
ctggctggta ctgataacac tggttatcac ggttattgga cccgtgattt caaacagatc 300
gaagagcact tcggtaactg gactactttt gataccctgg ttaacgacgc tcatcagaac 360
ggtattaaag ttatcgtgga ctttgttccg aaccattcta ccccgttcaa agcaaacgac 420
tctactttcg cggagggtgg tgcgctgtat aacaacggta cctacatggg taactatttc 480
gatgacgcta ccaaaggcta cttccaccac aacggcgata tttctaactg ggacgaccgc 540
tacgaagcac agtggaaaaa ctttaccgac ccggcaggtt tctctctggc ggatctgtct 600
caggagaacg gcaccatcgc gcagtacctg actgatgcgg cggttcagct ggtggctcac 660
ggcgctgatg gcctgcgtat cgacgcagtt aaacatttca acagcggctt ctctaaaagc 720
ctggcagata agctgtatca gaaaaaagac atcttcctgg ttggcgaatg gtatggcgat 780
gatccgggca ccgcgaacca cctggagaaa gttcgttatg cgaacaactc cggtgtgaac 840
gtgctggatt tcgacctgaa cactgtgatc cgtaacgtgt ttggcacttt tactcagact 900
atgtacgatc tgaacaacat ggtgaaccag actggtaacg aatacaaata caaggaaaac 960
ctgattactt ttattgacaa ccacgacatg agccgcttcc tgtccgttaa ctctaacaaa 1020
gcgaacctgc accaggcgct ggcattcatt ctgacctctc gtggcactcc gtctatttac 1080
tatggcactg agcagtacat ggcgggtggc aacgacccgt acaaccgtgg tatgatgccg 1140
gcgttcgaca ccaccactac tgcattcaag gaagtgtcta ctctggcagg tctgcgccgt 1200
aacaacgcag caattcagta cggcactact actcagcgtt ggatcaacaa cgacgtttac 1260
atctacgaac gcaaattctt caacgatgtg gtgctggttg caatcaaccg caacactcag 1320
tcttcttact ccatctccgg cctgcagact gcactgccga acggctccta tgcggattac 1380
ctgtctggtc tgctgggcgg caacggcatt tctgtgtcta acggcagcgt ggcgtctttc 1440
actctggcac cgggtgcggt gtccgtgtgg cagtactcta cctctgcgtc cgcaccgcag 1500
attggttccg ttgcaccgaa catgggcatt ccgggtaacg ttgtgactat tgatggcaaa 1560
ggtttcggta ccacccaggg cactgttacc ttcggtggcg tgactgctac tgttaaatcc 1620
tggacctcta accgtattga agtttacgtg ccgaacatgg ctgcgggcct gaccgatgtt 1680
aaggtgaccg caggcggtgt ttctagcaac ctgtactctt ataacattct gtccggcacc 1740
cagacttctg tggttttcac cgtgaaatct gcaccgccga ctaacctggg cgacaagatc 1800
tatctgaccg gtaacatccc ggagctgggc aactggtcca ccgatacttc tggcgcggtt 1860
aacaacgctc agggtccgct gctggctccg aactatccgg actggttcta cgttttcagc 1920
gtgccggctg gcaaaaccat ccagtttaag ttctttatca aacgtgcgga tggtactatt 1980
cagtgggaaa acggttccaa ccatgtggcg accactccga ccggtgcgac cggcaacatt 2040
actgtgactt ggcagaacta a 2061
<210> 3
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcggcgttc tgtttctgct tcggtatgtg attgtgaagc tggcttacag aagagcggta 60
aaagaagaaa taaaaaagaa atcatctttt ttgtttggaa agcgagggaa gcgttcacag 120
tttcgggcag ctttttttat aggaacattg atttgtattc actctgccaa gttgttttga 180
tagagtgatt gtgataattt taatgtaagc gataacaaaa ttctccagtc ttcacatcgg 240
tttgaaagga ggaagcggaa gaatgaagta agagggattt ttgactccga agtaagtctt 300
caaaaaatca aataaggagt gtcaaga 327

Claims (10)

1.一种食品安全的枯草芽孢杆菌，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal；所述枯草芽孢杆菌WS9菌株是在枯草芽孢杆菌WS的基础上利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了srfC，spoIIAC，amyE，nprB，nprE，aprE，bpr，mpr和epr基因。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，还表达了麦芽糖淀粉酶；所述麦芽糖淀粉酶通过启动子amyE’起始转录。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pUB110为表达载体，表达量来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶基因和来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在表达用于食品生产的蛋白方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于食品生产的蛋白包括但不限于淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、多酚氧化酶、脂肪酶、脂氧合酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶或过氧化氢酶。
6.构建权利要求1所述枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：
(1)设计用于敲除基因dal的sgRNA双链寡核苷酸序列，以质粒PHY300dsrf为模板，PCR扩增获得替换sgRNA后的质粒PHY300d；
(2)以枯草芽孢杆菌WS9基因组为模板，PCR扩增丙氨酸消旋酶基因dal的同源修复臂上游片段、同源修复臂下游片段，并通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来，得到完整的同源修复臂；
(3)将步骤(2)构建的同源修复臂片段通过重组酶连接到步骤(1)构建的载体PHY300d上，再转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子，并验证转化子，得到敲除质粒PHY300ddal；
(4)将步骤(3)构建的敲除质粒PHY300ddal利用化学转转化法转化至枯草芽孢杆菌WS9，筛选带有敲除质粒PHY300ddal的dal敲除菌株；
(5)将步骤(4)构建的带有敲除质粒PHY300ddal的dal敲除菌株进行热处理，消除敲除质粒PHY300ddal，获得D-丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌WS9DAL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶基因和来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因克隆到pUB110载体的启动子HpaII下游，再转化至所述枯草芽孢杆菌WS9DAL中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶基因插入至载体pUB110的protein1基因位点。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还在麦芽糖淀粉酶基因上游引入启动子amyE’。
10.权利要求2或3所述的枯草芽孢杆菌在生产麦芽糖淀粉酶或水解淀粉方面的应用。
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