JP2005537806A - ベーキングにおけるキシラン分解活性を有するファミリー8酵素の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、グリコシド加水分解酵素ファミリー8に属するキシラン分解活性を有する酵素を含むパンまたは生地改良剤を添加することによる、生地および/または焼きあげ製品の性質を改良する方法を記載する。好ましい酵素は、シュードアルテロモナス ハロプランクティス(Pseudoalteromonas haloplanktis)からの低温性キシラナーゼおよびバチルス ハロデュランス(Bacillus halodurans)C−125からの中温性キシラナーゼである。
Description
ハロプランクティスからの低温性キシラナーゼについて示されている(Van Petegemら、2003, J. Biol. Chem. Vol.278(9), p7531-9; Collins, T.ら、2002, A novel Family 8 xylanase: functional and physico-chemical characterisation. J. Biol. Chem. Vol.277(38), p35133)。グリコシド加水分解酵素ファミリー8に属する他のキシラナーゼはすでに報告されている(Yoon, K-H., 1998, Molecular cloning of a Bacillus sp. KK-1 xylanase gene and characterization of the gene product. Biochem. Mol. Biol. International. 45(2), p.337; Bacillus halodurans C-125 xylanase Y GenBank/GenPeptTM accession code BAB05824)。これらのキシラナーゼは、それらの間および、Collinsら(2002,上記)によって記されたような、シュードアルテロモナス ハロプランクティスキシラナーゼとの間で配列相同性を示す。
グリコシド加水分解酵素ファミリー8からのキシラン分解活性を有する酵素は、種々のソースから得ることができる(例えば、概要は、http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/参照)。酵素のいくつかは、学術文献に記載されており、したがって、対応する刊行物中に記載の手法を用いて得られる。以下に、本発明に係るいくつかの好ましい酵素の調製について、より詳細に説明する。
シュードアルテロモナス ハロプランクティスTAH3aからのキシラナーゼは、Collins T.ら(2002. A novel Family 8 xylanase: functional and physico-chemical characterisation. J. Biol. Chem. Vol.277(38), p35133)に記載されている。Collinsらは、発現プラスミド中にクローニングされたシュードアルテロモナス ハロプランクティスTAH3aキシラナーゼ遺伝子を持つ大腸菌の組換え株の液体培養による調製を記載している。
バチルス ハロデュランスC−125株からのファミリー8キシラナーゼYの配列(ATCCCBAA-125)はGenBank/GenPeptTM登録コードBAB05824として利用可能である(それに参照で添付された配列、図4、配列番号:8)。対応するDNA配列は、バチルス ハロデュランスC−125株の完全ゲノム配列の一部として利用可能である(登録コード
AP001514、それに参照で添付された配列)。
精製されたまたは精製されていない、本発明に係るキシラン分解活性を有する酵素は、特に、パン改良剤として好適である。パン改良剤は、きめ、香り、劣化防止効果、柔らかさ、保存によるクラムの柔らかさ、新鮮さ、生地の機械加工性、最終製品の容量を改良または増加させうる製品である。好ましくは、キシラン分解活性を有する酵素は、生地の取扱い性を改善し、および/または最終焼きあげ製品の比容量を増加させる。「焼きあげ製品」は、生地から調製されるすべての製品、特に、酵母で膨らませた焼きあげ製品を包含するものである。生地は、あらゆる種類の小麦粉またはミール(例えば、小麦、ライ麦、大麦、オート麦またはトウモロコシベースのもの)から得られる。好ましくは、生地は、小麦または小麦を含むミックスで調製される。
オリザエ(Aspergillus oryzae)からのα−アミラーゼを添加した効果に関する。キシラン分解活性を有する前記酵素は、他の酵素、乳化剤、酸化剤、ミルク粉末、脂肪、糖類、アミノ酸、塩類、タンパク質(グルテン、セルロース結合部位)等の、ただしそれらに限定されない、他のパン改良剤と組み合わせて使用してもよく、そのような改良剤は当業者に周知である。酵素の例は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼ等であるが、ただしそれらに限定されない。
シュードアルテロモナス ハロプランクティスからのキシラナーゼは、記載のように(collinsら、2002、上記参照)、対応する遺伝子を含むDNAベクターで形質転換した大腸菌の組換え菌株の液体培養物から得られた。
(菌株および培養条件)
バチルス ハロデュランスC−125(ATCC BAA-125)を、10g/lのバーチウッド(birchwood)キシラン(シグマ社)を補足したアルカリ性バチルス培地(10g/lのグルコース、5g/lの酵母エキス(Difco社)、10g/lのバクトトリプトファン(Difco社)、1g/lのK2HPO4、0.2g/lのMgSO4、10g/lのNa2CO3)中で、37℃、72時間培養した。18000g、4℃で1時間遠心分離した後、上清を80%硫酸アンモニウムで析出させて濃縮し、pH8.0で20mM MOPS中に再懸濁した。この画分は、ベーキング試験に使用される粗抽出画分に相当する。
ゲノムDNAは、上記の改変アルカリ性バチルス培地中、37℃で培養した16時間培養物から、Wizard(登録商標)ゲノムDNA精製キット(Promega社)で抽出および精製した。刊行された配列(GenBank/GenPeptTM 登録番号AP001514)に基づいて、全体のキシラナーゼY遺伝子は、Nde I部位(下線部)を含むセンスプライマー
5'-GGGCATATGAAGAAAACGACAGAAGG TG-3'、配列番号1
およびXho I部位(下線部)と停止コドン(イタリック)を含むアンチセンスプライマー
5'-GGCTCGAGCTAG TGTTCCTCTTCTTG-3'、配列番号2
と共にVENTポリメラーゼ(Biolabs Inc, Bervely, MA, USA)を用いてPCR増幅した。
5'-GTGCGGACTGAAGGAATGTC-3'、配列番号3
5'-GTATGGTCCATCAACAGAGG-3'配列番号4
5'-GATGGCACTAAAAACTCCTGG-3'配列番号5
を用いて行った。
キシラナーゼ遺伝子を有する大腸菌BL21(DE3)細胞の5時間予備培養物(37℃)15mlを10000gで1分間遠心分離し、ペレットを、3リットルの振盪フラスコ中の200μg/mlアンピシリンを含むテリフィックブロス(terrific broth)(12g/lのバクトトリプトファン(Difco社)、24g/lの酵母エキス(Difco社)、4ml/lのグリセリン、12.54g/lのK2HPO4、2.31g/lのKH2PO4)900mlに再懸濁した。培養物を、550nmでの吸光度が3〜4の間に達するまで37℃、250rpmでインキュベートし、次いで酵素の発現を1mMイソプロピル−1−チオ−β−ガラクトピラノシドで誘起した。37℃でさらに15時間インキュベートした後、細胞を4℃、18000gで30分間遠心分離することにより収集し、10mM NaClを含む50mM BICINE中に再懸濁し、予備冷却した細胞破壊剤(Constant System社、Warwick, UK)中で28Kpsiで破壊し、40,000gで30分間遠心分離した。
キシラナーゼ遺伝子を有する大腸菌BL21(DE3)細胞の5時間予備培養物(37℃)の細胞を10,000gで1分間遠心分離することにより収集し、200μg/mlアンピシリンを含むテリフィックブロス(12g/lのバクトトリプトファン(Difco社)、24g/lの酵母エキス(Difco社)、4ml/lのグリセリン、12.54g/lのK2HPO4、2.31g/lのKH2PO4)5リットル(培養1リットルあたり、15ml予備培養物)を接種するために使用した。培養物を、550nmでの吸光度が3〜4の間に達するまで37℃、250rpmでインキュベートし、次いで酵素の発現を1mMイソプロピル−1−チオ−β−ガラクトピラノシドで誘起した。37℃でさらに4時間インキュベートした後、細胞を4℃、18000gで20分間遠心分離することにより収集し、20mM MOPS(Sigma社)中に再懸濁し、予備冷却した細胞破壊剤(Constant System社)中で28Kpsiで破壊し40,000gで30分間遠心分離した。染色体DNAは、0.2%硫酸プロタミン(Calbiochem社)で処理し、40,000gで30分間遠心分離することにより除去した。その後、25単位のベンゾナーゼ(Merck,
Darmstadt, ドイツ)を添加し、溶液をベーキング試験で使用した。
ベーキング試験は、ベーキングにおけるシュードアルテロモナス ハロプランクティスTAH3aキシラナーゼのプラス効果を実証するために行われた。プラス効果は、この酵素を含まない対照物と比較して、パンの体積の増加により評価した。
CondoTMオーブン(Michael Wenz-Arnstein-Germany)中、230℃で焼きあげた。6ロールの体積は、一般に使用される菜種押しのけ容積法を用いて測定した。
実施例3に記載されたベルギーハードロール分析における体積への同じ効果を得るために必要なキシラナーゼの相対量は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により比較される。
・シュードアルテロモナス ハロプランクティスTAH3aからのキシラナーゼ(30P.ハロプランクティス単位/100kg小麦粉)
・バチルス ズブチリスからのキシラナーゼ(Belase B210 (BELDEM S.A., ベルギー)−3g/100kg小麦粉)
ハロプランクティスTAH3aからのキシラナーゼの量は、他のものに比べて、有意に少ないことを結論付けることができる。
ベーキング試験は、例えばアルゼンチンパンのような、実施例3で使用されたものとは違うレシピでのベーキングにおけるファミリー8キシラナーゼのプラス効果を実証するために行われた。プラス効果は、本発明の酵素を含まない対照物と比較して、パンの体積の増加によりおよびパンの表面のカット幅により評価した。
(2):キシラナーゼの1単位は、30℃、pH4.5でバーチウッドキシランから1マイクロモルの還元糖(キシロースで表される)を放出するのに必要な酵素の量として定義される(Nelson-Somogyi法)。
ベーキング試験は、グリコシド加水分解酵素ファミリー8に属し、キシラン分解活性を有する種々の酵素のベーキングにおけるプラス効果を実証するために行われた。プラス効果は、これらの酵素を含まない対照物および市販の酵素製剤(Bel'ase B210、上記参照)と比較して、パン体積の増加により評価した。
Claims (22)
- 焼きあげ製品を製造する方法であって、グリコシド加水分解酵素ファミリー8よりなる群から選択される少なくとも一つのキシラン分解活性を有する酵素を含んでなるパン改良組成物をその焼きあげ製品の生地に添加する工程を含んでなる方法。
- 前記酵素が、立体配置の反転を伴って加水分解するものである、請求項1の方法。
- 前記酵素が、シュードアルテロモナス ハロプランクティス株から得られるキシラナーゼである、請求項1または2の方法。
- 前記シュードアルテロモナス ハロプランクティス株がシュードアルテロモナス ハロプランクティスTAH3aである、請求項3の方法。
- 前記酵素が、バチルス ハロデュランス株から得られるキシラナーゼである、請求項1または2の方法。
- 前記バチルス ハロデュランス株がバチルス ハロデュランスC−125である、請求項5の方法。
- 前記パン改良組成物が、生地の混合中に添加される、請求項1−6のいずれかの方法。
- 前記パン改良組成物が、他の酵素、乳化剤、酸化剤、ミルク粉末、脂肪、糖類、アミノ酸、塩類、タンパク質(グルテン、セルロース結合部位)またはそれらの混合物よりなるリストから選択される他のパン改良剤をさらに含んでなる、請求項1−7のいずれかの方法。
- 前記他の酵素が、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトジェニック、アミラーゼ、他のキシラナーゼ、プロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼまたはそれらの混合物よりなるリストから選択されるものである、請求項8の方法。
- 前記α−アミラーゼが、アスペルギルス オリザエから得られるα−アミラーゼである、請求項9の方法。
- 前記キシラン分解活性を有する酵素が、細胞抽出物、無細胞抽出物または精製タンパク質として存在する、請求項1−10のいずれかの方法。
- 前記キシラン分解活性を有する酵素が、乾燥粉末もしくは粒体、特に粉化しない粒体の形態または液体の形態の他の成分、好ましくはポリオール、糖類、有機酸または糖アルコール等の1以上の安定剤と混合される、請求項1−11のいずれかの方法。
- 請求項1−12のいずれかの方法により得られる、焼きあげ製品。
- カット幅の大きいアルゼンチンパンである、請求項13の焼きあげ製品。
- 前記焼きあげ製品の生地の混合中に、グリコシド加水分解酵素ファミリー8よりなる群から選択されるキシラン分解活性を有する酵素の十分量を添加する工程を含んでなる、焼きあげ製品の一塊の量を増加させる方法。
- 前記焼きあげ製品の生地の混合中に、グリコシド加水分解酵素ファミリー8、立体配置の反転を伴って加水分解するファミリー8グリコシド加水分解酵素および/またはそれらの組み合わせよりなる群から選択されるキシラン分解活性を有する酵素の十分量を添加する工程を含んでなる、焼きあげ製品の一塊の量を増加させるあるいは焼きあげ製品の表面のカット幅を増加させる方法。
- グリコシド加水分解酵素ファミリー8よりなる群から選択される少なくとも一つのキシラン分解活性を有する酵素を含むことを特徴とする、焼きあげ製品の一塊の量を増加させるあるいは焼きあげ製品の表面のカット幅を増加させるためのパン改良組成物。
- 前記酵素が立体配置の反転を伴って加水分解するものである、請求項17のパン改良組成物。
- 前記酵素が、シュードアルテロモナス ハロプランクティス株から得られるキシラナーゼである、請求項17または18のパン改良組成物。
- 前記シュードアルテロモナス ハロプランクティス株がシュードアルテロモナス ハロプランクティスTAH3aである、請求項19のパン改良組成物。
- 前記酵素が、バチルス ハロデュランス株から得られるキシラナーゼである、請求項17または18のパン改良組成物。
- 前記バチルス ハロデュランス株がバチルス ハロデュランスC−125である、請求項21のパン改良組成物。
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