CN111944785A

CN111944785A - 一种产麦芽糖淀粉酶的重组菌株及其在烘焙食品中的应用

Info

Publication number: CN111944785A
Application number: CN202010876688.5A
Authority: CN
Inventors: 张荣珍; 徐岩; 阮瑛琦
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: WO2022042005A1; CN111944785B

Abstract

本发明公开了一种产麦芽糖淀粉酶的重组菌株及其在烘焙食品中的应用，属于基因工程、酶工程及食品工程技术领域。本发明的重组麦芽糖淀粉酶BLMA在60℃，pH 6.5时，酶活高达3235U·mg^‑1，为目前报道的麦芽糖淀粉酶最高活力之一。将该重组酶应用于烘焙食品中，冷藏储存10天后，面包的硬度降低了2.12倍，有效地延缓了烘焙食品的老化，很好地提高了食品的货架期。本发明为烘焙行业提供了优质、安全、高效的代表性麦芽糖淀粉酶及产酶菌株。

Description

一种产麦芽糖淀粉酶的重组菌株及其在烘焙食品中的应用

技术领域

本发明涉及一种产麦芽糖淀粉酶的重组菌株及其在烘焙食品中的应用，属于基因工程、酶工程及食品工程技术领域。

背景技术

麦芽糖淀粉酶(Maltogenic amylase，EC 3.2.1.133)，是一类水解α-1,4-D-葡萄糖苷键的内切淀粉酶，属于糖苷水解酶GH13家族。麦芽糖淀粉酶可作用于淀粉及相关多聚糖，能优先水解环状糊精、直链淀粉，生成的主要产物为麦芽糖，副产物为葡萄糖。麦芽糖淀粉酶的来源较为广泛，包括地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、栖热菌属(Thermus sp.)、嗜热放线菌(Thermus vulgaris)等。不同来源的麦芽糖淀粉酶在酶学性质上具有较大的差异。

在烘焙食品的储存过程中，由于淀粉老化等主导因素，导致面包品质下降，如面包屑变硬，硬皮软化并失去烘焙产品特有的新鲜风味，同时导致其货架期缩短，造成大量的食品资源浪费，造成巨大的经济损失。麦芽糖淀粉酶可水解淀粉生成麦芽糖等产物，能使支链淀粉在糊化时侧链变短，而水解支链淀粉生成的麦芽糖、寡糖和小分子糊精能干扰淀粉的重结晶以及淀粉粒与蛋白质大分子的缠绕，延缓淀粉颗粒重结晶，从而延缓面包的老化，延长其货架期。目前麦芽糖淀粉酶正逐步应用于面包烘焙行业，然而优质并且安全的麦芽糖淀粉酶却鲜有报道。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有较强的蛋白质外泌能力、无明显的密码子偏爱性，已经被美国食品药物管理局和中国食品安全相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generally recognized as safe)，因此是应用于食品级麦芽糖淀粉酶的优选表达菌株。但截至目前，麦芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中进行表达时均存在表达量不高，重组酶活较低等问题。因此筛选出一种酶活高，酶学性质优良、在枯草芽孢杆菌中高表达的重组麦芽糖淀粉酶，用于烘焙食品行业具有极其重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明筛选了一株产麦芽糖淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis RZ108)，使用染色体步移技术从其基因组DNA中克隆出完整的麦芽糖淀粉酶基因，构建表达载体，使其在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达，获得了高效表达及高酶活的重组麦芽糖淀粉酶。该重组麦芽糖淀粉酶应用于面包烘焙中，能显著改善面团的流变性能，有效地延缓淀粉的回生，降低面包储存期间的硬度，显著改善面包品质，从而增加烘焙的货架期。

本发明的第一个目的是提供一种麦芽糖淀粉酶，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述麦芽糖淀粉酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pMA0911。

本发明的第四个的目的是提供表达所述麦芽糖淀粉酶的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌WB600。

在一种实施方式中，所述重组微生物为重组枯草芽孢杆菌，以pMA0911为载体，在枯草芽孢杆菌WB600中表达SEQ ID NO.1所示的麦芽糖淀粉酶。

本发明的第五个目的是提供构建所述重组菌的方法，包括如下步骤：

将核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的麦芽糖淀粉酶基因与载体pMA0911连接，将获得的重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌WB600中，获得重组菌。

在一种实施方式中，利用染色体步移技术获得完整的麦芽糖淀粉酶基因。

在一种实施方式中，利用溶菌酶及质粒提取试剂盒提取质粒验证重组菌的阳性克隆。

本发明的第六个目的是提供一种可溶性表达麦芽糖淀粉酶的方法，所述方法将所述重组菌接种到培养基中，在30～35℃培养24～48h。

在一种实施方式中，培养温度为33℃，培养时间为48h。

在一种实施方式中，所述培养基配方为胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，磷酸氢二钾12.5g/L。

本发明还提供含有所述麦芽糖淀粉酶的酶制剂。

在一种实施方式中，所述酶制剂为所述麦芽糖淀粉酶的冻干粉，含有所述麦芽糖淀粉酶及其保护剂。

本发明还提供所述重组菌，或所述麦芽糖淀粉酶，或所述酶制剂在烘焙食品领域的应用。

在一种实施方式中，所述的烘焙食品包括但不限于面包。

在一种实施方式中，所述的面团配方为：面粉500g，白砂糖35g，食用盐5g，酵母5g，水650g。

在一种实施方式中，所述的面包烘焙配方按质量计为：57.4％的小麦粉，0.6％的酵母，4.0％的糖，0.6％的盐和37.4％的水。

在一种实施方式中，所述方法用于提高面团流变特性或面包质构。

有益效果：本发明成功构建了能高效表达目的基因的重组菌株B.subtilisWB600/pMA0911-BLMA并将其应用于烘焙食品。重组菌表达的粗酶液经过硫酸铵梯度沉降、His-Trap HP层析柱纯化后得到重组纯酶BLMA。纯酶BLMA的最适温度为60℃，在30–80℃温度范围内，孵育30min后，仍保留超过60％以上的酶活性。其最适pH为6.5，在pH 5.5–7.5的范围内酶活较稳定，能保留超过60％以上的酶活性。在60℃和pH 6.5的条件下，纯酶BLMA的活性高达3235U mg^-1。重组菌所产麦芽糖淀粉酶BLMA具有酶活性高、温度稳定性良好以及pH适用范围较广的特点。将其应用于食品烘焙中，显著改善面团的流变性能，有效地延缓淀粉的回生，降低面包储存期间的硬度，显著改善面包品质，从而增加烘焙的货架期。

附图说明

图1为面包储存过程中硬度的变化；

图2为面包储存过程中弹性的变化。

具体实施方式

实施例1：麦芽糖淀粉酶基因BLMA的获得

(1)产麦芽糖淀粉酶菌株的分离

样品：源于中国江苏省无锡市富含淀粉土壤；

培养基(g·L^-1)：氯化钠5，硫酸镁0.1，磷酸二氢钾0.5，氯化钙0.2，酵母抽提物0.3，胰蛋白0.3，pH 6.0。将样品置于培养基中，于37℃、200r·min^-1振荡培养24h。将以梯度稀释的培养液置于含有按质量计0.2％可溶性淀粉，1％蛋白，0.5％氯化钠，0.3％牛肉提取物，2％琼脂，pH7.0的平板上，于37℃条件下培养24h。将包含0.3％碘和0.6％碘化钾的卢戈氏液添加到平板上，于20℃下选择具有明显透明环的平板。将选择的淀粉板于37℃、200r·min^-1培养96h。

(2)产麦芽糖淀粉酶菌株的鉴定

根据Bergey手册，使用细菌学测试对分离株进行鉴定，分析了菌株的形态生理和化学性质，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌(Bacillus.sp)。通过构建系统进化树，对比16SrRNA序列的相似性，判定该菌株为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，命名为B.licheniformis RZ108。

(3)地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶部分氨基酸序列分析

用SDS-PAGE分析地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)RZ108产生的蛋白质，然后切取麦芽糖淀粉酶产生的蛋白条带，用胰蛋白酶消化。通过质谱MALDI-TOF-MS对释放的短肽序列进行分析，获得麦芽糖淀粉酶的部分氨基酸序列。

(4)麦芽糖淀粉酶BLMA基因的克隆和序列分析

使用快速细菌基因组DNA分离试剂盒(Sangon Biotech.Co.上海，中国)提取基因组DNA，结合质谱MALDI-TOF-MS测定得到的部分氨基酸序列设计相应的简并引物，引物序列如下:

P1:AARWSNAARTGGAARATGT(SEQ ID NO.3)；

P2:NTTYACNGTNAARWSNGCNCC(SEQ ID NO.4)；

利用简并引物扩增目的基因的部分序列，具体方法如下：

PCR扩增条件：98℃变性10min；98℃，10s，55℃，30s，72℃，25s，进行30个循环；72℃延伸5min。以地衣芽孢杆菌(B.licheniformis RZ108)基因组为模板，以引物P1和P2进行PCR反应，扩增目的基因的部分序列(1.2kb)。

为获取麦芽糖淀粉酶的完整基因，采用两轮反向PCR扩增已知片段的侧翼序列。基于部分基因序列(1.2kb)设计引物P3、P4、P5和P6，引物序列如下：

P3:TTTGACGGCGTCGATGC；(SEQ ID NO.5)

P4:GCGAATGGTATGGCG；(SEQ ID NO.6)

P5:TTCCAGATGGTTGGCCGT；(SEQ ID NO.7)

P6:TGAGCGTCAACAGCAACA；(SEQ ID NO.8)

利用Nco I切割目的基因，通过T4 DNA连接酶将目的基因进行自连接，以引物P3和P4进行第一轮反向PCR反应扩增侧翼片段(0.96kb)。利用Sma I切割目的基因，通过T4 DNA连接酶将目的基因进行自连接，以引物P5和P6进行第二轮反向PCR反应扩增侧翼片段(1.1kb)。利用Snap Gene 2.3.2对基因片段进行分析，可能的起始密码子ATG位于0.9kb片段中，可能的终止密码子TAA位于1.1kb片段中，催化三联体Asp-Glu-Asp位于1.1kb片段中，组装三个片段获得完整的编码基因BLMA(1707bp)。

实施例2：重组质粒pMA0911-BLMA的获得

利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pMA0911。

按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃金属浴1h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。

反应体系组成：10×Buffer H 4μL，DNA 10μL，EcoR I 2μL，XhoI 2μL，ddH₂O将体系补足40μL。

目的基因与质粒T-BLMA与PMA0911的连接：

反应体系组成如下：质粒与基因按1:7的摩尔比共8μL，T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12–16h。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pMA0911-BLMA的构建

在每管的500μL B.subtilis WB600感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀于37℃，100rpm放置30min后，将离心管转移到37℃，250rpm的摇床中培养1.5h。培养完成后以4,000rpm离心收集菌体，弃上清后，留100ul重悬菌体，涂布于含有50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

阳性克隆的选择：每个平板分别挑取4个克隆，分别转接入装有5mL的含有相应抗生素的LB培养基中，37℃培养8h，利用溶菌酶及质粒提取试剂盒Mini-Plasmid RapidIsolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2μL，DNA 5μL，EcoR I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH₂O将体系补足20μL。同时经DNA测序验证，获得阳性质粒pMA0911-BLMA。

实施例4：麦芽糖淀粉酶的发酵生产

TB培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g L^-1，甘油5g L^-1，磷酸二氢钾2.3g L^-1，磷酸氢二钾12.5g L^-1，pH7.0。使用前需加入硫酸卡那霉素(50μg·mL^-1)。

挑取阳性克隆单菌落B.subtilis WB600/pMA0911-BLMA，置于20mL含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的TB液体培养基中，于33℃，诱导培养48h。

取培养后的重组枯草芽孢杆菌细胞8,000rpm，4℃离心10min除去菌体，收集发酵上清液。

在上清液中缓慢加入30％硫酸铵，4℃静止4h后，8,000rpm，4℃离心10min去除部分杂蛋白。在上清液中再缓慢加入部分硫酸铵粉末，使上清液中硫酸铵的终浓度为50％，4℃放置6h后，在4℃条件下12,000rpm离心30min收集沉淀。

用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重构沉淀，然后使用

蛋白纯化系统进一步纯化，将溶液上样至HisTrap HP柱(GE Healthcare，芝加哥，美国)。用含有20mM咪唑和500mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱，用超滤管(Millipore Amicon Ultra，Billerica，USA)浓缩收集的目标蛋白溶液(约2mL)，使用脱盐柱除去咪唑，通过SDS-PAGE分析判断蛋白质纯度。

实施例5：麦芽糖淀粉酶酶学性质测定

(1)酶活力的测定：

麦芽糖淀粉酶在一定温度和pH值条件下，水解淀粉的产物为还原糖，而还原糖能与3,5-二硝基水杨酸在加热条件下生成棕红色氨基络合物，还原糖越多，反应完毕后反应液的颜色越深，说明麦芽糖淀粉酶的水解活力越高。因此可以用3,5-二硝基水杨酸法(3,5-Dinitrosalicylicacid，DNS)测定麦芽糖淀粉酶的活性。

表1麦芽糖标准曲线绘制：按下表配制麦芽标准溶液

分别取上述溶液400uL，加入600uL的DNS溶液后，沸水浴7min显色反应。补加蒸馏水至总体系为3mL，吹吸混匀后取200uL至96浅孔板中，设置多功能酶标仪波长为540nm，测量吸光值。以吸光度A为纵坐标，麦芽糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线(曲线应通过零点)。

根据作图或回归方程，计算当吸光度为1时的麦芽糖的量(μg)，即为吸光度常数K。

酶活测定的标准条件：用磷酸缓冲液(50mM，pH 6.0)配制1.0％(m v^-1)可溶性淀粉溶液，在60℃水浴中预热10min。取0.2mol可溶性淀粉溶液加入适当稀释后的酶液样品0.2mL震荡混匀，在60℃下反应10min后，加入0.6mL的DNS终止反应，然后沸水浴7min。待反应液冷却后混匀，取200uL至96浅孔板中，在540nm下测量吸光值。蛋白质含量测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白BSA为标准品。

酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化产生相当于1mg麦芽糖所需的酶量定义为一个单位U。

酶活的计算公式为：酶活(U)＝n×A×K/10

比活的计算公式：比活(U·mg^-1)＝酶活(U)/蛋白量(mg)

其中，n——稀释倍数；

A——样品平行实验的平均吸光度；

K——吸光常数；

10——反应时间，10min。

(2)最适温度

为了确定温度对酶活性的影响，将酶在40至80℃的温度梯度下于磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中孵育。不同温度下计算得到的BLMA的比酶活如表2所示。BLMA的最适温度为60℃，在75℃时仍保留了总活性的75％以上。

表2重组BLMA在不同温度下的比酶活

注：测定BLMA的最适温度时所用缓冲液的pH为6.5。

(3)最适pH

在具有不同pH的缓冲液中测定了BLMA的最佳pH：50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0–6.0)，50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0–7.0)和50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0–9.0)，测定温度为60℃。

不同pH下测得的BLMA的比酶活如表3所示。BLMA的最适pH为6.5，在pH 5.0–8.0时，重组酶活力达到总活性的80％以上。

表3重组BLMA在不同pH下的比酶活

注：测定BLMA的最适pH时温度为60℃。

(4)温度稳定性

将麦芽糖淀粉酶BLMA在不同温度下(30–90℃)保温30min后检测剩余酶活，以未处理的酶活力定义为100％。在不同温度下温育后的剩余酶活数据如表4所示。重组BLMA可耐受30至80℃的温度，在保温30分钟后仍保留超过60％以上的酶活力，表明BLMA可在60至80℃之间起作用。在面包烘焙行业中，大多数小麦淀粉在60℃或更高温度下开始胶凝，因此BLMA的最佳温度和高热稳定性的特性，为其在面包烘焙行业中的应用提供了潜在的优势。

表4重组BLMA在不同温度下保温30min后的剩余酶活

注：测定BLMA的温度稳定性时，所用缓冲液pH为6.5。

(5)pH稳定性

将重组麦芽糖淀粉酶BLMA在不同pH的缓冲液中(50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.0–6.0，50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0–7.0和50mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0–9.0)保温30min后检测剩余酶活，以pH 6.5条件下的酶活为100％。其在不同pH下的剩余酶活如表5所示。重组BLMA在pH5.5–7.5范围内表现出良好的稳定性，其酶活力保持在60％以上。

表5重组BLMA在不同pH下保温30min后的剩余酶活

注：测定BLMA的pH稳定性时，所用温度为60℃。

(6)离子稳定性

将重组麦芽糖淀粉酶BLMA在含有5mM金属离子(Mn²⁺、Li⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、K⁺、Cu²⁺、Fe²⁺和Zn²⁺)，化学物质(EDTA和SDS)的溶液(pH 6.5)中，60℃保温30min，测定酶的离子依赖性及化学物质影响。以不添加任何金属离子或化学物质的BLMA酶活性为100％。重组BLMA的相对酶活性如表6所示。Mn²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、EDTA和SDS抑制了酶的活性，而Ca²⁺对淀粉酶的亲和力比其它离子强很多，在存在Ca²⁺情况下，淀粉酶具有更高的活性。BLMA显示出较强的Ca²⁺依赖性。

表6重组BLMA在不同溶液中保温30min后的相对酶活

实施例6：应用麦芽糖淀粉酶改变面团流变学特性

通过向面团中添加梯度含量(0、30、60和90ppm)的纯化后的比酶活3235U mg^-1的麦芽糖淀粉酶BLMA处理后，测定产麦芽糖淀粉酶对面团流变学特性的影响。以未经酶处理的样品作对照。面团配方为：面包粉500g，白砂糖35g，食用盐5g，酵母5g，水650g。

面团的流变学测试采用AACC No.54-60标准《Determination of RheologicalBehavior as a Function of Mixing and Temperature Increase in Wheat Flour andWhole Wheat Meal》，使用Mixolab混合试验仪确定面团的特性。实验过程遵循“Chopin+”协议，设定测试条件：吸水率58％，水合参考率14％，生面团速度80r min^-1，目标扭矩(1.1±0.5)Nm，生面团重量75g。温度控制包括三个阶段：(1)恒温阶段：30℃持续8分钟；(2)加热阶段：在15分钟内，以4℃/min的速度升温至90℃，并在高温下保持7分钟；(3)冷却阶段：在10分钟内以4℃/min的速度降温至50℃，并保持5分钟。先对基础粉进行吸水率的测定，确定基础粉吸水率为58％。按照该吸水率，添加适宜量的麦芽糖淀粉酶进行实验，最终得到C1、C2、C3、C4和C5以及形成时间、稳定时间等参数如表7所示。

表7 Mixolab标准测试参数

C1：稠度最大值；用于测定吸水率；

C2：稠度最小值；用于测定在机械力和温度下蛋白质的弱化；

T1：也可称为形成时间；达到C1时所需的时间；表示面团形成时间(面筋越强，时间越长)；

Ts：也可称为稳定时间；力矩C1-11％之上的持续时间；面团的耐揉性(时间越长，面团越强)；

C3：峰值粘度；用于测定淀粉糊化特性；

C4：保持粘度；测定淀粉糊化胶的稳定性；

C5：回生终点粘度；测定冷却过程淀粉糊化胶的回生特性；

C1—C2：总弱化值；

C2—C3：表示淀粉的热糊化特性；

C3—C4：表示淀粉酶的活性；

C5—C4：表示淀粉的回生特性；

由表中Mixolab标准测试参数可以看出：重组麦芽糖淀粉酶BLMA使用量对面团的吸水率，形成时间以及总弱化值有些许影响。加入60ppm BLMA的面团吸水率最高，总弱化值C1—C2最低，以60ppm添加BLMA对于面包面团的操作特性是有利的。

C3，C4和C5值是非常重要的指标，反映了面团在粘性制备阶段的特性。C3值较高，面团不易糊化，C5–C4值较低，淀粉的回生率较低。麦芽糖淀粉酶BLMA使用量对C4保持粘度、C5回生终点粘度、C3-C4粘度崩解值和C5-C4回生值的影响较大。由C3-C4可以看出加入麦芽糖淀粉酶后淀粉酶的活性增加。由C5-C4可看到烘焙品的回生值明显降低。因此麦芽糖淀粉酶的添加可以降低回生。

实施例7：应用麦芽糖淀粉酶改变面包质构

(1)面包制备

面包烘烤的基本配方按质量百分比计为：小麦粉57.4％，酵母0.6％，糖4.0％，盐0.6％和水37.4％。添加三种纯化后的麦芽糖淀粉酶用于面包烘烤以研究酶对面包烘焙品质的影响，实施例6表明60ppm BLMA是十分有利的，此处推荐为面包A添加60ppm BLMA(比酶活3235U mg^-1)，面包B和面包C则分别添加90ppm Angel Yeast Company提供的酶(比酶活2438U mg^-1)和60ppm Novamyl 3D BG(比酶活3073U mg^-1)，此处添加量均为最适推荐量。将未经麦芽糖淀粉酶处理的面包用作对照组面包D。

面包制备步骤为：将称量好的小麦粉、白砂糖、食用盐、酵母和麦芽糖淀粉酶加入搅拌缸内预先混合，然后加入称量的水开始搅拌。将面团低速揉合4分钟，然后高速揉合2分钟。面团松弛5分钟后，将其分成几部分，等待面团成形并发酵。从容器中取出面团，并用薄的干净塑料覆盖，并保持约5min。将面包在170℃的上火和下火温度的烤箱中，烘烤32min。将新鲜出炉的面包冷却1h后，将其放入聚乙烯袋中，并置于25℃和33％相对湿度下保存。

(2)面包比容测定

面包的比容反映了面团的醒发和保持力：面包的比容越大，证明面包越容易醒发。本发明根据AACC,10-05规定的方法测量了四组面包的比容如表8所示。

表8面包比容

注:数据表示为平均值±标准偏差(n＝3)。同一列中的不同字母表示显着差异(p<0.05)。

表8显示，面包A(60ppm BLMA)，面包B(90ppm Angel Yeast Company提供的酶)，面包C(60ppm Novamyl 3D BG)的比容明显更高，分别比对照组D高32.0％，24.7％和30.3％。添加60ppm本发明中的重组BLMA比添加60ppm Novamyl 3D BG能更好地改善面包的比容。

(3)面包硬度和弹性

在面包存储过程中，面包硬度与面包制作质量下降有关，其弹性决定了面包的功能特性。将上述面包A、B、C、D进行冷藏存放，在四组面包分别储存0，3，5，7及10天后，对面包的硬度和弹性进行对比。首先将面包从中心切成12.5毫米厚的切片，并将两个切片堆叠在一起作为样品，以测试其硬度和弹性。将每个2cm厚的切片固定在平台上，并使用直径25mm的圆柱形铝探针将其压缩至高度的50％。然后将触发力设置为5g，预测试速度为1mm s^-1，测试速度为1mm s^-1，后测试为5mm s^-1，压缩间隔为30s。根据力-距离图计算面包的硬度和弹性。

由图1可以看出：与对照组D相比，在添加麦芽糖淀粉酶BLMA 10天后，添加了麦芽糖淀粉酶的A、B和C组的面包硬度分别降低了2.12、1.52和1.98倍。添加了本发明中的重组麦芽糖淀粉酶BLMA的面包A较在储存过程中出现了硬度较好的现象。

由图2可以看出：面包弹性的变化与面包硬度的变化基本一致。与对照组D相比，BLMA能够显着(p<0.05)抑制3、5、7和10天储存后面包弹性的下降，说明了麦芽糖淀粉酶BLMA能有效地延缓淀粉的回生，增加烘焙的货架期。

(4)面包感官评价

在面包储存的第7天，随机编号三种经过不同麦芽糖淀粉酶处理的面包，以用于感官评估。面包的感官评估基于Patil的方法，对面包的外观，颜色，光滑度，质地，风味，味道，气孔和总体可接受性等方面进行了评估，得分从1(非常不喜欢)到9(非常喜欢)不等。

表9面包A、面包B、面包C和面包D的感官参数得分

从表9可以看出：添加了麦芽糖淀粉酶BLMA的面包A在各项参数上均优于未添加麦芽糖淀粉酶的空白组面包D，相较于添加了其他种类麦芽糖淀粉酶的面包B和面包C，面包A的总得分最高，说明本发明中的重组麦芽糖淀粉酶BLMA有利于在储存期间保持面包的味道，质地，风味等，能为成品提供更长的货架期。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产麦芽糖淀粉酶的重组菌株及其在烘焙食品中的应用

<130> BAA200877A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 568

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 1

Met Arg Lys Glu Ala Ile His His Arg Ser Thr Asp Asn Phe Ala Tyr

1 5 10 15

Ala Tyr Asp Pro Glu Thr Leu His Leu Arg Leu Gln Thr Lys Lys Asn

20 25 30

Asp Val Asp His Val Glu Leu Leu Phe Gly Asp Pro Tyr Glu Trp His

35 40 45

Asp Gly Ala Trp Gln Phe Gln Thr Met Pro Met Arg Lys Thr Gly Ser

50 55 60

Asp Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Leu Ala Glu Val Lys Pro Pro Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Leu Arg Tyr Gly Phe Val Leu Arg Ala Gly Gly Glu Lys Leu Val

85 90 95

Tyr Thr Glu Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys Ser Tyr Gly

100 105 110

Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp Gly Asp Asp

115 120 125

Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln Leu Gly Val

130 135 140

Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp Thr Leu Ala

145 150 155 160

Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg Asp Phe Lys

165 170 175

Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp Thr Leu Val

180 185 190

Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Phe Val Pro

195 200 205

Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Tyr Phe Ala Glu Gly

210 215 220

Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr Phe Asp Asp

225 230 235 240

Asp Ile Ser Asn Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Asp Ile Ser Asn Trp Asp

245 250 255

Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro Ala Gly Phe

260 265 270

Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala Gln Tyr Leu

275 280 285

Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp Gly Leu Arg

290 295 300

Tyr Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys Ser Leu Ala

305 310 315 320

Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly Glu Trp Tyr

325 330 335

Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val Arg Tyr Ala

340 345 350

Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn Thr Val Ile

355 360 365

Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp Leu Asn Asn

370 375 380

Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu Asn Leu Ile

385 390 395 400

Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser Val Asn Ser

405 410 415

Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu Thr Asp Glu

420 425 430

Val Asn His Leu Val Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Glu Thr Val Met

435 440 445

Ile Ala Ile Asn Arg Ser Asn Glu Ala Ala Glu Thr Pro Leu Ser Gly

450 455 460

Leu Gln Ile Asp Ala Arg Gly Lys Trp Leu Val Asn Leu Ile Gln His

465 470 475 480

His Asp Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser Phe Thr Leu Ala Pro Gly

485 490 495

Phe Phe Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala Pro

500 505 510

Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu

515 520 525

Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala Gln

530 535 540

Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe Ser

545 550 555 560

Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln

565

<210> 2

<211> 1707

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<400> 2

atgcgcaaag aagccatcca tcatcgcagc acggacaact ttgcctatgc ctatgacccg 60

gaaacgctgc atctgcgcct gcagacgaaa aaaaacgacg tcgaccatgt cgaactgctg 120

tttggcgacc cgtatgaatg gcatgacggc gcctggcagt ttcagacgat gccgatgcgc 180

aaaacgggca gcgacggcct gtttgactat tggctggccg aagtcaaacc gccgtatcgc 240

cgcctgcgct atggctttgt cctgcgcgcc ggcggcgaaa aactggtcta tacggaaggc 300

gacacgacga acaacaaccc ggccaaaagc tatggcctgt atgacccgac gaaaagcaaa 360

tggaaaatgt attggggcga cgacctggaa ggcgtccgcc agaaactgcc gtatctgaaa 420

cagctgggcg tcacgacgat ctggctgagc ccggtcctgg acaacctgga cacgctggcc 480

ggcacggaca acacgggcta tcatggctat tggacgcgcg actttaaaca gatcgaagaa 540

cattttggca actggacgac gtttgacacg ctggtcaacg acgcccatca gaacggcatc 600

aaagtcatcg tcgactttgt cccgaaccat agcacgccgt ttaaagccaa cgacagctat 660

tttgccgaag gcggcgccct gtataacaac ggcacgtata tgggcaacta ttttgacgac 720

gacatcagca actgggacga ccgctatgaa gacatcagca actgggacga ccgctatgaa 780

gcccagtgga aaaactttac ggacccggcc ggctttagcc tggccgacct gagccaggaa 840

aacggcacga tcgcccagta tctgacggac gccgccgtcc agctggtcgc ccatggcgcc 900

gacggcctgc gctatgacgc cgtcaaacat tttaacagcg gctttagcaa aagcctggcc 960

gacaaactgt atcagaaaaa agacatcttt ctggtcggcg aatggtatgg cgacgacccg 1020

ggcacggcca accatctgga aaaagtccgc tatgccaaca acagcggcgt caacgtcctg 1080

gactttgacc tgaacacggt catccgcaac gtctttggca cgtttacgca gacgatgtat 1140

gacctgaaca acatggtcaa ccagacgggc aacgaatata aatataaaga aaacctgatc 1200

acgtttatcg acaaccatga catgagccgc tttctgagcg tcaacagcaa caaagccaac 1260

ctgcatcagg ccctggcctt tatcctgacg gacgaagtca accatctggt ctatgaacgc 1320

aaatttttta acgaaacggt catgatcgcc atcaaccgca gcaacgaagc cgccgaaacg 1380

ccgctgagcg gcctgcagat cgacgcccgc ggcaaatggc tggtcaacct gatccagcat 1440

catgacgtca gcaacggcag cgtcgccagc tttacgctgg ccccgggctt ttttggcacg 1500

cagacgagcg tcgtctttac ggtcaaaagc gccccgccga cgaacctggg cgacaaaatc 1560

tatctgacgg gcaacatccc ggaactgggc aactggagca cggacacgag cggcgccgtc 1620

aacaacgccc agggcccgct gctggccccg aactatccgg actggtttta tgtctttagc 1680

gtcccggccg gcaaaacgat ccagtaa 1707

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

aarwsnaart ggaaratgt 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

nttyacngtn aarwsngcnc c 21

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttgacggcg tcgatgc 17

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgaatggta tggcg 15

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttccagatgg ttggccgt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgagcgtcaa cagcaaca 18

Claims

1.一种麦芽糖淀粉酶，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述麦芽糖淀粉酶的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求1所述麦芽糖淀粉酶的重组微生物细胞。

5.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pMA0911为载体，在枯草芽孢杆菌中表达SEQID NO.1所示的麦芽糖淀粉酶。

6.一种可溶性表达麦芽糖淀粉酶的方法，其特征在于，将权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌接种到培养基中，在30～35℃培养24～48h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基含有胰蛋白胨、酵母提取物、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。

8.酶制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的麦芽糖淀粉纯酶，或所述麦芽糖淀粉酶与酶保护剂的混合物。

9.权利要求1所述的麦芽糖淀粉酶，或权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，或权利要求8所述的酶制剂在烘焙食品领域的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述烘焙食品包括但不限于面包。