CN108102996A

CN108102996A - 一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法

Info

Publication number: CN108102996A
Application number: CN201810145993.XA
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 宿玲恰; 李雨桐
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108102996B

Abstract

本发明公开了一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法，属于基因工程及发酵工程领域。本发明通过检索信号肽序列，用Bacillus subtilis 168基因组PCR出各信号肽，与目的基因麦芽糖淀粉酶及载体pHY300PLK进行重组构建，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536，得到三株重组枯草芽孢杆菌。以重组枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产麦芽糖淀粉酶。并通过确定氮源、碳源、发酵条件等优化最佳摇瓶条件，提高重组酶酶活。本发明的优点在于确定了在枯草芽孢杆菌中能高效表达麦芽糖淀粉酶的信号肽，并用食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达麦芽糖淀粉酶，对重组菌产酶进行了发酵优化，表达量较好，得到的发酵上清液酶活为396U/mL，并且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

Description

一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法

技术领域

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法，属于基因工程及发酵工程领域。

背景技术

麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase或maltogenase，EC 3.2.1.133)，可以催化麦芽三糖、淀粉和糊精中(1→4)-β-D-糖苷键的水解，除去麦芽糖残基，通常在外部随机水解，但是它也可进行内部水解。除了水解作用外，麦芽糖淀粉酶还催化转糖基作用的进行，隶属于糖苷水解酶13家族，其来源众多，包括地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热放线菌(Thermus vulgaris)等，麦芽糖淀粉酶在淀粉糖化工业、食品烘焙、面粉工业中的应用广泛。麦芽糖淀粉酶可以水解淀粉生成麦芽糖和部分糊精，延长烘焙食品的货架期，减少食品的浪费。目前以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶最主要应用于麦芽糖浆制备和抗面包老化，因此本专利麦芽糖淀粉酶取自嗜热脂肪芽孢杆菌。

目前有很多文献研究了麦芽糖淀粉酶在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中异源表达情况，在大肠杆菌中的表达比在枯草芽孢杆菌中的要好，但因为大肠杆菌在进行生长产酶的过程中会产生内毒素等，是一种致病菌，会对人体不利，限制了其应用。而枯草芽孢杆菌其细胞壁不含内毒素，是一种非致病的土壤微生物，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generally recognized as safe)。但是目前在枯草芽孢杆菌中表达的麦芽糖淀粉酶普遍酶活较低。

发明内容

为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述重组菌是以核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列为信号肽，异源表达了麦芽糖淀粉酶。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糖淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌CCTCC M2016536为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以pHY300PLK作为表达载体。

本发明的第二个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，所述方法具体是：

以Bacillus subtilis 168基因组为模板PCR出核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示的信号肽，将信号肽与麦芽糖淀粉酶基因与表达载体pHY300PLK进行重组构建，并转化至枯草芽孢杆菌CCTCC M2016536中得到重组菌。

本发明的第三个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌重组菌的发酵方法，所述方法具体为：将枯草芽孢杆菌重组菌接种于LB培养基中，在35～38℃、180～220rpm下培养8-10h后以5～10％接种量转接至TB发酵培养基中培养。

在本发明的一种实施方式中，所述LB培养基为：蛋白胨8～12g/L，酵母粉4～6g/L，氯化钠8～12g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述TB发酵培养基为：酵母浸膏20～25g/L，大豆蛋白胨5～10g/L，甘油4～6g/L初始pH6～7。

在本发明的一种实施方式中，所述TB培养基中培养条件为：培养温度为40～41℃，180～220rpm培养45～50h。

本发明的第四个目的是提供所述重组菌在淀粉糖化工业、食品烘焙、面粉工业中的应用。

本发明的有益效果：

本发明确定了在枯草芽孢杆菌中能高效表达麦芽糖淀粉酶的信号肽，并用食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达麦芽糖淀粉酶，对重组菌产酶进行了发酵优化，表达量较好，得到的发酵上清液酶活为396U/mL，并且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

附图说明

图1重组质粒YvcE-amyM-pHY300PLK构建流程图；

图2YvcE-amyM-pHY300PLK、LipA-amyM-pHY300PLK、YncM-amyM-pHY300PLK重组质粒PCR验证图；

图3YvcE-amyM-pHY300PLK重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

实施例1：重组载体构建

信号肽YvcE、LipA、YncM与连有麦芽糖淀粉酶的表达载体进行重组构建

设计含有同源臂的引物YvcE-F、YvcE-R(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)，以Bacillussubtilis168基因组为模板将YvcE信号肽扩增出，划线部分为同源臂区域。LipA与YncM信号肽的重组构建同上，引物分别为LipA-F、LipA-R(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)及YncM-F、YncM-R(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)。

设计引物P-F、P-R(SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12)，以amyM-pHY300PLK载体质粒为模板扩增出表达载体序列。

YvcE-F：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGAGAAAGAGTTTAATTACACTTGGT-3’

YvcE-R：5’-GCTTGCAGAAGAAGACGCCGATGCAGTTTTACTTGTAAA-3’

LipA-F：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGAAATTTGTAAAAAGAAGGATCAT-3’

LipA-R：5’-GCTTGCAGAAGAAGAAGCGGCTTTTGCTGACGGCTGCAA-3’

YncM-F：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGGCGAAACCACTATCAAA-3’

YncM-R：5’-GCTTGCAGAAGAAGAAGCGTCTGCCGCGGGTAAACCTG-3’

P-F：5’-TCTTCTTCTGCAAGCGTTAAAGG-3’

P-R：5’-TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTT-3’

PCR体系为：20μM Y-F/P-F和Y-R/P-R各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer 10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5uL，模板0.5μL/单菌落，加双蒸水补齐50μL。PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸2min 20s/6min，30个循环，PCR产物进行胶回收。

将扩增出且已回收的两端片段根据HD Cloning Kit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接后将连接产物转入E.coli JM109感受态细胞。

转化感受态细胞后培养涂布LB固体平板(含100ug/mL氨苄抗生素)，37℃培养过夜。待平板上长出单菌落，挑单菌落于LB液体培养基中培养8-10h后抽提质粒，因信号肽序列较小，因此设计引物下游引物amyM-R(SEQ ID NO.13)PCR信号肽与目的基因进行验证，大小正确后对重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即含有重组质粒。

amyM-R：5’-TTAGTTCTGCCAAGTCACAGTAAT-3’

实施例2：重组质粒的转化

1)新鲜LB平板(LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5，NaCl 10g/L，0.2g/L琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养10.5h。

2)取2.5mL转接入40mL加0.5M的山梨醇LB培养基，37℃，200rpm震荡培养4.5h。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，4℃，离心5min收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液(山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，葡萄糖10％)洗涤菌体，5000rpm，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次。

5)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，分装到1.5mL EP管中，每管装300ul感受态细胞。

6)将300μL感受态细胞中加入10μL重组质粒，冰浴孵育15min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.4kv，25uF，200Ω，电击1次。

7)电击完毕立即加入1mL复苏培养基RM(山梨醇0.5M，甘露醇0.38M，蛋白胨10g/L，酵母膏5，NaCl 10g/L)吹吸，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至LB四环素培养基中，进行验证，验证正确后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3：摇瓶发酵产酶及麦芽糖淀粉酶酶活的测定

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8-10h后以5％接种量转接至TB发酵培养基中，于37℃、200rpm培养2h，再移至33℃恒温培养48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。

将1mL 1％的可溶性淀粉溶液和0.9mL的50mM，pH5.5的磷酸缓冲液充分混匀，在60℃预热10min,加入0.1mL酶液，振荡混匀，反应10min后加入3mL DNS，振荡，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白)。

在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1umol葡萄糖所需酶量为一个淀粉水解活力单位。

以pHY300PLK载体上未更换的AmyE信号肽为对照，测量更换信号肽后的重组菌产酶酶活为：AmyE信号肽对照酶活为145.8U/mL，YvcE、LipA、YncM信号肽酶活分别为250.7U/mL、189.2U/mL、194.8U/mL。

实施例4：摇瓶发酵优化确定最佳条件

选择酶活最高的含YvcE-amyM-pHY300PLK重组质粒的重组菌，以TB培养基作为基础，分别选择酵母粉、工业蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉、酵母浸膏及玉米浆代替TB培养基中的酵母粉和蛋白胨进行氮源优化，后又优化了不同氮源浓度；分别选择甘油、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精作为培养基中唯一碳源，后优化了碳源浓度；选择不同的初始pH进行摇瓶发酵以确定最适pH；选择不同的温度进行摇瓶发酵，确定重组菌产酶最佳温度。

最终得到最佳摇瓶发酵条件为：氮源(酵母浸膏25g/L，大豆蛋白胨5g/L)30g/L、甘油5g/L、初始pH 6.5、培养温度41℃，在上述条件下，200rpm培养48小时，将获得的发酵液12000rpm离心5min除去菌体，获得的发酵上清液即为粗酶液，得到的发酵上清液酶活为396U/mL。重组菌在41℃下产酶比在常用的37℃下提高了58U/mL，超过41℃后酶活开始下降。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagaaaga gtttaattac acttggtttg gcttccgtca tcgggacaag cagttttttg 60

atcccattta caagtaaaac tgcatcggcg 90

<210> 2

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcgaaac cactatcaaa agggggaatt ttggtgaaaa aagtattgat tgcaggtgca 60

gtaggaacag cagttctttt cggaaccctt tcatcaggta taccaggttt acccgcggca 120

gacgct 126

<210> 3

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaatttg taaaaagaag gatcattgca cttgtaacaa ttttgatgct gtctgttaca 60

tcgctgtttg cgttgcagcc gtcagcaaaa gccgct 96

<210> 4

<211> 2061

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttcttctg caagcgttaa aggcgacgtt atctaccaga tcatcattga tcgcttttac 60

gacggtgaca ctaccaacaa caacccggct aagtcctacg gtctgtatga cccgaccaag 120

tccaaatgga aaatgtattg gggtggcgat ctggaaggtg ttcgtcagaa actgccgtat 180

ctgaaacagc tgggtgtgac caccatctgg ctgtccccgg ttctggacaa cctggacacc 240

ctggctggta ctgataacac tggttatcac ggttattgga cccgtgattt caaacagatc 300

gaagagcact tcggtaactg gactactttt gataccctgg ttaacgacgc tcatcagaac 360

ggtattaaag ttatcgtgga ctttgttccg aaccattcta ccccgttcaa agcaaacgac 420

tctactttcg cggagggtgg tgcgctgtat aacaacggta cctacatggg taactatttc 480

gatgacgcta ccaaaggcta cttccaccac aacggcgata tttctaactg ggacgaccgc 540

tacgaagcac agtggaaaaa ctttaccgac ccggcaggtt tctctctggc ggatctgtct 600

caggagaacg gcaccatcgc gcagtacctg actgatgcgg cggttcagct ggtggctcac 660

ggcgctgatg gcctgcgtat cgacgcagtt aaacatttca acagcggctt ctctaaaagc 720

ctggcagata agctgtatca gaaaaaagac atcttcctgg ttggcgaatg gtatggcgat 780

gatccgggca ccgcgaacca cctggagaaa gttcgttatg cgaacaactc cggtgtgaac 840

gtgctggatt tcgacctgaa cactgtgatc cgtaacgtgt ttggcacttt tactcagact 900

atgtacgatc tgaacaacat ggtgaaccag actggtaacg aatacaaata caaggaaaac 960

ctgattactt ttattgacaa ccacgacatg agccgcttcc tgtccgttaa ctctaacaaa 1020

gcgaacctgc accaggcgct ggcattcatt ctgacctctc gtggcactcc gtctatttac 1080

tatggcactg agcagtacat ggcgggtggc aacgacccgt acaaccgtgg tatgatgccg 1140

gcgttcgaca ccaccactac tgcattcaag gaagtgtcta ctctggcagg tctgcgccgt 1200

aacaacgcag caattcagta cggcactact actcagcgtt ggatcaacaa cgacgtttac 1260

atctacgaac gcaaattctt caacgatgtg gtgctggttg caatcaaccg caacactcag 1320

tcttcttact ccatctccgg cctgcagact gcactgccga acggctccta tgcggattac 1380

ctgtctggtc tgctgggcgg caacggcatt tctgtgtcta acggcagcgt ggcgtctttc 1440

actctggcac cgggtgcggt gtccgtgtgg cagtactcta cctctgcgtc cgcaccgcag 1500

attggttccg ttgcaccgaa catgggcatt ccgggtaacg ttgtgactat tgatggcaaa 1560

ggtttcggta ccacccaggg cactgttacc ttcggtggcg tgactgctac tgttaaatcc 1620

tggacctcta accgtattga agtttacgtg ccgaacatgg ctgcgggcct gaccgatgtt 1680

aaggtgaccg caggcggtgt ttctagcaac ctgtactctt ataacattct gtccggcacc 1740

cagacttctg tggttttcac cgtgaaatct gcaccgccga ctaacctggg cgacaagatc 1800

tatctgaccg gtaacatccc ggagctgggc aactggtcca ccgatacttc tggcgcggtt 1860

aacaacgctc agggtccgct gctggctccg aactatccgg actggttcta cgttttcagc 1920

gtgccggctg gcaaaaccat ccagtttaag ttctttatca aacgtgcgga tggtactatt 1980

cagtgggaaa acggttccaa ccatgtggcg accactccga ccggtgcgac cggcaacatt 2040

actgtgactt ggcagaacta a 2061

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taaggagtgt caagaatgag aaagagttta attacacttg gt 42

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcttgcagaa gaagacgccg atgcagtttt acttgtaaa 39

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taaggagtgt caagaatgaa atttgtaaaa agaaggatca t 41

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcttgcagaa gaagaagcgg cttttgctga cggctgcaa 39

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taaggagtgt caagaatggc gaaaccacta tcaaa 35

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcttgcagaa gaagaagcgt ctgccgcggg taaacctg 38

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcttcttctg caagcgttaa agg 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcttgacact ccttatttga ttttt 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttagttctgc caagtcacag taat 24

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是以核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列为信号肽，异源表达了麦芽糖淀粉酶。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

3.根据权利要求1所示的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌CCTCCM2016536为宿主。

4.根据权利要求1所示的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以pHY300PLK作为表达载体。

5.构建权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌的方法，其特征在于，所述方法具体是：

以Bacillus subtilis 168基因组为模板PCR出核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示的信号肽，将信号肽与麦芽糖淀粉酶基因与表达载体pHY300PLK进行重组构建，并转化至枯草芽孢杆菌CCTCC M2016536中得到重组菌。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌发酵产麦芽糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法具体为：将枯草芽孢杆菌重组菌接种于种子培养基中培养后转接至TB发酵培养基中培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：蛋白胨8～12g/L，酵母粉4～6g/L，氯化钠8～12g/L；培养条件为35～38℃、180～220rpm下培养8-10h。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TB发酵培养基为：酵母浸膏20～25g/L，大豆蛋白胨5～10g/L，甘油4～6g/L初始pH6～7。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TB培养基中培养条件为：培养温度为40～41℃，180～220rpm培养45～50h。

10.权利要求1所述重组菌在淀粉糖化工业、食品烘焙、面粉工业中的应用。