ES2360942T3 - Utilización de enzimas de la familia 8 con activdad xilanolítica en panificación. - Google Patents

Utilización de enzimas de la familia 8 con activdad xilanolítica en panificación. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la preparación de un producto panificado, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de adición a la masa de dicho producto panificado de una composición mejorada mejoradora del pan que comprende por lo menos una enzima con actividad xilanolítica seleccionada de entre el grupo constituido por la familia 8 de las glucósido oxidasas.

Description

Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento y a una composición para la mejora de los productos de panificación que comprenden por lo menos una enzima con actividad xilanolítica procedente de la familia 8 de glucósido oxidasa. En una forma de realización de la invención, dicha enzima con actividad xilanolítica se caracteriza además por el hecho de que existe una inversión de configuración durante la hidrólisis. En las formas de realización específicas de la invención dicha enzima con actividad xilanolítica es una xilanasa psicrófila procedente de Pseudoalteromonas haloplanktis o una xilanasa mesófila procedente de Bacillus halodurans.
Antecedentes de la invención
Los xilanos son heteropolisacáridos que forman la mayor parte de la hemicelulosa presente en la biomasa vegetal. El eje central de estos polisacáridos es una cadena de restos de xilopiranosilo unidos por β 1-4. Muchos grupos laterales diferentes se podrían unir a estos restos, tales como los restos de acetilo, arabinosilo y glucuronosilo. Los compuestos fenólicos, como por ejemplo los ácidos ferúlico o hidroxicinnámico están implicados también mediante enlace éster en la reticulación de las cadenas de xilano o por ejemplo, en el enlace entre el xilano y las cadenas de lignina.
La endoxilanosas (o endo-β-1,4-xilanasas) hidrolizan específicamente el eje central de la hemicelulosa. En algunos casos, los grupos laterales pueden enmascarar la cadena principal mediante impedimento estérico. Se han descrito diferentes actividades de las xilanasas. Su especificidad hacia su sustrato varía de una a otra. Algunas son más activas en los arabinoxilanos insolubles. La longitud de los oligómeros producidos depende también del tipo de xilanasa considerado.
Las glucósido hidrolasas (conocidas anteriormente como familia D de celulasa) se han clasificado en 91 familias (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) basándose en las homologías de secuencia, las características estructurales y mecánicas. Debido a que el pleglamiento de las proteínas se conserva mejor que sus secuencias, algunas de las familias se pueden agrupar en “clanes” (Henrissat B. 1991, Biochem. J. Vol. 280, p 309). Las endo-beta-1,4-xilanasas se clasifican generalmente en las familias 10 (anteriormente familia F) y 11 (anteriormente familia G) y se observa que frecuentemente presentan una relación inversa entre su pI y el peso molecular. Las xilanasas de la familia 10 (EXs10) son mayores, más complejas, mientras que las xilanasas de la familia 11 (EXs11) son más pequeñas. Además existe una diferencia significativa en la estructura y en las propiedades catalíticas de ambas familias. EXs10 presenta un plegamiento de (α/β) 8 en barrilete, tiene aproximadamente el 40% de estructura de la hélice α y pertenece al clan GHA (Domínguez et al., 1995, Nat. Struct. Biol. Vol. 2, pág. 569) mientras que EXs11 presenta una conformación de plegamiento de gelatina β, presenta aproximadamente de 3 al 5% de estructuras de la hélice α y pertenece al clan GHC (Törrönen et al., 1994, EMBO J. Vol. 13, pág. 2498). EXs10 posee un punto de enlace al sustrato más pequeño y una especificidad menor para el sustrato, presenta frecuentemente actividad de endoglucanasa y producen oligosacáridos más pequeños en comparación con EXs11, que poseen una afinidad mayor para el xilano no sustituido (Biely et al., 1997, J. Biotechnol. Vol. 57, pág. 151). Todas las xilanasas de ambas familias caracterizadas hasta la fecha conservan la configuración anomérica del oxígeno glucosídico tras la hidrólisis en la cual dos glutamatos funcionan como restos catalíticos (Jeffries, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 7, pág. 337).
Las xilanasas se utilizan en varias áreas industriales tales como en las industrias de la pulpa, papel, alimentación y panificación. Otras aplicaciones se sitúan en los sectores de los zumos y de la cerveza. Las xilanasas podrían también utilizarse en los procesos de separación del trigo. Los efectos tecnológicos observados son, entre otros, la capacidad de blanqueo de la pulpa mejorada, la disminución de la viscosidad de la alimentación o de los cambios en las características de la masa.
La utilización de las xilanasas (denominadas también hemicelulasas o pentosanasas) en panificación es bien conocida desde hace muchos años. Las enzimas de acondicionamiento de la masa pueden mejorar la maquinabilidad y estabilidad de la masa así como las burbujas en el horno y la estructura de la miga. Otros efectos de los enzimas son un mayor volumen de la barra y una miga más blanda.
El mecanismo de acción de las xilanasas en la preparación del pan todavía no está elucidado claramente. Existen aproximadamente 3 a 4% de pentosanos en la harina de trigo. Estos pentosanos pueden absorber grandes cantidades de agua (hasta 30%). Esta absorción de agua contribuye a las propiedades de la masa así como a la calidad del producto final. La hidrólisis parcial de los pentosanos por las pentosanasas en los oligosacáridos de cadena corta solubles en agua aumenta la capacidad de fijación del agua. Existe también una interacción fuerte de los pentosanos con la fracción del gluten de la harina para formar una red. Las pentosanasas pueden ayudar a relajar esta red fuerte y rígida y permitir, por lo tanto, que el dióxido de carbono formado por la levadura expanda mejor la masa.
Muchos tipos de preparaciones de hemicelulasa se han utilizado como ingredientes activos de panificación y están disponibles en el comercio. Se producen mediante fermentación microbiana utilizando varios microorganismos como fuentes de enzimas. Algunas de estas enzimas son producidas también por microorganismos modificados genéticamente. Todas las utilizaciones documentadas de las xilanasas que presentan un efecto positivo sobre el volumen específico de los productos panificados, se refieren a las xilanasas pertenecientes a la familia 10 o la familia 11 de las glucósido hidrolasas tal como se definió anteriormente.
Ejemplos de xilanasas para panificación son las xilanasas procedentes de Bacillus Subtilis y Aspergillus niger.
Existe una variedad de procedimientos para evaluar la actividad de la xilanasa en una preparación enzimática. Ejemplos de dichos procedimientos de determinación de la actividad de la xilanasa son la medición de la liberación de azúcar reductor del xilano (Miller G.L. 1959, Anal. Chem. Vol. 31, pág. 426) o la medición de la liberación de compuestos coloreados de los substratos modificados (por ejemplo AzoWAX o Xylazyme AX de Megazyme). Sin embargo no se pudo encontrar ninguna correlación directa entre la actividad xilanolítica observada en varias preparaciones enzimáticas y el efecto en la panificación. Se pueden observar hasta un cierto punto resultados relacionados con la dosis para una sola enzima pero la misma dosis para dos xilanasas de diferentes orígenes no dan el mismo resultado en la masa o en el pan. Varias razones podrían explicar esto: las diferencias en la especificidad del substrato, las diferencias en las temperaturas y el pH óptimo,…
Es de gran interés desarrollar nuevas preparaciones enzimáticas, tales como composiciones o agentes mejoradores del pan, con propiedades nuevas o mejoradas. Una de estas propiedades podría ser que la fracción de xilanasa sea tan pequeña como sea posible (desde el punto de vista del peso de las enzimas necesario para obtener un determinado resultado en panificación).
Recientemente se ha descrito una xilanasa de la bacteria antártica Pseudoalteromonas haloplanktis (Collins, T. et al. 2002. A novel Family 8 xilanasa: functional and physico-chemical characterisation. J. Biol. Chem. Vol. 277.38, pág. 35133; Collins, T. et al.. 2003, Activity, stability and flexibility in glycosidases adapted to extreme thermal environments.
J. Mol. Biol. Vol. 328, pág. 419; Van Petegem F. et al., 2002. Crystallization and preliminary X-ray analysis of a xylanase from the psychrophile Pseudoalteromonas haloplanktis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. Vol. 58 (Pt. 9), pág. 1494-6). Esta enzima es una enzima psicrófila típica y presenta una gran actividad catalítica a baja temperatura. No es homóloga de las xilanasas de la familia 10 u 11 pero presenta 20 a 30% de identidad con los miembros de la familia 8 de las gluclósido hidrolasas (anteriormente familia D), familia que comprende principalmente las endoglucanasas pero también las liquenasas y las quitosanasas. Además, una FingerPRINTScan contra PRINTS utilizando el programa de investigación InterPro Scan (Zdobnov y Apweiler, 2001, Bioinformatics Vol. 17, pág. 847) indicó que la secuencia aislada contenía la huella digital de la familia 8 de las glucosil hidrolasas y restos de la familia 8 que están estrictamente conservados en 20 enzimas de la familia 8 analizadas.
Al contrario de lo que ocurre con EXs10 y EXs11, esta xilanasa de la familia 8 (EXs8) tiene elevado tanto el pH como el peso molecular. Las propiedades estructurales y catalíticas son diferentes a las de ambas EXs10 y EXs11. EXs8 presenta un plegamiento (α/α)6 en barrilete con 13 hélices α y 13 cadenas β y pertenece al clan GH-M (Van Petegem et al., 2003, The structure of a cold-adapted family 8 xylanase at 1.3 A resolution. Structural adaptations to cold and investigation of the active site. J. Biol. Chem. Vol. 278(9), pág. 7531-9). Estas enzimas no presentan actividad de endoglucanasa, quitosanasa o liqueninasa y parecen ser operativamente similares a EXs11, siendo más activas en los xilo-oligosacáridos de cadena larga.
En contraste con otras EXs10 y EXs11 conocidas que conservan la configuración, las gluco-hidrolasas de la familia 8 (Fierobe et al., 1993. Eur. J. Biochem. Vol. 217, pág. 557; http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) tienden a hidrolizar el substrato por inversión de la configuración anómera del oxígeno glucosílico tras la hidrólisis en la que un glutamato y un aspartato funcionan como restos catalíticos. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para la xilanasa psicrófila del Pseudoalteromonas haloplanktis (Van Petegem et al., 2003, J. Biol. Chem., Vol. 278(9), pág. 7531-9; Collins, T. et al. 2002. A novel family 8 xilanase: functional and physico-chemical characterization. J. Biol. Chem. Vol. 277 (38), pág. 35133).
Otras xilanasas que pertenecen a la familia 8 de las glucósido hidrolasas han sido ya descritas (Yoon, K-H., 1998, Molecular cloning of a Bacillus sp. KK-1 xylanase gene and characterization of the gen product. Biochem. Mol. Biol. International. 45(2), pág. 337; Bacillus halodurans C-125 xylanase Y GenBank/GenPeptTM accession code BAB05824). Estas xylanasas presentan homologías de secuencia entre ellas así como con la xylanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis tal como describe Collins et al. (2002, véase anteriormente).
La lista de las enzimas que pertenecen a la familia 8 de las glucósido hidrolasas se actualiza regularmente
(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).
Objetivos de la invención
La presente invención tiene por objetivo proporcionar nuevas preparaciones enzimáticas tales como composiciones mejoradoras del pan.
La presente invención tiene por objetivo además proporcionar un nuevo procedimiento para la obtención de productos de panificación mejorados utilizando dichas preparaciones enzimáticas.
Sumario de la invención
Se descubrió sorprendentemente que una enzima con actividad xilanolítica y perteneciente a la familia 8 de las glucósido hidrolasas presentaba un efecto positivo en las propiedades de la masa o en las propiedades del producto panificado cuando se añadía durante el mezclado de la masa.
Se descubrió asimismo de forma sorprendente que una enzima con actividad de xilanasa y que se hidroliza con inversión de la configuración anómera presentaba un efecto positivo en las propiedades de la masa o en las propiedades de los productos panificados cuando se añadía durante el mezclado de la masa.
Se descubrió además de forma sorprendente que la utilización de enzimas, tal como se describió anteriormente, aumenta el volumen de la barra.
Se descubrió asimismo que la utilización de algunas de dichas enzimas con actividad xilanolítica de la familia 8 de las glucósido hidrolasas, la EXs8, permite utilizar menos enzimas para el mismo efecto en las propiedades de la masa del pan en comparación con las xilanasas conocidas actualmente.
Una forma de realización específica de la presente invención se refiere a las enzimas con actividad xilanolítica de la familia 8 de las glucósido hidrolasas y a su utilización en la industria de panificación, tal como se describió anteriormente.
Una forma de realización particular de la invención se refiere a la xilanasa de la familia 8 psicrófila de la Pseudoalteromonas haloplanktis y a una xilanasa Y mesófila de la familia 8 de Bacillus halodurans. Estas enzimas son xilanasas que hidrolizan con inversión de la configuración anomérica.
Las xilanasas preferidas son las obtenidas a partir de las cepas TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis y C-125 de Bacillus halodurans o las obtenidas a partir del gen correspondiente expresados en un anfitrión adecuado.
Preferentemente, la composición mejoradora del pan que comprende por lo menos una enzima de la invención, se añade durante el mezclado de la masa.
Dicha composición mejoradora del pan puede comprender además otros agentes mejoradores del pan seleccionados de la lista constituida por otras enzimas, emulsionantes, oxidantes, leche en polvo, grasas, azúcares, aminoácidos, sales, proteínas (gluten, puntos de unión a la celulosa) o una mezcla de los mismos.
Dichas otras enzimas se pueden seleccionar de la lista constituida por alfa-amilasas, beta-amilasas, amilasas maltógenas, otras xilanasas, proteasas, glucosa oxidasas, óxido-reductasas, glucanasas, celusasas, transglutaminasas, isomerasas, lipasas, fosfolipasas, pectinasas o una mezcla de las mismas.
Dicha alfa-amilasa se obtiene preferentemente a partir de Aspergillus oryzae.
Las enzimas con actividad xilanolítica según la invención se pueden utilizar en forma de extracto celular, extracto exento de células o como proteína purificada en dicha composición mejoradora del pan.
Las enzimas de la invención se pueden mezclar con otros ingredientes y se pueden utilizar en forma de polvo seco o granulado, en particular de un granulado no pulvurulento o en forma de líquido, preferentemente con uno o más estabilizante(s) como por ejemplo polioles, azúcares, ácidos orgánicos o alcoholes de azúcar.
Otro aspecto de la invención se refiere a los productos panificados obtenidos o que se pueden obtener utilizando una enzima de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a las composiciones mejoradoras del pan que comprenden por lo menos una de las enzimas de la invención.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para aumentar el volumen de la barra de un producto panificado, que comprende la etapa de adición durante el mezclado de la masa de dicho producto panificado, de una cantidad suficiente de una enzima con actividad xilanolítica seleccionada de entre el grupo constituido por las xilanasas de la familia 8 de la glicósido hidrolasa, posiblemente enzimas con actividad xilanolítica que hidrolizan con inversión de la configuración. Es posible utilizar cualquier combinación o mezcla de las enzimas descritas anteriormente en una masa o producto de panadería para cualquiera de los fines descritos anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa el efecto de las cantidades crecientes de TAH3a de xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis en el volumen de los panecillos de Bélgica duros.
La Figura 2 presenta una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de varias muestras de xilanasa (cantidad de enzima cargada proporcional a la cantidad utilizada en la panificación, el mismo factor de proporcionalidad para todas las enzimas).
Banda 1: marcadores del peso molecular.
Bandas 2 a 5: cantidades de xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis (2 a 3) y xilanasa de Bacillus subtilis (4 a 5) necesarias para tratar respectivamente 0,333 (2, 4) y 0,166 kg (3, 5) de harina de trigo.
Las figuras 3A y B representan la secuencia de nucleótidos del gel de xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis (A) y la correspondiente xilanasa (B).
La figura 4 representa la xilanasa Y de la cepa C-125 de Bacillus halodurans.
La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos y formas de realización con referencia a los dibujos adjuntos. Las formas de realización y ejemplos particulares no pretenden de ningún modo limitar el alcance reivindicado de la invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere en particular a la utilización de las enzimas de la familia 8 con actividad xilanolítica en panificación para mejorar entre otros el volumen de la barra. Dichas enzimas pueden presentar otras actividades, pero la actividad xilanolítica debe ser tal que la enzima sea apropiada para los fines de la presente invención.
A. Preparación de algunas enzimas preferidas según la invención
Las enzimas con actividad xilanolítica de la familia 8 de las glucosil hidrolasas se puede obtener de varias procedencias (véase p. ej. http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/ para una visión general). Algunas de las enzimas se han descrito en la bibliografía científica y por lo tanto pueden obtenerse utilizando las técnicas descritas en las correspondientes publicaciones. A continuación, se describe con más detalle la preparación de algunas enzimas preferidas según la invención.
A.1. Xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis
La xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis ha sido descrita en Collins T. et al. (2002. A novel Family 8 xilanase: functional and physico-chemical characterisation. J. Biol. Chem. Vol. 277(38), pág. 35133). Collins et al. describe la preparación mediante cultivo líquido de una cepa recombinante de Escherichia coli que lleva el gen de xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis clonado en un plásmido de expresión.
La secuencia de nucleótidos del gen de xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis está disponible, así como está disponible la correspondiente secuencia de aminoácidos (EMBL número de registro AJ427921, secuencia incluída en esta memoria como referencia, Figuras 3A a B, SEC. ID nº: 6-7). La enzima tiene un peso molecular de 46.000 Da, un punto isoeléctrico de aproximadamente 9,5, una temperatura óptima de 35ºC y un pH óptimo entre 5,3 y 8. Es una auténtica xilanasa, siendo los productos principales de la reacción de hidrólisis del xilano la xilotriosa y la xilotetraosa tras incubación prolongada.
La preparación en bruto o purificada de esta xilanasa se puede obtener en primer lugar cultivando cualquier tipo natural de la cepa recombinante en un medio adecuado para expresar finalmente la enzima seguido de una o varias etapas de purificación como por ejemplo, pero sin limitarse a, centrifugación, disgregación celular, microfiltración, ultrafiltración, precipitación, cromatografía líquida, liofilización,…
A.2. Xilanasa Y de C-125 de Bacillus halodurans
La secuencia de la xilanasa Y de la familia 8 de la cepa C-125 de Bacillus halodurans (ATCCCBAA-125) está disponible como código de registro BAB05824 en el GenBank/GenPeptTM (secuencia incluida como referencia en esta memoria, Figura 4, SEC. ID nº: 8). La secuencia de ADN correspondiente está disponible como parte de la secuencia completa del genoma de la cepa C-125 de Bacillus halodurans (código de regristro AP001514, secuencia incluida como referencia en esta memoria).
La xilanasa de la cepa C-125 de Bacillus halodurans se puede obtener cultivando en primer lugar la cepa recombinante en/sobre un medio adecuado para expresar finalmente la xilanasa seguido de una o varias etapas de purificación como por ejemplo, pero sin limitarse a, centrifugación, disgregación celular, microfiltración, ultrafiltración, precipitación, cromatografía líquida, liofilización,…
Como alternativa, la xilanasa de C-125 de Bacillus halodurans se puede obtener en primer lugar clonando el correspondiente gen utilizando técnicas muy conocidas tales como la amplificación por PCR, la ligadura a un vector y la transformación en un anfitrión microbiano. Tras esta etapa, la xilanasa se puede expresar de manera ventajosa en un anfitrión adecuado colocando el gen bajo el control de las secuencias de control apropiadas tales como, pero sin restringirse al activador y terminador e insertando esta creación de ADN en una célula lo que permitiría la expresión del gen.
En una forma de realización específica de la presente invención el gen de xilanasa se sobreexpresará en dicha célula.
La presente invención, sin embargo no está restringida a las enzimas anteriores sino que se extiende a otras enzimas con actividad xilanolítica que pertenecen a la familia 8 de las glucosidasa hidrolasas. Estas enzimas son producidas por células microbianas y no microbianas vivas tales como, pero sin restringirse a, plantas o animales. Las enzimas se pueden obtener directamente a partir de cultivos de células vivas y/o de muestras, o pueden ser producidas por cepas recombinantes o células anfitrionas. El gen que codifica la enzima de interés puede ser un gen sintético.
“Cepa recombinante” o “célula anfitriona recombinante” significa una cepa que tiene incorporada la secuencia de nucleótidos de dichas enzimas con actividad xilanolítica que pertenece a la familia 8 de las glucosidasas hidrolasas.
Las células anfitrión recombinantes se seleccionan de manera ventajosa de entre el grupo constituido por el mundo microbiano, preferentemente bacterias u hongos, incluyendo levaduras y más preferentemente Bacillus.
Preferentemente, dicha cepa recombinante es capaz de sobreexpresar dicha secuencia de nucleótidos y permite de manera ventajosa una gran producción de dicha xilanasa.
Las enzimas con actividad xilanolítica producidas según la presente invención se pueden utilizar directamente para los fines de dicha presente invención y/o pueden experimentar una o más purificaciones o (además) etapas de cultivo. En una particular forma de realización de la invención, las enzimas se pueden utilizar en forma pura.
Los métodos posibles de preparación para las enzimas según la invención incluyen entre otros la preparación o purificación a partir de cultivos de microorganismos, recombinantes o no, en matraces de agitación o en fermentadores, la preparación o purificación a partir de cultivos inmovilizados, la extracción y/o purificación a partir de células vivas (plantas,…),
B. Aplicación de la enzima
La enzima con actividad xilanolítica según la presente invención, purificada o no purificada, es particularmente apropiada como agente mejorador del pan. Los agentes mejoradores del pan son productos que podrían mejorar o aumentar la textura, sabor, efectos de anti-endurecimiento, suavidad, suavidad de la miga al almacenamiento, frescura, maquinabilidad de la masa, volumen del producto final. Preferentemente dicha enzima con actividad xilanolítica mejora la manipulación de la masa y/o aumenta el volumen específico del producto final panificado. “Producto panificado” significa la inclusión de cualquier producto preparado a partir de la masa, en particular una levadura que levanta el producto panificado. La masa se obtiene con cualquier tipo harina (p. ej. basada en trigo, centeno, cebada, avena o maíz). Preferentemente la masa se prepara con trigo o con mezclas que incluyen el trigo.
Un aspecto de la presente invención consiste en demostrar que las enzimas con actividad xilanolítica que pertenecen a la familia 8 podrían utilizarse con ventajas en una fórmula mejoradora del pan.
En una forma de realización adicional de la presente invención, se demuestra que una enzima con actividad xilanolítica que pertenece a la familia 8 de las glucosido hidrolasas aumenta el volumen de la barra de un producto panificado.
En otra forma de realización de la presente invención, se demuestra que la cantidad de una enzima de la familia 8 con actividad xilanolítica necesaria para obtener un resultado determinado en la panificación es excepcionalmente menor que la cantidad generalmente utilizada cuando se trabaja con enzimas disponibles en el comercio.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al efecto aditivo de dicha enzima con actividad xilanolítica con otras enzimas, en particular con una alfa-amilasa, preferentemente una alfa-amilasa de Aspergillus oryzae. Dicha enzima con actividad xilanolítica se puede utilizar en combinación con otros agentes mejoradores del pan como, pero no limitados a, enzimas, emulsionantes, oxidantes, leche en polvo, grasas, azúcares, aminoácidos, sales, proteínas (gluten, puntos de unión a la celulosa) siendo bien conocidos dichos agentes mejoradores por los expertos en la materia. Ejemplos de enzimas son, pero no se limitan a, alfa-amilasas, beta-amilasas, amilasas maltógenas, xilanasas, proteasas, glucosa oxidasas, óxido-reductasas, glucanasas, celusasas, transglutaminasas, isomerasas, lipasas, fosfolipasas, pectinasas, etc.
La enzima con actividad xilanolítica según la presente invención se puede utilizar bajo varias formas. Las células que expresan la enzima, tales como levaduras, hongos, bacteria Archea o bacterias, se puede utilizar directamente en el proceso. Dicha enzima se puede utilizar como un extracto celular, un extracto exento de células (es decir fracciones de la célula anfitrión que se han sometido a una o más etapas de disgregación, centrifugación y/o extracción) o como proteína purificada. Cualquiera de las formas descritas anteriormente se puede utilizar en combinación con otra enzima bajo cualquiera de las formas descritas anteriormente. Dichas células, extractos celulares, extractos exentos de células o enzima se pueden mezclar con diferentes ingredientes, p. ej. en forma de polvo seco o granulado, en particular un granulado no en polvo, en forma de líquido, por ejemplo con estabilizantes tales como polioles, azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes de azúcar según los procedimientos establecidos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis
Se obtuvo la xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis como describe (Collins et al., 2002, véase anteriormente) a partir de un cultivo líquido de una cepa recombinante de Escherichia coli transformada con un vector de ADN que contiene el gen correspondiente.
Ejemplo 2: Preparación de la xilanasa de C-125 de Bacillus halodurans
Cepa bacteriana y condiciones de cultivo
Se cultivó C-125 de Bacillus halodurans (ATCC BAA-125) en medio alcalino de Bacillus (10 g/l de glucosa, 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 10 g/l de Bacto Tryptone (Difco), 1 g/l de K2HPO4, 0,2 g/l de MgSO4, 10 g/l de Na2CO3) enriquecido con 10 g/l de xilano de abedul (Sigma) durante 72 horas a 37ºC. Tras la centrifugación durante 1 h a
18.000 g y 4ºC, se concentró el sobrenadante por precipitación con sulfato de amonio al 80% y se volvió a poner en suspensión en MOPS 20 mM a pH 8,0. Esta fracción representa la fracción del extracto en bruto que se utilizará en las pruebas de panificación.
Clonación y sobreexpresión del gen Y de xilanasa
Se extrajo ADN genómico y se purificó a partir de cultivos de 16 horas, se cultivó a 37ºC en el medio alcalino de Bacillus modificado descrito anteriormente, con el kit de purificación de ADN genómico de Wizard® (Promega). Basándose en la secuencia publicada (registro AP001514 de GenBank/GenPeptTM) el gen Y completo de xilanasa se amplificó por PCR utilizando VENT polimerasa (Biolabs Inc, Beverly, MA, USA) con el cebador de la cadena transcrita 5’-GGGCATATGAAGAAAACGACAGAAGG TG-3’, SEC. ID nº: 1 que contiene una zona Nde I (subrayada) y con el cebador de la cadena complementaria 5’-GGCTCGAGCTAG TGTTCCTCTTCTTG-3’, SEQ. ID nº: 2 que contiene una zona Xho I (subrayada) y el codón de terminación (en cursivas).
Tras los 3 min de desnaturalización inicial a 95ºC, se realizaron 25 ciclos de amplificación utilizando un aparato Progenel (Techne Cambridge, Reino Unido). Cada ciclo incluía la desnaturalización a 95ºC durante 1 min, hibridación a 52ºC durante 30 s y alargamiento a 72ºC durante 1,5 min.
Se clonó el producto por PCR en un vector PCRScript Amp SK(+) (Stratagene), utilizando el procedimiento recomendado por el suministrador, y para transformar se utilizaron las células Kan ultracompetentes de Epicurian Coli XL10-Gold®. La selección azul-blanca permitió la selección de colonias blancas que llevan el fragmento de la PCR. La preparación del plásmido purificado (plásmido Nucleospin, Macherey-Nagel) se secuenció en un secuenciador de ADN de ALF (Pharmacia Biotech). Se realizó el secuenciado del fragmento insertado utilizando los cebadores universales T7 y RP así como los siguientes cebadores:
5’-GTGCGGACTGAAGGAATGTC-3’, SEC. ID nº: 3 5’- GTATGGTCCATCAACAGAGG-3’, SEC. ID nº: 4 5’- GATGGCACTAAAAACTCCTGG-3’, SEC. ID nº: 5
La secuencia obtenida fue identical a la secuencia publicada que se podía recuperar del GenBank/genPeptTM con el número de registro AP001514.
El gen Y de xilanasa se clonó por consiguiente en el PCRScript Amp SK(+) se escindió a continuación con Nde I y Xho I y se ligó al vector de clonación pET 22b(+) (Novagen). El plásmido recombinante resultante se clonó en células BL21 (DE3) de E. coli (Stratagene).
Producción de xilanasa Y de la familia 8 recombinante a partir de C-125 de Bacillus halodurans.
Se centrifugaron a 10.000 g durante 1 minuto quince ml de un precultivo de cinco horas (37ºC) de las células BL21 (DE3) de E. coli que llevan el gen de xilanasa y el sedimento se volvió a poner en suspensión en 900 ml de caldo de cultivo Terrific (12 g/l de Bacto tryptone (Difco), 24 g/l de extracto de levadura (Difco), 4 ml/l de glicerol, 12,54 g/l de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
K2HPO4, 2,31 g/l de KH2PO4) que contenía 200 µg/ml de ampicilina en un matraz de agitación de 3 litros. Se incubó el cultivo a 37ºC y 250 rpm hasta alcanzar una absorbancia a 550 nm de entre 3 y 4 con lo cual se produjo la expresión de la enzima con isopropil-1-tio-β-galactopiranosido 1 mM. Tras 15 horas más de incubación a 37ºC se recogieron las células por centrifugación a 18.000 g durante 30 minutos a 4ºC, se volvieron a poner en suspensión en BICINE 50 mM que contenía NaCl 10 mM, disgregado en un disgregador de células preenfriado (Constant Systems Ltd., Warwick, Reino Unido) a 28 Kpsi y se centrifugó a 40.000 g durante 30 minutos.
Producción de xilanasa de la familia 8 de C-125 de Bacillus halodurans recombinante.
Se recogieron por centrifugación a 10.000 g durante 1 minuto las células de un precultivo de cinco horas (37ºC) de las células BL21 (DE3) de E. coli que llevan el gen de xilanasa y se utilizaron para inocular cinco litros (15 ml de precultivo por litro de cultivo) de caldo de cultivo Terrific (12 g/l de Bacto tryptone (Difco), 24 g/l de extracto de levadura (Difco), 4 ml/l de glicerol, 12,54 g/l de K2HPO4, 2,31 g/l de KH2PO4) que contenía 200 µg/ml de ampicilina. Se incubó el cultivo a 37ºC y 250 rpm hasta alcanzar una absorbancia a 550 nm de entre 3 y 4 con lo cual se produjo la expresión de la enzima con isopropil-1-tio-β-galactopiranosido 1 mM. Tras 4 horas más de incubación a 37ºC se recogieron las células por centrifugación a 18.000 g durante 20 minutos a 4ºC, se volvieron a poner en suspensión en MOPS 20 mM (Sigma), se disgregaron en un disgregador de células preenfriado (Constant Systems Ltd.,) a 28 Kpsi y se centrifugó a 40.000 g durante 30 minutos. El ADN cromosómico se eliminó por tratamiento con sulfato de protamina al 0,2% (Calbiochem) y centrifugación a 40.000 g durante 30 minutos. Se añadieron a continuación 25 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt, Alemania) y se utilizó la solución en las pruebas de panificación.
Ejemplo 3: Efecto de la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis en la panificación de panecillos belgas duros
Se realizaron pruebas de panificación para demostrar el efecto positivo de la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis en panificación. Se evaluó el efecto positivo por el aumento en el volumen del pan comparado con una referencia que no contenía esta enzima.
Se probó la xilanasa en panecillos belgas duros que se producen a gran escala cada día en Bélgica. El procedimiento descrito es bien conocido por el panadero con experiencia y es obvio que un experto en la materia puede obtener los mismos resultados utilizando un equipo de otros proveedores.
Los ingredientes utilizados se enumeran en la Tabla 1 a continuación:
Tabla 1
Ingredientes (g)
RECETA 1 RECETA 2 RECETA 3 RECETA 4 RECETA 5
Harina (Surbi Molens van Deinze)
1500 1500 1500 1500 1500
Agua
915 915 915 915 915
Levadura fresca (Bruggeman-Bélgica)
90 90 90 90 90
Cloruro de sodio
30 30 30 30 30
Multec Data HP 20 (Beldem-Bélgica)
3,9 3,9 3,9 3,9 3,9
Ácido ascórbico
0,12 0,12 0,12 0,12 0,12
Xilanasa Pseudoalter. haloplanktis (unidades (1)/100 kg de harina)
0 25 50 100 200
(1): Una unidad de xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de azúcar reductor (expresada como xilosa) de xilano de abedul a 30ºC y pH 4,5 (procedimiento Nelson-Somogyi)
Se mezclaron los ingredientes durante 2 min a baja y 8 min alta velocidad en un mezclador Diosna SP24. La temperatura final de la masa así como las temperaturas en reposo y de prueba fueron de 25ºC. Tras el reposo durante 15 min a 25ºC, se volvió a trabajar la masa manualmente y se dejó en reposo durante otros 15 min. A continuación, se prepararon 2 kg de piezas de masa y se probaron durante 10 min. Se dividieron las piezas de masa de 2 kg y se prepararon utilizando el Eberhardt Optimat. Se obtuvieron 66 g de piezas de masa redondas. Después de otros 5 min de tiempo de reposo, se cortaron las piezas de masa por presión y se sometieron a una etapa de prueba final durante 70 min. Las piezas de masa se hornearon a 230ºC en un horno MIWE CondoTM con vapor (Michael Wenz-Arnstein-Alemania). Se midió el volumen de los 6 panecillos utilizando el procedimiento de desplazamiento de rabina utilizado normalmente.
Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 2: Tabla 2
Unidades de xilanasa
Volumen de los panecillos (ml)
0
2325
25
2675
50
2875
100
2950
200
3100
En la figura 1 se presenta una representación gráfica del efecto de la xilanasa.
5 Estos resultados demuestran que la xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis presenta un efecto positivo en el volumen del pan.
Ejemplo 4: Comparación de las cantidades de xilanasa utilizadas en panificación
10 La cantidad relativa de xilanasas necesarias para obtener el mismo efecto en el volumen en el ensayo de los panecillos belgas duros descrito en el Ejemplo 3 se ha comparado por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Las xilanasas probadas y sus respectivos niveles de utilización en panificación fueron los siguientes: 15
- la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis (30 unidades de P. haloplanktis/100 kg de harina).
-la xilanasa de Bacillus subtilis (Belase B210 BELDEM S.A., Bélgica) – 3 g/100 kg de harina.
20 Las cantidades de enzima correspondientes a la cantidad necesaria para tratar 0,333 kg y 0,166 kg de harina y que producen el mismo aumento de volumen, se cargaron en un gel prefabricado Tris-HCl al 12% para el aparato de electroforesis en SDS-poliacrilamida “Ready Gel” (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) y se introdujeron en un aparato “Mini Protean II” (BIO-RAD) según el procedimiento del fabricante. Las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie utilizando el procedimiento habitual.
25 En la figura 2 se presenta una fotografía del gel teñido.
Se puede sacar la conclusión de esta fotografía que la cantidad de xilanasa procedente de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis necesaria en la panificación es significativamente menor en comparación con la otra. 30
Ejemplo 5: Efecto de la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis en panes argentinos
Se realizaron pruebas de panificación para demostrar el efecto positivo de unas xilanasas de la familia 8 en la panificación en otra receta distinta de la utilizada en el ejemplo 3, como por ejemplo en barras argentinas. Se evaluó el 35 efecto positivo mediante el aumento en el volumen de pan en comparación con una referencia que no contiene la enzima y mediante la profundidad del corte en la superficie del pan.
Se probaron las enzimas de la invención en panes argentinos que son panes alargados típicos que necesitan tiempo de prueba prolongado (17 horas a 20ºC). El procedimiento descrito es bien conocido por el panadero con experiencia y 40 es obvio que un experto en la materia puede obtener los mismos resultados utilizando un equipo de otros proveedores.
Los ingredientes utilizados se enumeran en la Tabla 3 a continuación:
Tabla 3 45
Ingredientes (g)
RECETA 1 RECETA 2 RECETA 3 RECETA 4
Harina (Surbi Molens van Deinze)
1500 1500 1500 1500
Agua
810 810 810 810
Levadura fresca (Bruggeman-Bélgica)
5,25 5,25 5,25 5,25
Cloruro de sodio
30 30 30 30
Mejorador normal (1) (Puratos-Bélgica)
22,5 22,5 22,5 22,5
Bel’asa B2100 (Beldem – Bélgica) (210 unidades/g)
0 0,15 0 0
Xilanasa purificada de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis (unidades (2)/100 kg de harina)
0 0 25 50
5
15
25
35
45
(1): El mejorador normal utilizado contiene: alfa amilasa fúngica (Fungamyl 75.000, Novozymes), 1g/100 kg de harina, 10 g de vitamina C, Azodicarbonamida, 2 g/100 kg de harina. Este es un ejemplo de un mejorador normal. Las cantidades absolutas y relativas de aditivos pueden variar según la adaptación local a la harina de trigo y al procedimiento.
(2): Una unidad de xilanasa se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de azúcar reductor (expresada como xilosa) de xilano de abedul a 30ºC y pH 4,5 (procedimiento Nelson-Somogyi)
Se mezclaron los ingredientes durante 2 min a baja y 7 min alta velocidad en un mezclador Diosna SP24. La temperatura final de la masa durante el reposo fue de 25ºC mientras que durante la prueba fue de 20ºC. Tras el reposo durante 20 min a 25ºC, se volvió a trabajar la masa manualmente y se dejó en reposo durante 17 horas a 20ºC durante la prueba. A continuación, se prepararon 2 kg de piezas de masa y se probaron durante 10 min. Se dividieron las piezas de masa de 0,35 kg y se prepararon utilizando el Bertrand R8/L8 (30 cm) y se sometieron a una etapa de prueba final durante 17 horas. Las piezas de masa se hornearon a 210ºC durante 30 min. en un horno MIWE CondoTM con vapor (Michael Wenz-Arnstein-Alemania). Se midió el volumen de los panes argentinos utilizando el procedimiento de desplazamiento de rabina utilizado normalmente.
Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 4:
Tabla 4
Receta
Muestra Unidades de xilanasa Volumen de pan (ml) Profundidad de corte (mm)
1
0 1675 19
2
Bel’asa B210 2100 1900 27
3
TAH3a 25 1900 34
4
TAH3a 50 1925 30
Estos resultados demuestran que la xilanasa de la familia 8 presenta un efecto positivo en la preparación del pan en la prueba de larga duración a baja temperatura (es decir, 20ºC). La cantidad de enzima comercial (Bel’asa B210, véase anteriormente) utilizada aquí es 3 veces mayor que la dosis óptima requerida descrita en el ejemplo 3 para los panecillos belgas duros, mientras que la cantidad de xilanasa de la familia 8 necesaria permaneció inalterada. Existe también una diferencia entre la concentración de enzima necesaria para optimizar la profundidad del corte y la necesaria para un aumento de volumen óptimo.
Ejemplo 6: Efecto de varias enzimas de la invención frente a otras enzimas en panificación
Se realizaron pruebas de panificación para demostrar el efecto positivo de varias enzimas con actividad xilanolítica pertenecientes a la familia 8 de las glucósido hidrolasas en la panificación. Se evaluó el efecto positivo por el aumento en el volumen de pan en comparación con una referencia que no contiene estas enzimas así como con una preparación enzimática comercial (Bel’asa B210, véase anteriormente).
Se preparó y purificó la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis como se describe en el ejemplo 1. Se preparó la xilanasa Y de C-125 de Bacillus halodurans a partir de una cepa de Escherichia coli recombinante como se describe en el ejemplo 2.
El procedimiento utilizado para evaluar los rendimientos de las dos enzimas fue una mini- prueba de panificación consistente en preparar masa con 100 g de harina.
El procedimiento descrito es bien conocido por un expertos en la materia y es obvio que se pueden obtener los mismos resultados utilizando un equipo de otros proveedores.
Los ingredientes utilizados se enumeran en la Tabla 5 a continuación: Tabla 5
Ingredientes (g)
RECETA 1 RECETA 2 RECETA 3 RECETA 4 RECETA 5 RECETA 6 RECETA 7
Harina (Surbi Molens van Deinze)
100 100 100 100 100 100 100
Agua
57 57 57 57 57 57 57
Levadura fresca (Bruggeman-Bélgica)
5 5 5 5 5 5 5
Cloruro de sodio
2 2 2 2 2 2 2
Dextrosa
2 2 2 2 2 2 2
Ácido ascorbico (inidades (1)/100 kg de harina)
4 4 4 4 4 4 4
Bel’asa B2100 (Beldem – Bélgica) (unidades (1)/100 kg de harina)
0 630 1050 0 0 0 0
Xilanasa purificada de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis (unidades (1)/100 kg de harina)
0 0 0 25 50 0 0
Xilanasa recombinante de C-125 de Bacillus halodurans(unidades (1)/100 kg de harina)
0 0 0 0 0 6000 12000
(1): Una unidad de xilanasa se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de azúcar reductor 5 (expresada como xilosa) de xilano de abedul a 30ºC y pH 4,5 (procedimiento Nelson-Somogyi)
Se mezclaron los ingredientes durante 4,5 min en un mezclador National. Se pesaron 150 g de piezas de masa y se dejaron en reposo durante 20 min a 25ºC en cajas de plástico. Se volvieron a trabajar las masas y se dejaron en reposo durante otros 20 min. El tiempo de prueba final fue de 50 min a 36ºC. Las piezas de masa se hornearon a
10 continuación a 225ºC durante 20 min. Se midió el volumen de los panes utilizando el procedimiento de desplazamiento de rabina utilizado normalmente.
Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 6:
15 Tabla 6
Receta
Muestra Unidades de xilanasa/100 kg de harina Volumen de pan (ml)
1
0 650
2
Bel’asa B210 630 680
3
Bel’asa B210 1050 705
4
TAH3a 25 690
5
TAH3a 50 760
6
C-125 6000 725
7
C-125 12000 725
Estos resultados demuestran que el efecto positivo de las enzimas de la invención no está restringido a la xilanasa de TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis. Además otras preparaciones enzimáticas con actividad xilanolítica 20 que pertenecen a la familia 8 de la glucósido hidrolasa podrían mejorar las propiedades del pan (demostradas en la presente memoria para la xilanasa de C-125 de Bacillus halodurans, otros resultados no mostrados).
Listado de secuencias
25 110 PURATOS N.V. 120 Uso de enzimas de familia 8 con actividad xilanolítica durante la panificación 130 P. PURA.19/WO
30 160 8 170 PatentIn versión 3.2
210 1 211 28 212 ADN 213 Artificial
220 223 cebador sentido
400 1 gggcatatga agaaaacgac agaaggtg
28
210 2 211 26 212 ADN 213 Artificial
220 223 cebador antisentido
400 2 ggctcgagct agtgttcctc ttcttg
26
210 3 211 20 212 ADN 213 Artificial
220 223 cebador de secuenciación
400 3 gtgcggactg aaggaatgtc
20
210 4 211 20 212 ADN 213 Artificial
220 223 cebador de secuenciación
400 4 gtatggtcca tcaacagagg
20
210 5 211 21 212 ADN 213 Artificial
220 223 cebador de secuenciación
400 5 gatggcacta aaaactcctg g
21
210 6 211 1281 212 ADN 213 Pseudoalteromonas haloplanktis
220 221 otras características
223 gen de xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis (número de acceso EMBL AJ427921) 400 6
imagen1
210 7 211 426 212 PRT 213 Pseudoalteromonas haloplanktis
10 220 221 otras características 223 xilanasa de Pseudoalteromonas haloplanktis (código de acceso EMBL AJ427921)
15 400 7
imagen2
imagen2
210 8 211 388 212 PRT 213 Bacillus halodurans
5 220 221 otras características 223 xilanasa Y procedente de cepa de Bacillus halodurans C-125
(GenBank / GenPeptTM código de acceso BAB05824) 10 400 8
imagen2
imagen2

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Procedimiento para la preparación de un producto panificado, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de adición a la masa de dicho producto panificado de una composición mejorada mejoradora del pan que comprende por lo menos una enzima con actividad xilanolítica seleccionada de entre el grupo constituido por la familia 8 de las glucósido oxidasas.
  2. 2.
    Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima hidroliza con inversión de configuración.
  3. 3.
    Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la enzima es una xilanasa obtenida a partir de la cepa Pseudoalteromonas haloplanktis.
  4. 4.
    Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la cepa es la TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis y la xilanasa obtenida presenta preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 7.
  5. 5.
    Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la enzima es una xilanasa obtenida a partir de la cepa Bacillus halodurans.
  6. 6.
    Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la cepa es la C-125 de Bacillus halodurans y la xilanasa obtenida presenta preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 8.
  7. 7.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición mejoradora del pan se añade durante el mezclado de la masa.
  8. 8.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición mejoradora del pan comprende además otro agente mejorador del pan que seleccionado de entre la lista constituida por otras enzimas, emulsionantes, oxidantes, leche en polvo, grasas, azúcares, aminoácidos, sales, proteínas (gluten, puntos de unión a la celulosa) o una mezcla de los mismos.
  9. 9.
    Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la otra enzima se selecciona de entre la lista constituida por alfa-amilasas, beta-amilasas, amilasas maltógenas, otras xilanasas, proteasas, glucosa oxidasas, óxido-reductasas, glucanasas, celusasas, transglutaminasas, isomerasas, lipasas, fosfolipasas, pectinasas o una mezcla de las mismas.
  10. 10.
    Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la alfa-amilasa se obtiene preferentemente a partir de Aspergillus oryzae.
  11. 11.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima con actividad xilanolítica está presente como extracto celular, extracto exento de células o como proteína purificada.
  12. 12.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima con actividad xilanolítica se mezcla con otros ingredientes en forma de un polvo seco, de un granulado, o en forma de un líquido.
  13. 13.
    Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la enzima es mezclada con estabilizadores.
  14. 14.
    Procedimiento según la reivindicación 13, en el que los estabilizadores son seleccionados de entre el grupo constituido por polioles, azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes de azúcar.
  15. 15.
    Procedimiento para aumentar el volumen de la barra de un producto panificado, que comprende la etapa de adición durante el mezclado de la masa de dicho producto panificado de una cantidad suficiente de una enzima con actividad xilanolítica seleccionada de entre el grupo constituido por las xilanasas de la familia 8 de la glucósido hidrolasas.
  16. 16.
    Procedimiento para aumentar el volumen de la barra de un producto panificado o para aumentar la profundidad del corte en la superficie de un producto panificado, que comprende la etapa de adición durante el mezclado de la masa de dicho producto panificado de una cantidad suficiente de una enzima con actividad xilanolítica seleccionada de entre el grupo constituido por las xilanasas de la familia 8 de la glucósido hidrolasa, de una glucósido hidrolasa de la familia 8 que hidroliza con inversión de configuración y/o una combinación de las mismas.
  17. 17.
    Composición mejoradora del pan para aumentar el volumen de la barra de un producto panificado o para aumentar la profundidad de corte en la superficie de un producto panificado, caracterizada porque comprende un agente de mejora del pan y por lo menos una enzima con actividad xilanolítica seleccionada de entre el grupo constituido por la familia 8 de las glucósido hidrolasas.
  18. 18.
    Composición mejoradora del pan según la reivindicación 17, en la que la enzima hidroliza con inversión de configuración.
  19. 19.
    Composición mejoradora del pan según la reivindicación 17 ó 18, en la que la enzima es una xilanasa obtenida a partir de la cepa Pseudoalteromonas haloplanktis.
    5 20. Composición mejoradora del pan según la reivindicación 19, en la que la cepa es TAH3a de Pseudoalteromonas haloplanktis y la xilanasa obtenida presenta preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 7.
  20. 21. Composición mejoradora del pan según la reivindicación 17 ó 18, en la que la enzima es una xilanasa obtenida a
    partir de la cepa Bacillus halodurans. 10
  21. 22. Composición mejoradora del pan según la reivindicación 21, en la que la cepa es C-125 de Bacillus halodurans y la xilanasa obtenida presenta preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 8.
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