WO2020213604A1 - 新規βアミラーゼ及びその利用・製造法 - Google Patents

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dna
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順一 炭谷
修治 谷
川口　剛司
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Definitions

  • the present invention relates to a novel ⁇ -amylase and a method for using and producing the novel ⁇ -amylase.
  • Starch is an important nutrient source for living organisms, and like cellulose, it is one of the many polysaccharides on the earth.
  • the structure of starch is composed of amylose in which glucose is linearly polymerized with ⁇ -1,4 bonds and amylopectin in which amylose is branched by ⁇ -1,6 bonds.
  • amylose When natural starch is suspended in water and heated, each molecule of amylose and amylopectin is dispersed to form a starch solution or starch paste.
  • starch having a natural crystal / grain structure is called raw starch. The crystal structure of raw starch is destroyed by heating and hydration.
  • Amylase is a general term for enzymes that hydrolyze the ⁇ -1,4 and ⁇ -1,6 bonds of amylose and amylopectin in this starch.
  • Amylase can be roughly classified into two types, endo-type amylase and exo-type amylase, depending on the mode of action.
  • ⁇ -Amylase is known as endoamylase and is an enzyme that randomly hydrolyzes the glucose chain of starch.
  • ⁇ -amylase is known as exo-type amylase, and is an enzyme in which glucose such as starch and glycogen acts on polysaccharides polymerized by ⁇ -1,4 bonds to decompose maltose (maltose) units from non-reducing ends.
  • ⁇ -amylase is used in maltose production and food processing due to its ability to produce maltose from starch.
  • Beta-amylase was found in sweet potatoes, wheat, barley, soybeans, etc., and has become known as an enzyme widely distributed in higher plants.
  • microbial-derived ⁇ -amylase does not exist for a long time, but ⁇ -amylase possessed by microorganisms has been discovered one after another since the 1970s (Non-Patent Document 1).
  • Microbial-derived ⁇ -amylase has been discovered one after another, but few have been put into practical use. This is because ⁇ -amylase derived from microorganisms reported so far has low heat resistance and production amount, and many of the producing bacteria are classified as pathogens and are not suitable for food use. Amano Enzyme Co., Ltd. barely sells ⁇ -amylase derived from Bacillus flexus as an industrial enzyme (Patent Document 1, Non-Patent Document 2). Although this ⁇ -amylase derived from Bacillus flexus has relatively high heat resistance compared to ⁇ -amylase derived from other microorganisms, it has lower heat resistance than soybean-derived enzyme, which has the highest heat resistance derived from plants, and has sufficient heat resistance.
  • soybean-derived enzymes having excellent heat resistance also have low decomposition activity on raw starch.
  • starch is industrially enzymatically decomposed with amylase, the starch is heated once, but from the viewpoint of energy saving in recent years, the raw starch is directly enzymatically reacted with high efficiency without heat gelatinization. It is hoped that it can be done.
  • the present invention thus provides the bacterium identified by accession number NITE BP-02937.
  • the present invention also provides ⁇ -amylase produced by the bacterium identified by accession number NITE BP-02937.
  • the present invention (i) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12 or (ii) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12, the amino acid sequence in which one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and / or added. (iii) Provided is ⁇ -amylase consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12.
  • the threonine at the position corresponding to the amino acid number 4 is replaced with proline, or the threonine at the position corresponding to the amino acid number 15 is lysine or Provided is a ⁇ -amylase containing one or more substitutions selected from substitutions that change to arginine, or substitutions in which glutamine at the position corresponding to amino acid number 306 changes to aspartic acid.
  • the present invention (i) The amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 18 to 25 or (ii) In the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 18 to 25, one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and / or added. (iii) Provided is ⁇ -amylase consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 18 to 25.
  • the present invention provides DNA encoding the above-mentioned ⁇ -amylase. Furthermore, the present invention is a DNA encoding a protein having ⁇ -amylase activity, wherein the DNA is (i) Nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13 (ii) Nucleotide sequence 90% or more identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13 (iii) (i) or (ii) Provided is a DNA that hybridizes with the DNA represented by the base sequence represented by (1) under stringent conditions.
  • the present invention is a DNA encoding a protein having ⁇ -amylase activity, wherein the DNA is (i) The nucleotide sequence according to any one of SEQ ID NO: 26 to SEQ ID NO: 33 or (ii) DNA having any one of the base sequences having 90% or more sequence identity with the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 26 to 33, or (iii) Provided is a DNA that hybridizes with the DNA represented by the base sequence represented by (i) or (ii) under stringent conditions. Furthermore, the present invention provides DNA consisting of degenerate sequences of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NOs: 26 to 33.
  • the present invention provides a vector having the above DNA. Furthermore, the present invention provides a microorganism having a vector having the above DNA. Furthermore, the present invention provides a method for producing ⁇ -amylase, which comprises a step of extracting ⁇ -amylase from a culture of the above-mentioned bacteria or the above-mentioned microorganisms. Furthermore, the present invention provides a method for producing maltose, which comprises treating starch with the above-mentioned ⁇ -amylase. Furthermore, the present invention provides a method for producing maltose, which comprises treating starch with the above-mentioned bacteria or the above-mentioned microorganisms.
  • the present invention provides a method for producing maltose, which comprises treating raw starch with the above-mentioned ⁇ -amylase. Furthermore, the present invention provides a method for modifying foods using the above-mentioned bacteria, the above-mentioned ⁇ -amylase, or the above-mentioned microorganisms. Furthermore, the present invention provides an enzymatic agent using the above-mentioned bacteria, the above-mentioned ⁇ -amylase, or the above-mentioned microorganisms.
  • a novel ⁇ -amylase having no pathogenicity is provided.
  • the enzyme according to the present invention is ⁇ -amylase, which is an enzyme that decomposes ⁇ -1,4 glucoside bonds in glucose polysaccharides in starch in maltose units from non-reducing ends.
  • the ⁇ -amylase produced by the No. 58 strain has the following properties. (1)
  • the substrate for ⁇ -amylase of the present invention is not limited to starch.
  • the ⁇ -amylase of the present invention can react with, for example, amylose, amylopectin, glycogen, and dextrin.
  • the molecular weight of this enzyme is about 60,000 Da.
  • the optimum temperature of this enzyme is about 50 ° C. This enzyme exhibits 70% or more of the activity at 50 ° C.
  • the optimum pH of this enzyme is about 7.0. This enzyme shows a residual activity of 80% or more compared with the activity of pH 7.0 under the condition of reacting with the substrate at pH 6.0 to 9.0 and 37 ° C. for 10 minutes.
  • ⁇ -amylase of the present invention one to several amino acid residues are deleted or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12.
  • the inserted and / or added amino acid sequence, or ⁇ -amylase consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12.
  • the amino acid sequence identity is preferably 95%, more preferably 99% or more.
  • the ⁇ -amylase of the present invention may be in the form of a fusion protein added to another protein as long as it has ⁇ -amylase activity, and is immobilized on a resin such as beads. It may be in shape.
  • the fusion protein include proteins bound to debranching enzyme, isoamylase, plulanase, glucosidase, glucoamylase, ⁇ -amylase, protease, lipase, phosphatase, xylanase, etc., histidine (His) tag for purification, and maltose-binding protein.
  • the form of a protein in which the (MBP) tag and glutathione S-transferase (GST) are fused is considered.
  • the substitution is preferably a conservative substitution.
  • Conservative substitution refers to a substitution in which the properties such as acidity and basicity of the replaced amino acid do not change. Specifically, substitution between Phe, Trp, Tyr, substitution between Leu, Ile, Val, substitution between Lys, Arg, His, substitution between Asp, Glu, substitution between Ser, Thr. Point to.
  • deletions at the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence, if the enzyme activity is equivalent to that of ⁇ -amylase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the N-terminal and / or C of the amino acid sequence Not limited to the number of amino acids deleted at the terminus, such deletions can be easily obtained without trial and error.
  • the term "1 to several" as used herein means, for example, 1 to 9, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, and more. The number may be preferably between 1 and 3, or more preferably between 1 and 2.
  • the substitution site is a substitution in which the threonine at amino acid number 4 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is changed to proline (SEQ ID NO: 18), or a substitution in which the threonine at amino acid number 15 is changed to lysine (SEQ ID NO: 19).
  • Amino acid number 33 is changed to proline (SEQ ID NO: 22), or amino acid number 44 is changed to lysine (SEQ ID NO: 23), or amino acid number 44 is changed to arginine (sequence). If one or more of the substitutions (SEQ ID NO: 25) in which glutamine at amino acid number 335 is changed to aspartic acid is selected, ⁇ -amylase having further excellent heat resistance can be obtained. Further, the ⁇ -amylase of the present invention is one to several in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 18 to 25 or the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 18 to 25.
  • the amino acid sequence identity is preferably 95%, more preferably 99% or more.
  • the same in the present invention is calculated as the ratio (percentage) of matching bases or amino acids at the corresponding positions between the two sequences when the two sequences to be compared are aligned so as to be the maximum match.
  • Analysis of amino acid sequences or comparison of the identity of two or more amino acid sequences can be performed using an analysis program commonly used by those skilled in the art. For example, GENETYX-WIN Ver.
  • NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
  • BLAST search can be used for amino acid sequence identity search. .. Similar to the amino acid sequence, the base sequence can be analyzed and searched by an analysis program generally used by those skilled in the art.
  • the enzyme activity measurement according to the amylase of the present invention is not particularly limited as long as it is a method in which the enzyme decomposes the substrate and the saccharides produced by the decomposition can be quantitatively measured.
  • it can be measured by using a reducing sugar quantification method such as the Somogie-Nelson method.
  • the enzyme reaction product of amylase of the present invention may be detected by using a qualitative detection method when the purpose is only to detect the contained sugar, in addition to the quantitative detection method as described above. This is not particularly limited as long as the saccharides contained in the analysis target can be identified, but for example, a detection method using thin layer chromatography (TLC) can be considered.
  • TLC thin layer chromatography
  • the ⁇ -amylase of the present invention may have at least 80% activity as compared with the unheat-treated ⁇ -amylase even if the ⁇ -amylase is heat-treated at 60 ° C. for 10 minutes. Further, the enzyme may be heat-treated at 60 ° C. for 20, 40, 80 minutes and may have at least 80% activity as compared with unheat-treated ⁇ -amylase.
  • the ⁇ -amylase of the present invention may have a raw starch degrading activity.
  • the raw starch in the present invention is starch that has not been heat-treated. Unlike heat-gelatinized starch, raw starch has a crystal / grain structure. The crystal structure of raw starch is destroyed by heating and hydration.
  • the heating temperature varies depending on the type of raw starch, but for example, starch derived from wheat or corn has a high gelatinization temperature, and the gelatinization temperature needs to be heated to 80 ° C. or higher.
  • Starch which is the substrate of the enzyme, can be used for example, soybeans, red beans, barley, wheat, corn, rice, potatoes, sweet potatoes, kudzu, warabi, mung beans, soramame, lotus root, cassava, sago palm, katakuri, etc. Can be used.
  • Bacillus halosacchalovorans No. 58 (sometimes referred to simply as "No. 58 strain” in the present specification), which is a bacterium entrusted with the accession number NITE BP-02937.
  • the No. 58 strain is an aerobic bacterium, which has a rod-like cell morphology and is characterized by forming cream-colored colonies and forming spores. Since this strain is a non-pathogenic strain, it can be suitably used for foods and the like.
  • the ⁇ -amylase having the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 according to the present invention is an enzyme obtained from the No. 58 strain.
  • the No. 58 strain has the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and ⁇ -amylase, which is a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the ⁇ -amylase of the present invention cultivates a bacterium having a DNA represented by SEQ ID NO: 1, such as strain No. 58, or a recombinant having a vector containing the sequence or incorporating the sequence.
  • a bacterium having a DNA represented by SEQ ID NO: 1 such as strain No. 58
  • a recombinant having a vector containing the sequence or incorporating the sequence can be obtained by Culturing of No. 58 strain or recombinant can be carried out by a method generally performed by those skilled in the art in amylase production.
  • the host microorganism can also be one commonly used by those skilled in the art.
  • the host microorganism is not particularly limited, and for example, non-pathogenic Escherichia coli, yeast, actinomycetes, algae, lactic acid bacteria, Bacillus subtilis and the like can be used.
  • the culture conditions can be appropriately adjusted according to the host and expression system.
  • the medium is not particularly limited as long as the culture target can grow.
  • the medium may be solid or liquid, but is preferably liquid.
  • the ⁇ -amylase gene is inserted into a vector for E. coli expression to transform E. coli.
  • the obtained transformants were inoculated into 2 ml of 2 ⁇ TY medium containing antibiotics as needed, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours to obtain bacterial cells.
  • ⁇ -amylase can be obtained in the crushed solution by sonication.
  • the solid medium for example, fruit residues such as bananas, apples and oranges, beans such as soybeans, and biomass derived from plant resources such as pomace of vegetable oil can be considered.
  • the culture is a mixture containing a substrate, a reaction product thereof, and cultured bacterial cells, which are cultured by adding a microorganism to a culture substrate.
  • Cultures include, but are not limited to, cultured microorganisms (inoculated microorganisms and microorganisms grown from the microorganisms), media, medium supplements / additives, and substances secreted from the cultured microorganisms.
  • the culture may be liquid or solid in whole or in part. If the culture is liquid, it is also called a culture solution.
  • the culture preferably comprises at least one of the culture microorganisms and secretions from the culture microorganisms.
  • the culture is preferably a culture medium.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned ⁇ -amylase. Further, the DNA of the present invention is a DNA encoding a protein having ⁇ -amylase activity, and the DNA is (i) Nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13. (ii) DNA having either 90% or more of the same base sequence as the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13, or It may be a DNA that hybridizes with the DNA represented by the base sequence represented by (i) or (ii) under stringent conditions. The term "identical" with respect to the base sequence is as described above.
  • Stringent conditions are generally known by those skilled in the art, for example, in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (Takara Bio), using conditions that hybridize at 68 ° C or using a DNA-fixed filter. After hybridization at about 65 ° C. in the presence of 0.7M to 1.0M NaCl, 0.1 to 2 times the concentration of SSC solution (1 ⁇ SSC solution: 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0). Conditions such as washing at about 65 ° C. using The base sequence preferably has 95% or more, more preferably 99% or more, the same base sequence as the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13.
  • substitution sites of the DNA sequence are, for example, a substitution in which the 97th adenine base of SEQ ID NO: 1 is changed to cytosine (SEQ ID NO: 26), a substitution in which the 131st cytosine base of SEQ ID NO: 1 is changed to an adenine base (SEQ ID NO: 27), and a sequence.
  • SEQ ID NO: 1 is replaced with a cytosine base
  • the 131st cytosine base is replaced with a guanine base
  • the 132nd adenine base is replaced with a cytosine base (SEQ ID NO: 28)
  • the 1003th cytosine base of SEQ ID NO: 1 is Substitution of guanine base with 1005th adenine base changed to cytosine base (SEQ ID NO: 29), or substitution of 10th adenine base of SEQ ID NO: 13 with cytosine (SEQ ID NO: 30), 44th cytosine of SEQ ID NO: 13
  • substitution in which the base is changed to an adenine base (SEQ ID NO: 31)
  • the 43rd adenine base in SEQ ID NO: 13 is changed to a cytosine base
  • the 44th sitosine base is changed to a guanine base
  • the 45th adenine base is changed to a cytosine base (
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding a protein having ⁇ -amylase activity
  • the DNA is (i) The base sequence according to any one of SEQ ID NO: 26 to SEQ ID NO: 33, (ii) It has any of the base sequences having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more sequence identity with the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 26 to 33.
  • DNA, or (iii) It may be a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the base sequence represented by (i) or (ii) under stringent conditions.
  • the DNA of the present invention may be a DNA consisting of a degenerate sequence of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NOs: 26 to 33.
  • degeneration means that there are a plurality of types of codons encoding one amino acid. Therefore, in the degenerate sequence, for example, when one amino acid in the degenerate sequence is arginine, the base sequence has six codons encoding arginine (CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG). It may be an array corresponding to any of the above.
  • the DNA of the present invention can be handled by using a method of genetic engineering generally performed by those skilled in the art.
  • the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be obtained by PCR treatment using the corresponding primer, or may be obtained by total synthesis based on the sequence information.
  • the DNA of the present invention is also provided in the form of a vector having the DNA of the present invention.
  • the vector is generally used by those skilled in the art and is not limited as long as it can satisfy the purpose of incorporating this gene, but for example, pBluescript II SK (+) vector and pBluescript II SK (-) vector can be used.
  • the present invention provides a microorganism having a vector having the DNA of the present invention.
  • the host microorganism is not particularly limited as long as it is generally used as a vector carrier by those skilled in the art, and for example, non-pathogenic Escherichia coli, yeast, actinomycetes, algae, lactic acid bacteria, Bacillus subtilis and the like can be used. ..
  • the present invention also provides a method for producing ⁇ -amylase.
  • the ⁇ -amylase of the present invention may be obtained by isolating from a culture solution of a microorganism containing ⁇ -amylase.
  • the isolation method can be carried out by a method generally used by those skilled in the art.
  • the production method includes a step of culturing the cells and a step of extracting ⁇ -amylase from the culture or the cultured cells.
  • the step of culturing the cells is to cultivate the No. 58 strain or a recombinant microorganism containing the DNA of the present invention.
  • the host to be a recombinant is not particularly limited as long as it can be cultured and expresses a protein, and for example, non-pathogenic Escherichia coli, yeast, actinomycetes, algae, lactic acid bacteria, Bacillus subtilis and the like can be used.
  • the culture conditions can be appropriately adjusted according to the host and expression system.
  • the medium is not particularly limited as long as the culture target can grow.
  • the medium may be solid or liquid, but is preferably liquid.
  • the culturing method is not particularly limited as long as the culturing target can grow. For example, static culture, shaking culture, anaerobic culture and the like can be used. For example, when using No. 58 strain, the following conditions can be mentioned.
  • Examples of the medium used include liquid medium for amylase-producing bacteria, 2 ⁇ TY medium (listed in Tables 1 and 2 of Examples), LB medium, and Nutrient Agar medium (Difco).
  • the pH of the medium is preferably 6.0 to 9.0, more preferably pH 7.0.
  • the culture temperature is preferably 20 to 50 ° C, more preferably 45 ° C. Under aerobic conditions, it can be cultured in static culture, shaking culture or rotary culture.
  • ⁇ -amylase can be obtained by purification from the culture or cultured cells containing ⁇ -amylase in the purification step.
  • the method for purifying the enzyme is not particularly limited as long as ⁇ -amylase can be obtained from the culture or cultured cells, but for example, after the culture supernatant is subjected to centrifugation or filter filtration to remove the cells and solids.
  • This enzyme can be purified by combining filtration or concentration with an ultrafiltration filter, salting out, chromatography with a column, adsorption with activated charcoal, and the like.
  • the column to be used is not particularly limited as long as it can be separated from other proteins and impurities without inactivating the enzyme, but it is not particularly limited, but it is an anion exchange chromatography column, a cation exchange chromatography column, and a hydrophobic interaction.
  • examples thereof include a column for chromatography, a column for gel filtration chromatography, and an affinity chromatography column.
  • a TOYOPEARL Butyl-650M column for hydrophobic interaction chromatography and a TOYOPEARL DEAE-650M column for anion exchange chromatography are used.
  • the crude purification or detection of the purified protein can be carried out by a method without particular limitation as long as the protein contained in the sample can be separated and detected.
  • the buffer solution used for enzyme activity measurement, enzyme purification, etc., which will be described later, can be appropriately changed and used according to the purpose of the experiment.
  • the buffer solution preferably has properties that do not affect the activity or stability of the enzyme.
  • Tris-HCl can be used as the buffer solution.
  • the method for producing ⁇ -amylase of the present invention further includes a step of extracting ⁇ -amylase from the cultured bacterial cell.
  • the method for extracting ⁇ -amylase from cultured cells is not particularly limited, and may be any method known to those skilled in the art.
  • ⁇ -amylase can be obtained by, for example, destroying a part or the whole of a cell surface structure (for example, a cell membrane) by solubilizing cells (ultrasonic disruption).
  • the bacterial cells used for extraction may be live or dead. Since the ⁇ -amylase of the present invention produces only maltose from starch, the method for producing ⁇ -amylase of the present invention facilitates the production of maltose.
  • the present invention also provides a method for producing maltose, which comprises treating starch with the ⁇ -amylase of the present invention. Since the enzyme treatment of starch is generally performed on starch gelatinized by heating raw starch, the step of saccharification is performed before the enzyme treatment. The heating temperature varies depending on the type of raw starch, but starch derived from wheat or corn has a high gelatinization temperature. At this time, if ⁇ -amylase having low heat resistance is used, the enzyme is inactivated by the heat of the heated starch, so that it is necessary to cool the heat-gelatinized starch to a temperature suitable for the enzyme reaction.
  • the cooling cost of the heated starch is incurred during the saccharification treatment of starch, and the cooling time is also incurred.
  • the cooling cost of starch can be reduced and / or the cooling time can be shortened, so that it can be suitably used for saccharification treatment of starch. Due to the high heat resistance of this ⁇ -amylase, it can be added to starch after heat treatment, or even to starch during heat treatment.
  • the temperature and pH after the addition of ⁇ -amylase are not particularly limited as long as the enzyme can decompose starch as described in the above enzyme properties, but the ⁇ -amylase of the present invention has a starch temperature of 70 ° C. or lower as a substrate. It can be added at the temperature of 60 ° C or higher and 70 ° C or lower.
  • Starch which is the substrate of the enzyme, can be used for example, soybeans, red beans, barley, wheat, corn, rice, potatoes, sweet potatoes, kudzu, warabi, mung beans, soramame, lotus root, cassava, sago palm, katakuri, etc. Can be used.
  • the enzyme reaction can be stopped by inactivating the enzyme by chemical treatment such as reheating or pH adjustment.
  • Maltose can be produced from starch by the ⁇ -amylase of the present invention. Since the ⁇ -amylase of the present invention produces only maltose from starch, the present invention facilitates the production of maltose.
  • the present invention also provides a method for producing maltose, which comprises treating starch with the microorganism of the present invention.
  • ⁇ -amylase is released from the cells as an extracellular enzyme into the culture medium. Therefore, when the No. 58 strain is cultured with starch, ⁇ -amylase is released to the outside of the cells, and the released ⁇ -amylase reacts with starch to form maltose.
  • the cells to be cultured are not limited to the No. 58 strain, and a recombinant microorganism having the No. 58 strain of ⁇ -amylase may be used.
  • the culture conditions at this time are not particularly limited as long as the microorganisms to be cultured can be cultured, and substances other than starch necessary for growth may be contained. Even if the microorganism does not release ⁇ -amylase to the outside of the cell, if starch is taken into the cell, starch is converted to maltose by ⁇ -amylase in the cell, and maltose is released to the outside of the cell.
  • the recombinant microorganism used is not limited to a microorganism capable of releasing ⁇ -amylase as an extracellular enzyme, but a microorganism in which ⁇ -amylase is released outside the cell is preferable.
  • Maltose can be produced from starch by the microorganism having ⁇ -amylase of the present invention. Since the microorganism having ⁇ -amylase of the present invention produces only maltose from starch, the production of maltose becomes easy.
  • the present invention also provides a method for producing maltose, which comprises treating raw starch with the ⁇ -amylase of the present invention.
  • Conventional ⁇ -amylase has low activity on raw starch and is not suitable for using raw starch as a substrate as it is. Since the ⁇ -amylase of the present invention has high enzymatic activity on raw starch, it can be suitably used for enzyme treatment of raw starch.
  • the state of the raw starch is not particularly limited as long as it can react with the enzyme, but it is preferably in a state of being suspended in an aqueous solution.
  • the temperature and pH after the addition of ⁇ -amylase are not particularly limited as long as the enzyme can decompose starch as described in the above enzyme properties.
  • Starch which is the substrate of the enzyme, can be used for example, soybeans, red beans, barley, wheat, corn, rice, potatoes, sweet potatoes, kudzu, warabi, mung beans, soramame, lotus root, cassava, sago palm, katakuri, etc. Can be used.
  • the enzyme reaction can be stopped by inactivating the enzyme by chemical treatment such as heating or pH adjustment.
  • the ⁇ -amylase of the present invention can produce maltose from raw starch.
  • the present invention also provides a method for modifying a food using the ⁇ -amylase of the present invention or the microorganism of the present invention.
  • Food reforming refers to changing the properties of food. In the present invention, it refers to making the property of a food containing a polysaccharide having an ⁇ -1,4 glucoside bond such as starch into a preferable form.
  • a polysaccharide having an ⁇ -1,4 glucoside bond such as starch
  • the enzyme of the present invention into bread dough before baking, the texture of bread dough is improved, the bread volume is increased, the aging of bread products is prevented (maintenance of softness), and the baking color of bread dough stored frozen or refrigerated. There are measures such as prevention of redness and maintenance of softness of mochi.
  • the food that can be used is not particularly limited, but is preferably a food containing a polysaccharide having an ⁇ -1,4 glucoside bond such as starch.
  • a polysaccharide having an ⁇ -1,4 glucoside bond such as starch.
  • dough such as bread, rice cake, donut, pie, pizza, and bun.
  • the raw materials are not limited to wheat-derived raw materials, but soybeans, red beans, barley, corn, rice (rice), potatoes, sweet potatoes, kudzu, warabi, mung beans, soramame, lotus root, cassava, sago palm, katakuri, etc. can be used. ..
  • the ⁇ -amylase according to the present invention has heat resistance and activity on raw starch, it can be preferably used for food modification operations.
  • strain No. 58 since strain No. 58 has only ⁇ -amylase as an extracellular enzyme, it does not cause excessive starch decomposition or Maillard reaction that occurs when ⁇ -amylase or glucoamylase is used for bread dough. Therefore, strain No. 58 is extremely useful as a source of purified ⁇ -amylase used for these strains.
  • the product is only maltose, it has an advantage that the finished food can have a mellow taste.
  • the heat resistance of this enzyme also has the advantage that the reaction of the substrate can be easily controlled.
  • the optimum pH for this enzyme is neutral 7 Due to its proximity, a pH regulator may not be needed. Since the activity of this enzyme on raw starch can act on ungelatinized starch, it can be used in a wide range of starch products and substrates containing starch.
  • this enzyme has excellent heat resistance, it does not have enzyme activity even at a high temperature of 80 ° C or higher, and the enzyme activity is lost at a high temperature of 80 ° C or higher. Due to this property, when the enzyme is kneaded into bread dough or the like and baked, the enzyme activity can be lost in the baking process. This makes it easy to make preparations such that the enzyme is reacted with the substrate only for the time when the enzyme is desired to react, such as from the beginning to the middle of firing, and finally the enzyme activity is lost.
  • the present invention is also provided in the form of ⁇ -amylase of the present invention or an enzyme preparation containing the microorganism of the present invention.
  • the present enzyme in the enzyme preparation may be a purified enzyme or a crude enzyme stage such as a culture supernatant.
  • the enzyme preparation may be composed of ⁇ -amylase alone, or may be appropriately blended with additives as long as the enzymatic properties are not significantly impaired. Examples of the form of the enzyme preparation include tablets, pills, powders, granules, capsules, and liquids.
  • the enzyme preparation may be encapsulated in a sprayer such as a spray, and may contain an enzyme in addition to amylase.
  • Examples of the enzyme contained together with this enzyme include debranching enzyme, isoamylase, pullulanase, glucosidase, glucoamylase, ⁇ -amylase, protease, lipase, phosphatase, xylanase, etc., and even if one or more of these enzymes are used in combination. Good.
  • Additives include, for example, binders (rubber arabic, gelatin, sorbitol, tragant, polyvinylpyrrolidone, etc.), fillers (lactose, sugar, calcium phosphate, sorbitol, glycine, etc.), disintegrants (crystalline cellulose, etc.), non-aqueous additives.
  • binders rubber arabic, gelatin, sorbitol, tragant, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • fillers lactose, sugar, calcium phosphate, sorbitol, glycine, etc.
  • disintegrants crystalline cellulose, etc.
  • Shapes (almond oil, fractionated coconut oil or oily esters such as glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, ethyl alcohol, etc.), preservatives (methyl or propyl p-hydroxybenzoate, sorbitol, tocopherol, etc.), pH adjustment Agents (sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, citrate, acetate, etc.), thickeners (methylcellulose, etc.), antioxidants (vitamin C, vitamin E, etc.), fragrances (synthetic fragrances, natural fragrances, esters, etc.) , Emulsifiers (lecithin, sorbitol monooleate, sucrose fatty acid esters, etc.), swelling agents (ammonium carbonate, etc.), suspending agents (syrup, gelatin, water-added edible fat, etc.) and the like.
  • pH adjustment Agents sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, citrate, acetate, etc.
  • thickeners methylcellulose, etc.
  • This enzyme preparation can be widely used in applications such as starch and other polysaccharides having an ⁇ -1,4 glucosidic bond decomposed in maltose units to produce maltose, and in food modification applications. For example, adding an enzyme agent to dough such as bread, rice cake, donut, pie, pizza, and bun. In addition, it is added to grains such as wheat, soybeans, red beans, barley, corn, rice (rice), potatoes, sweet potatoes, kudzu, warabi, mung beans, soramame, lotus roots, cassava, sago palm, and katakuri that have starch, and their crushed products. can do. Pretreatment such as crushing, heating, or chemical treatment may be performed before the addition of the enzyme preparation. The treatment conditions after the addition of the enzyme preparation can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • Experiment 1 Screening and identification of bacteria having thermostable ⁇ -amylase ⁇ -amylase-producing heat-resistant bacteria were isolated and isolated from soil samples.
  • the soil of the screening source was obtained from the soil in Osaka Prefecture.
  • a starch assimilating strain was isolated from this soil.
  • the isolated strain was cultured in a medium for amylase-producing bacteria (Table 1).
  • the basic pH was 7.0, and the medium composition and pH were changed according to the experiment.
  • 1.0% gellan gum was added in addition to the above composition, and the mixture was solidified on a plate before use.
  • the isolated starch assimilating strain was inoculated into a test tube containing 6 ml of a liquid medium for amylase-producing bacteria, and cultured at 60 ° C. for 3 days with shaking. After completion of the culture, the culture supernatant was collected by centrifuging the culture solution (3200 rpm, 10 minutes, 4 ° C), and this was used as a crude enzyme sample. To 100 ⁇ l of this crude enzyme sample, 100 ⁇ l of a substrate solution (1.5% soluble starch (manufactured by Merck & Co., Inc.), 100 mM pH7.0Tris-HCl, 5 mM CaCl 2 ) was added, and the mixture was reacted overnight at 37 ° C. After the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to thin layer chromatography.
  • a substrate solution (1.5% soluble starch (manufactured by Merck & Co., Inc.)
  • 100 mM pH7.0Tris-HCl 5 mM Ca
  • TLC Thin Layer Chromatography
  • Silica gel 60 F254 (manufactured by Merck & Co., Inc.) was used as the silica gel plate used for thin layer chromatography.
  • the developing solvent used was 1-butanol / ethanol / chloroform / 25% (w / w) ammonia solution: (4/5/2/8, v / v / v / v).
  • Maltose was detected by spraying the detection solution (concentrated sulfuric acid containing 1% vanillin) on the silica gel plate after development three times and heating at 120 ° C. for several minutes to develop color.
  • Amylase activity measurement 100 ⁇ l of an enzyme sample (culture supernatant or crude or purified enzyme described below) was placed in a test tube and pre-incubated at 37 ° C. for 10 minutes. 100 ⁇ l of substrate solution (1.5% soluble starch, 100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl 2 , pH 7.0, 37 ° C) was added and reacted at 37 ° C for 10 minutes. The enzyme reaction was stopped by adding 400 ⁇ l of DNS solution (0.5% dinitrosalicylic acid, 0.4N NaOH, 30% potassium sodium tartrate tetrahydrate). Then, the mixed solution was boiled at 100 ° C.
  • substrate solution 1.5% soluble starch, 100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl 2 , pH 7.0, 37 ° C
  • the enzyme reaction was stopped by adding 400 ⁇ l of DNS solution (0.5% dinitrosalicylic acid, 0.4N NaOH, 30% potassium sodium tartrate tetrahydrate). Then, the
  • the temperature stability of the amylase of the acquired No. 58 strain was evaluated.
  • the obtained No. 58 strain was cultured, and the culture supernatant was collected and used as a culture supernatant sample.
  • a moderately diluted culture supernatant sample was placed in a microtube, kept warm at 60 ° C., sampled after 10, 20, 40, and 80 minutes, and cooled on ice.
  • the residual enzyme activity of the sample after cooling was measured by quantifying the amount of reducing sugar produced, and the temperature stability of the obtained amylase at 60 ° C. was evaluated.
  • TMK-672 strain (TBA strain) was treated in the same manner, and the obtained sample was used. The result is shown in FIG. The data is shown as a relative value with the value of 0 minutes of processing time as 100%. No. 58 in FIG. 2 represents the strain of the present invention, and TBA represents the comparison target. Furthermore, it was confirmed whether the obtained amylase was ⁇ -amylase by determining the relationship between the amount of reducing sugar produced and the relative KI / I 2 value.
  • the relative KI / I 2 value was calculated as follows. Take 200 ⁇ l of the enzyme solution in a test tube, pre-incubate at 37 ° C for 10 minutes, add 400 ⁇ l of the same pre-incubated substrate solution, react at 37 ° C for 10 minutes, and 1 ml of the reaction terminator (0.5N acetic acid and 0.5N). The reaction was stopped by adding (a mixture of HCl in a ratio of 5: 1). After the reaction was stopped, 200 ⁇ l of the reaction solution was placed in another test tube, 5 ml of iodine solution (0.005% I 2 , 0.05% KI) was added, and after 20 minutes, absorption at 660 nm was measured with a spectrophotometer.
  • the relative KI / I 2 value when the amount of reducing sugar was 0 was set to 100%.
  • the concentration of the sample to be measured was appropriately changed, and this value was plotted against the value obtained by the above-mentioned reducing sugar quantification method.
  • ⁇ -amylase derived from human saliva as a positive control of ⁇ -amylase
  • ⁇ -amylase derived from TMK-672 strain as a positive control of ⁇ -amylase
  • the pH was adjusted to 7.0.
  • ampicillin with a composition of 100 ⁇ g / ml was added to the medium.
  • a 10% SDS solution was added to the Solution I solution containing the cultured cells so that the final concentration was 0.5%, and the mixture was shaken for 10 minutes. Further, a 5M NaCl solution was added to this mixed solution so that the final concentration of NaCl was 0.7M or more, and the mixture was shaken for 10 minutes. Then, phenol / chloroform extraction was performed, and the obtained phenol / chloroform-added solution was centrifuged (13,500 rpm, 10 minutes, 4 ° C.) to separate into an aqueous layer and an oil layer, and the aqueous layer was recovered.
  • the 16S rRNA gene was amplified by PCR.
  • the template is the extracted chromosomal DNA, and the primer is the forward primer (5'-AGRTTTGATYHTGGYTCAG 3': SEQ ID NO: 3) designed based on the highly conserved region of the bacterial 16S rRNA gene.
  • a reverse primer (5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAG -3': SEQ ID NO: 4) was used.
  • the 16S rRNA region was amplified by PCR using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio), and the temperature cycle was 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, and 72 ° C for 90 seconds for 30 cycles.
  • the obtained PCR product was inserted into pBluescript II SK (+) (manufactured by Stratagene) digested with EcoRV, transformed into Escherichia coli, and then the plasmid was extracted. Sequence analysis was outsourced to Eurofins Genomics. GENETY X-WIN Ver. 7 (Genetics) was used for the base sequence analysis, and NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST search was used for the base sequence identity search.
  • the No. 58 strain of the present invention was identified as the Bacillus halosaccharovorans No. 58 strain (No. 58 strain). This strain was deposited on April 12, 2019 at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (Room 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture). The accession number is NITE BP-02937.
  • the adsorbent was eluted with a reverse linear gradient (1.0 L) of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 20-0% saturated ammonium sulfate, and fractionated by 10 ml. The activity of each fraction was measured, the fraction showing ⁇ -amylase activity was recovered, ammonium sulfate was added and dissolved to a saturation concentration of 80%, and a precipitate was formed at 4 ° C. overnight. The precipitate was recovered by centrifuging this (10,800 rpm, 30 minutes, 4 ° C).
  • the recovered precipitate was dissolved in a small amount of 20 mM Tris HCl buffer (pH 7.0) and dialyzed against a large excess of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) using a dialysis membrane.
  • Fig. 4 shows the results of subjecting the purified enzyme obtained by a series of purification experiments to SDS-PAGE. From FIG. 4, a single band showing a molecular weight of 59.4 kDa was obtained by purification, indicating that this enzyme could be purified as a single enzyme. After that, the obtained purified enzyme was used.
  • Experiment 3 ⁇ -amylase sequence analysis N-terminal amino acid sequence analysis After performing SDS-PAGE using a purified sample, the gel was placed in blotting solution C (0.02% SDS, 25 mM Tris, 20% methanol, 25 mM boric acid) 5 Shake gently for minutes. Prepare 6 sheets of filter paper cut into gel size, and blotting solution A (0.02% SDS, 300mM Tris, 20% methanol), blotting solution B (0.02% SDS, 25mM Tris, 20% methanol), and blotting solution C, 2 each. Soaked sheet by sheet and shaken for 15 minutes.
  • blotting solution C 0.02% SDS, 25 mM Tris, 20% methanol
  • a PVDF membrane manufactured by MILLIPORE
  • MILLIPORE a PVDF membrane
  • the PVDF film after transfer was lightly washed with ultrapure water, stained with Ponceau S stain (0.1% Ponceau S, 5% acetic acid) for 5 minutes, and then decolorized with ultrapure water. A part of the target band was cut out, collected in a tube, and dried. Sequence analysis was outsourced to the Hokkaido University Global Facility Center Equipment Analysis Contract Service. As a result of analyzing the N-terminal amino acid sequence, it was found to be H 2 N-Glu-Ile-Lys-Thr-Asp-Tyr-Lys-Ala-Ser-Val-.
  • the ⁇ -amylase gene was amplified by PCR.
  • the template is the No. 58 strain chromosomal DNA prepared by the method described in Experiment 1, and the primer is a forward primer designed based on a highly conserved region in bacterial ⁇ -amylase (5'-GTNTGGTGGGGNTAYGTNGA-3). ': SEQ ID NO: 5) and a reverse primer (5'-GGRTTRTTCATYTGCCARTG-3': SEQ ID NO: 6) were used.
  • PCR amplification was performed using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), and the temperature cycle was 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, and 72 ° C for 50 seconds for 30 cycles.
  • the obtained PCR product was ligated to pBluescript II SK (-) digested with the restriction enzyme EcoRV and transformed into Escherichia coli.
  • the cells were inoculated into 2 ml of 2 ⁇ TY medium (added 100 ⁇ g / ml ampicillin) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • a plasmid was extracted from the transformed Escherichia coli and sequence analysis was performed to confirm that the plasmid contained the ⁇ -amylase sequence.
  • Primer PS-F (5'-GGCAGCCCAGGTAATTTCTAC-3': SEQ ID NO: 7) and PS-R (5'-GGAGGGTTGACTTCACTCCA-3') designed from the determined ⁇ -amylase gene sequence using the plasmid containing the obtained gene as a template.
  • a DIG (digoxigenin) -labeled probe was synthesized using SEQ ID NO: 8). No.
  • 58 strain genomic DNA was obtained from 10 types of restriction enzymes (Sac I, BamHI, Xba I, Sal I, Sph I, Hind III, Bgl II, Spe I, Nhe I, Xho I). EcoR I and Kpn I, which have cleavage sites, were digested overnight with a combination of each, and Southern blot analysis was performed using the synthesized probe. From this, it was predicted that the Bgl II digestion gene fragment of about 6.3 kb contained the entire length of the target gene. Therefore, the Bgl II digestion gene fragment corresponding to the size of about 6.3 kb was recovered and used with a BamHI restriction enzyme.
  • the plasmid containing the gene of interest was obtained by screening by the PCR method using the primers used when preparing the probe.
  • the obtained plasmid was digested with various restriction enzymes, subcloned into pBluescript II SK (-), and then sequence analysis was performed.
  • the result of sequence analysis is shown in FIG.
  • the resulting sequence consists of 2536 bp (SEQ ID NO: 11), of which the gene is composed of an open reading frame (ORF) (SEQ ID NO: 1) consisting of 1,659 bp, with a ribosome binding site (RBS) 6 bp upstream of the start codon. It was found that there is a promoter region consisting of a -10 region near 56 bp upstream and a -35 region near 82 bp upstream.
  • ORF open reading frame
  • RBS ribosome binding site
  • this gene was synthesized as a precursor protein consisting of 552 amino acids (SEQ ID NO: 12, the corresponding base sequence is SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 12 the corresponding base sequence is SEQ ID NO: 1.
  • a signal sequence consisting of 29 amino acids (indicated by the underline in the figure) exists from this sequence, and the mature protein is composed of 523 amino acids and has an amino acid sequence.
  • the molecular weight calculated from the above was 59,403 (SEQ ID NO: 2, the corresponding base sequence is SEQ ID NO: 13).
  • the mature protein is composed of a catalytic domain classified into Glycoside hydrolase family 14 (GH14) in the N-terminal region and a substrate binding domain classified into Carbonate-binding module 20 (CBM20) in the C-terminal side. It was.
  • GH14 Glycoside hydrolase family 14
  • CBM20 Carbonate-binding module 20
  • the enzyme solution was mixed with a 50 mM universal buffer of pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.2, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.75.
  • each mixed solution was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours.
  • the pH was returned to 7.0 by diluting this mixed solution 10-fold with 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0).
  • the residual activity of these diluted mixed solutions was measured by reacting these diluted mixed solutions at 37 ° C. for 10 minutes in the same manner as in the above-mentioned amylase activity measurement.
  • the measurement result of pH optimum is shown in FIG.
  • FIGS. 6 and 7 the vertical axis is the relative activity value with the measured maximum activity value as 100%. From FIG. 6, this enzyme showed the maximum activity at around pH 7.0. From FIG. 7, it was clarified that this enzyme shows a residual activity of 80% or more in the pH range of 5.0 to 9.0.
  • Optimal temperature and temperature stability In order to determine the optimum temperature for ⁇ -amylase, the enzyme solution was reacted at each temperature of 37 to 70 ° C. for 10 minutes in the same manner as the above amylase activity measurement except for the temperature. The enzyme activity was measured.
  • the temperature stability is the same as the above amylase activity measurement by treating the enzyme solution (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0) at 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ° C. for 30 minutes and then cooling. The residual activity was measured by reacting at 37 ° C. for 10 minutes by the above method.
  • FIG. 8 shows the measurement results of the optimum temperature
  • FIG. 9 shows the residual activity of each ⁇ -amylase at 60 ° C.
  • FIG. 10 shows the residual activity of each ⁇ -amylase at 65 ° C.
  • FIG. 8 shows the relative activity value with the measured maximum activity value as 100% for each temperature.
  • the value of 0 minutes of the processing time is set as 100% and shown as relative values. From FIG. 8, it was found that the optimum temperature of this enzyme was around 50 ° C. From FIG. 9, the activity of ⁇ -amylase derived from barley, ⁇ -amylase derived from Bacillus cereus, and ⁇ -amylase derived from Brevibacillus sp. TMK-672 strain decreased in this order, and 60 to 60 to soybean-derived ⁇ -amylase known to have heat resistance. After 80 minutes of treatment, the residual activity was about 80%. On the other hand, ⁇ -amylase derived from strain No.
  • Raw starch degrading activity An experiment was conducted to compare the degrading activity of ⁇ -amylase on raw starch. As the raw starch, those derived from corn and those derived from wheat were used. Each raw starch 1.0 mg / ml was reacted in the presence of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 5 mM CaCl 2 , and enzyme 0.1 ⁇ g / ml, and an appropriate amount of reaction solution was added to a test tube containing 0.4 ml DNS solution. The reaction was stopped by adding to, and the raw starch degrading activity was evaluated by the method for quantifying reduced sugars described in Experiment 1.
  • the ⁇ -amylase of the present invention As the ⁇ -amylase, the ⁇ -amylase of the present invention, the ⁇ -amylase derived from barley, and the ⁇ -amylase derived from soybean were used.
  • Barley-derived ⁇ -amylase is known to have the activity of decomposing raw starch
  • soybean-derived ⁇ -amylase is known to have weak raw starch activity but high heat resistance.
  • Wheat-derived starch was reacted at 60 ° C
  • corn-derived starch was reacted at 70 ° C.
  • the reaction results for wheat-derived starch are shown in FIG. 11, and the reaction results for corn-derived starch are shown in FIG. From FIG.
  • the cells were collected by centrifugation (10,000 rpm, 2 minutes, 4 ° C), suspended in 1 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.0, 5 mM CaCl 2 , and then used with Handy sonic disruptor UD1 (manufactured by Tomy Seiko). , 30 seconds x 4 cycles of ultrasonic crushing.
  • the amylase activity was measured using the supernatant obtained by centrifuging the crushed solution (15,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C) as a crude enzyme, and the production of reducing sugars was confirmed using soluble starch as a substrate.
  • the reaction product was detected using TLC, it was only maltose.
  • the enzyme activity was 55.1 U / ml per 1 ml of culture medium.
  • Site-specific mutagenesis into ⁇ -amylase gene Site-specific mutagenesis was performed into the ⁇ -amylase gene derived from strain No. 58 to prepare a mutant enzyme, and its enzyme activity was measured. Site-specific mutagenesis into the ⁇ -amylase gene was performed by the PCR-mega primer method. First, using a plasmid containing the coding region of the ⁇ -amylase gene and the ribosome binding site as a template, four types of mutagenesis primers (SEQ ID NOs: 14 to 17) and exp-R primers (SEQ ID NOs: 10) shown in Table 4 below were used.
  • PCR was performed in the same manner as in "cloning the ⁇ -amylase gene” to obtain a mega primer.
  • RBS-F primer SEQ ID NO: 9
  • a plasmid containing the coding region of the ⁇ -amylase gene and the ribosome binding site as a template PCR was performed in the same manner to generate mutations.
  • the full length of the introduced ⁇ -amylase gene was obtained.
  • An expression plasmid was constructed from this gene fragment using the same method as in Experiment 5, and the transformant was transformed into the E. coli BL21 (DE3) strain to obtain a transformant producing ⁇ -amylase mutant enzyme. ..
  • Each of the obtained transformants was cultured using the same method as in Experiment 5, and the cells were disrupted to obtain a crude enzyme.
  • the crude enzyme was purified using the same method as in Experiment 2.
  • the purification result of each mutant enzyme is shown in FIG.
  • the temperature stability of these purified enzymes was evaluated in the same manner as in "Confirmation of ⁇ -amylase”.
  • Each enzyme sample was placed in a microtube, kept warm at 65 ° C., sampled after 15, 30 and 60 minutes, and cooled on ice.
  • the residual enzyme activity of the sample after cooling was measured by quantifying the amount of reducing sugar produced, and the temperature stability of the obtained amylase at 65 ° C. was evaluated.
  • an unmutated purified enzyme was also treated in the same manner to evaluate the temperature stability.
  • the result is shown in FIG.
  • the data is shown as a relative value with the value of 0 minutes of processing time as 100%.
  • wt represents ⁇ -amylase of the No. 58 strain of the present invention
  • T4P, T15K, T15R, and Q306D each represent a mutant enzyme (for example, in the case of T4P, the fourth amino acid residue T of SEQ ID NO: 2 is P. Indicates that it is mutated).
  • the residual activity after 60 minutes was 37.7% for ⁇ -amylase before mutation, 80.9% for T4P, 50.1% for Q306DE, 44.4% for T15K, and 44.2% for T15R. It was revealed that the thermostability was improved as compared with the ⁇ -amylase before the mutation.
  • the ⁇ -amylase mutant enzymes contained in the obtained four transformants are mutations in which threonine at amino acid number 4 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is converted to proline (SEQ ID NO: 18: T4P in FIG. 14). , Or a mutation in which threonine at amino acid number 15 is converted to lysine (SEQ ID NO: 19: T15K in FIG.

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Abstract

60℃を超える高温に対しても耐熱性を有するβアミラーゼを得ることを課題とする。 土壌試料からβアミラーゼ生産菌をスクリーニングして得ることにより、耐熱性を有する新規βアミラーゼを有する新規Bacillus halosaccharovorans株および新規B. halosaccharovorans株由来のβアミラーゼを得た。

Description

新規βアミラーゼ及びその利用・製造法
　本発明は、新規βアミラーゼ及びその利用・製造法に関する。
　デンプンは生物にとっての重要な栄養源であり、セルロース同様、地球上に多く存在する多糖類の1つである。デンプンの構造は、グルコースがα-1,4結合で直鎖状に重合したアミロースとアミロースがα-1,6結合によって分岐したアミロペクチンで構成されている。
　天然のデンプンを水に懸濁して加熱すると、アミロースやアミロペクチンの各分子が分散してデンプン溶液、あるいはデンプン糊となる。このような加熱糊化したデンプンと区別して、天然の結晶・粒構造を持つデンプンを生デンプンと呼称する。生デンプンの結晶構造は加熱し、水和させることで破壊される。
　アミラーゼは、このデンプン中のアミロースやアミロペクチンのα-1,4およびα-1,6結合を加水分解する酵素の総称である。
　アミラーゼは、作用様式によって、大きく分けてエンド型アミラーゼとエキソ型アミラーゼの2つのタイプに分類することができる。α-アミラーゼはエンド型アミラーゼとして知られており、デンプンのグルコース鎖をランダムに加水分解する酵素である。βアミラーゼはエキソ型アミラーゼとして知られ、デンプンやグリコーゲンなどのグルコースがα-1,4結合で重合した多糖類に作用して、非還元末端からマルトース(麦芽糖)単位で分解する酵素である。
　βアミラーゼは、デンプンからマルトースを生成できる特性からマルトース製造や食品加工に利用されている。βアミラーゼはサツマイモ、小麦、大麦、大豆等から見いだされ、高等植物に広く分布する酵素として知られるようになった。一方、微生物由来のβアミラーゼは長く存在しないと考えられてきたが、1970年代より微生物が持つβアミラーゼが次々に発見されている（非特許文献１）。
特開2011-036237号公報
澱粉・関連糖質実験法(1989) 応用糖質科学　第１巻　第２号　194-200(2011)
　植物由来のβアミラーゼに関しては、比較的安価に製造することが可能であるため、これまでのβアミラーゼの工業生産では主に植物原料が利用されている。しかし、近年の世界的な人口増加、バイオエタノールなど再生可能資源としてのバイオ燃料の需要拡大に伴い、穀物需要、穀物価格は世界的に上昇傾向を示している。これを踏まえると、今後植物由来のβアミラーゼの原料となる穀物を安価でかつ安定的に供給できるかどうかは不透明な状態となっている。
　微生物由来のβアミラーゼは次々と発見されているが、実用化されているものは少ない。これは、これまでに報告された微生物由来のβアミラーゼが、耐熱性や生産量が低いこと、また生産菌の多くが病原菌として分類され食品利用としては適さないことによる。かろうじて天野エンザイム社が産業用酵素としてBacillus flexus由来のβアミラーゼの販売を行っている程度である(特許文献１、非特許文献２)。
　このBacillus flexus由来のβアミラーゼは、耐熱性は他の微生物由来βアミラーゼなどに比べて比較的高いものの、植物由来で最も耐熱性に優れる大豆由来酵素よりも耐熱性は低く、十分な耐熱性があるとは言えない。また、耐熱性に優れた大豆由来酵素も、生デンプンに対する分解活性が低いことが知られている。
　一般的に、デンプンを工業的にアミラーゼで酵素分解する際は、デンプンを一度加熱して行うが、昨今の省エネルギー化の観点からも、加熱糊化せずに生デンプンを直接高効率で酵素反応できることが望まれている。
　これらのことから、病原性を持たない微生物由来のβアミラーゼの開発が求められている。
　本発明者は、驚くべきことに、発明者が新たに単離した非病原性株Bacillus halosaccharovorans No. 58株が、従来の穀物由来、及び微生物由来のものより耐熱性の高いβアミラーゼを産生することを見いだした。
　かくして本発明は、受託番号NITE BP-02937で特定される細菌を提供する。
　また、本発明は、受託番号NITE BP-02937で特定される細菌により産生されるβアミラーゼを提供する。
　また、本発明は、
(i) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は
(ii) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列又は
(iii) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβアミラーゼを提供する。
　更に、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照してアミノ酸番号4位に対応する位置にあるトレオニンがプロリンへ変わる置換、又はアミノ酸番号15位に対応する位置にあるトレオニンがリシン若しくはアルギニンへ変わる置換、又はアミノ酸番号306位に対応する位置にあるグルタミンがアスパラギン酸へ変わる置換から選ばれる１つ以上の置換を含むβアミラーゼを提供する。
　更に、本発明は、
　(i) 配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列又は
(ii) 配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列又は
(iii) 配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβアミラーゼを提供する。
　更に、本発明は、上記のβアミラーゼをコードするDNAを提供する。
　更に、本発明は、βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
　(i) 配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列
　(ii) 配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列と90%以上同一の塩基配列
　(iii) (i)又は(ii)で表される塩基配列で表されるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを提供する。
　更に、本発明は、βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
　(i)配列番号２６～配列番号３３のいずれか１つに記載の塩基配列又は
(ii) 配列番号２６～配列番号３３のいずれか１つに記載の塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを有するDNA、又は
(iii) (i)又は(ii)で表される塩基配列で表されるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを提供する。
　更に、本発明は、配列番号１、配列番号１３及び配列番号２６～３３で表される塩基配列の縮重配列からなるDNAを提供する。
　更に、本発明は、上記のDNAを有するベクターを提供する。
　更に、本発明は、上記のDNAを有するベクターを有する微生物を提供する。
　更に、本発明は、上記細菌、又は上記の微生物の培養物からβアミラーゼを抽出する工程を含む、βアミラーゼの製造方法を提供する。
　更に、本発明は、上記のβアミラーゼでデンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法を提供する。
　更に、本発明は、上記細菌、又は上記の微生物でデンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法を提供する。
　更に、本発明は、上記のβアミラーゼで生デンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法を提供する。
　更に、本発明は、上記細菌、又は上記βアミラーゼ、又は上記の微生物を用いる、食品の改質方法を提供する。
　更に、本発明は、上記細菌、又は上記βアミラーゼ、又は上記の微生物を用いる、酵素剤を提供する。
　本発明によれば、病原性を持たない新規βアミラーゼが提供される。
候補株培養上清によるデンプン分解産物のTLC解析の結果である。 No. 58株の培養上清における、60℃でのアミラーゼの温度安定性を表した図である。 各種アミラーゼにおける、還元糖生成量と相対KI／I2値の関係を示した図である。 精製したβアミラーゼをSDS-PAGEに供した結果である。 本発明のβアミラーゼ遺伝子の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列である。 No. 58株由来のβアミラーゼの最適pHを示したグラフである。 No. 58株由来のβアミラーゼのpH安定性を示したグラフである。 No. 58株由来のβアミラーゼの最適温度を示したグラフである。 No. 58株由来のβアミラーゼを含む5種のβアミラーゼを60℃で熱処理した際の酵素の残存活性を比較した結果である。 No. 58株由来のβアミラーゼを含む5種のβアミラーゼを65℃で熱処理した際の酵素の残存活性を比較した結果である。 小麦由来の生デンプンを、No. 58株由来のβアミラーゼを含む3種のβアミラーゼでそれぞれ酵素処理した際の生デンプンの分解率を表したグラフである。 トウモロコシ由来の生デンプンを、No. 58株由来のβアミラーゼを含む3種のβアミラーゼでそれぞれ酵素処理した際の生デンプンの分解率を表したグラフである。 精製したβアミラーゼ変異酵素をSDS-PAGEに供した結果である。 βアミラーゼ変異酵素における、65℃でのアミラーゼの温度安定性を表した図である。
βアミラーゼの性質
　本発明による酵素はβアミラーゼであり、デンプン中のグルコース多糖におけるα-1,4グルコシド結合を非還元末端からマルトース単位で分解する酵素である。
　No. 58株が産生するβアミラーゼは次の性質を有する。
　(1)本発明のβアミラーゼの基質はデンプンに限定されない。本発明のβアミラーゼは、例えば、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリンに対して反応することができる。
　(2)本酵素の分子量は約60,000Daである。
　(3)本酵素の至適温度は約50℃である。本酵素は約37℃～60℃及びpH7.0の条件において、10分間基質と反応させる条件で50℃での活性の70%以上の活性を示す。また、本酵素を60℃で75分処理しても活性は失われない。65℃で30分処理しても50℃での活性の40%の活性を有する。
　(4)本酵素の至適pHは約7.0である。本酵素はpH6.0～9.0及び37℃で、10分間基質と反応させる条件で、pH7.0の活性と比較して80%以上の残存活性を示す。また、本酵素をpH5.0～9.0、4℃で16時間置いた後、pHを7.0に戻して37℃で、10分間基質と反応させても、pH7.0、4℃で16時間置いたサンプルの活性と比較して、80%以上の残存活性を示す。
　(5)生デンプンに対する活性を有し、小麦由来の生デンプンを、60℃、pH7.0の条件で24時間の反応で65%分解できる。また、トウモロコシ由来の生デンプンに対しても70℃、pH7.0での反応により8時間で27%分解できる。
　(6)デンプンを分解してマルトースのみを生じる。
　本発明のβアミラーゼは、配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列又は、配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβアミラーゼであってもよい。アミノ酸配列の同一性は好ましくは95%、より好ましくは99%以上の同一性を有する。また、本発明のβアミラーゼは、βアミラーゼ活性を有しているものであれば、他のタンパク質に付加した融合タンパク質のような形であっても構わないし、ビーズのような樹脂に固定された形であっても構わない。融合タンパク質としては、例えば、枝切り酵素、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、αアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ等と結合したタンパク質や、精製用のヒスチジン(His)タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)が融合したタンパク質の形態が考えられる。置換は保存的置換が好ましい。保存的置換とは、置き換わるアミノ酸が有する酸性、塩基性などの性質が変化しない置換のことを指す。具体的には、Phe, Trp, Tyr間での置換、Leu, Ile, Val間での置換、Lys, Arg, His間での置換、Asp, Glu間での置換、Ser, Thr間での置換を指す。特に、アミノ酸配列のN末端及び／又はC末端における欠失に関しては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するβアミラーゼと同等の酵素活性を有すれば、アミノ酸配列のN末端及び／又はC末端において欠失されるアミノ酸の数に制限されず、そのような欠失体は試行錯誤を要することなく容易に取得可能である。ここでいう「１～数個」とは、例えば１～９個、好ましくは１～８個、より好ましくは１～６個、より好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、又はより好ましくは１～２個の間の数を取り得る。
　また、置換部位は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号4位のトレオニンがプロリンへ変わる置換(配列番号１８)、又はアミノ酸番号15位のトレオニンがリシンへ変わる置換(配列番号１９)、又はアミノ酸番号15位のトレオニンがアルギニンへ変わる置換(配列番号２０)、又はアミノ酸番号306位のグルタミンがアスパラギン酸へ変わる置換(配列番号２１)から１つ以上、あるいは配列番号１２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号33位のトレオニンがプロリンへ変わる置換(配列番号２２)、又はアミノ酸番号44位のトレオニンがリシンへ変わる置換(配列番号２３)、又はアミノ酸番号44位のトレオニンがアルギニンへ変わる置換(配列番号２４)、又はアミノ酸番号335位のグルタミンがアスパラギン酸へ変わる置換(配列番号２５)から１つ以上選ばれれば、更に耐熱性に優れたβアミラーゼを得ることができる。
　また、本発明のβアミラーゼは、配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列又は配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列又は配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβアミラーゼであってもよい。これら配列は、上記置換を有することが好ましい。アミノ酸配列の同一性は好ましくは95%、より好ましくは99%以上の同一性を有する。
　本発明における同一とは、比較対象である２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で対応する位置において、一致する塩基又はアミノ酸の割合(百分率)として算出される。同一性とは、ある２つの配列において以下の関数
同一性（％）＝(２つの配列間で対応する位置において一致する塩基又はアミノ酸数)／(基準とする配列中の塩基又はアミノ酸の総数×１００)
で表すことができる。
　アミノ酸配列の解析、又は２つ、あるいはそれ以上のアミノ酸配列の同一性の比較は、当業者が一般的に用いる解析プログラムを用いて行うことができる。例えば、アミノ酸配列の解析はGENETYX-WIN Ver. 7を用い、アミノ酸配列の同一性の検索にはNCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のBLAST検索を用いることができる。塩基配列に関しても、アミノ酸配列と同様に、当業者が一般的に用いる解析プログラムで解析、検索を行うことができる。
　本発明のアミラーゼに係る酵素活性測定は、酵素が基質を分解し、分解されて出てきた糖類を定量的に測定できる方法であれば特に限定されない。例えば、ソモギー・ネルソン法のような還元糖定量法を用いて測定できる。
　本発明のアミラーゼの酵素反応産物は、上記のような定量的な検出法とは別に、含有される糖の検出のみを目的とした場合、定性的な検出法を用いて検出してもよい。これは、分析対象物に含有されている糖類などが特定できれば特に限定されないが、例えば薄層クロマトグラフィー(TLC)を利用した検出法が考えられる。
　本発明のβアミラーゼは、βアミラーゼを60℃、10分間の熱処理をしても、加熱処理していないβアミラーゼと比較して最低80%の活性を有していてもよい。更に、本酵素は、60℃で20, 40, 80分間熱処理をしても、加熱処理していないβアミラーゼと比較して最低80%の活性を有していてもよい。
　本発明のβアミラーゼは、生デンプン分解活性を有していてもよい。本発明における生デンプンとは、加熱処理していない状態のデンプンである。加熱糊化したデンプンとは異なり、生デンプンは結晶・粒構造を有する。生デンプンの結晶構造は、加熱し、水和させることで破壊される。加熱温度は、生デンプンの種類によって異なるが、例えば、小麦やトウモロコシ由来のデンプンは糊化温度が高く、糊化温度は、80℃以上での加熱が必要である。
　酵素の基質であるデンプンは、特定の生物によらず、例えば、大豆、小豆、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、サツマイモ、葛、ワラビ、緑豆、ソラマメ、蓮根、キャッサバ、サゴヤシ、カタクリ等を用いることができる。
　本発明で得られた細菌の１つの具体例は、2019年4月12日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2－5－8　122号室)に受託番号NITE BP-02937で受託された細菌、Bacillus halosacchalovorans No.58(本明細書において、単に「No.58株」と表すこともある)である。No.58株は、好気性の細菌で、桿状の細胞形態であり、クリーム色のコロニーを形成し、芽胞を形成するという特徴を有する。
　本株は病原性を持たない菌株であるため、食品などに好適に使用できる。
　本発明に係る配列番号２に記載のアミノ酸を有するβアミラーゼはNo.58株から得られた酵素である。No. 58株は配列番号１で表されるDNA配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質であるβアミラーゼを有する。
　本発明のβアミラーゼは、例えばNo. 58株のように、配列番号１で表されるDNAを有する細菌、又は当該配列を含むベクターを有する、若しくは当該配列が組み込まれた組換え体を培養することにより得ることができる。No.58株や組換え体の培養は当業者が一般的にアミラーゼ生産で行う方法で行われ得る。また、宿主となる微生物も当業者が一般的に用いるもので行われ得る。宿主となる微生物は特に限定されないが、例えば非病原性の大腸菌、酵母、放線菌、藻類、乳酸菌、枯草菌等を用いることができる。
　培養条件は宿主、発現系に合わせて適宜最適になるように調製できる。培地としては、培養対象が増殖可能なものであれば特に限定されない。培地は固体でも液体でもよいが、好ましくは液体である。
　より具体的な例としては、βアミラーゼ遺伝子を、大腸菌発現用のベクターに挿入し、大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体を、必要に応じて抗生物質を含む2mlの2×TY培地に植菌し、30℃で24時間振とう培養することにより菌体を得、これらを集菌後、超音波破砕することで破砕液中にβアミラーゼを得ることができる。
　固体培地としては、例えばバナナやリンゴ、オレンジなどの果実残渣や、大豆等の豆類、または植物油の絞りかすなどの植物資源由来のバイオマス等が考えられる。
　本発明において、培養物とは、微生物を培養基質に加えて培養した、基質やその反応物、培養された菌体を含む混合物である。培養物には、培養微生物(植菌した微生物及び該微生物から増殖した微生物)、培地、培地補充/添加物、培養微生物から分泌された物質が含まれるがこれらに限定されない。培養物は、その全体又は一部が液状であっても固体であってもよい。培養物が液状のものは培養液とも呼称する。培養物は、好ましくは、培養微生物及び培養微生物からの分泌物の少なくとも１つを含んでなる。培養物は、好ましくは培養液である。
　本発明のDNAは、上記βアミラーゼをコードするDNAである。
　また、本発明のDNAは、βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
(i)配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列
(ii)配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列と90%以上同一の塩基配列
のいずれかを有するDNA、又は
(i)又は(ii)で表される塩基配列で表されるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよい。
　塩基配列について「同一」とは、上記で説明したとおりである。ストリンジェントな条件は当業者によって一般的に知られており、例えば、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution(タカラバイオ)中、68℃でハイブリダイズする条件、又は、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7M～1.0MのNaCl存在下で約65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1～2倍濃度のSSC溶液(1×SSC溶液：150 mM NaCl、15 mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)を用いて約65℃で洗浄するような条件が挙げられる。塩基配列は、配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列に対して好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上同一の塩基配列を有する。
　DNA配列の置換部位は、例えば配列番号１の97番目のアデニン塩基がシトシンに変わる置換（配列番号２６）、配列番号１の131番目のシトシン塩基がアデニン塩基に変わる置換（配列番号２７）、配列番号１の130番目のアデニン塩基がシトシン塩基に、131番目のシトシン塩基がグアニン塩基に、132番目のアデニン塩基がシトシン塩基に変わる置換（配列番号２８）、配列番号１の1003番目のシトシン塩基がグアニン塩基に、1005番目のアデニン塩基がシトシン塩基に変わる置換（配列番号２９）、あるいは配列番号１３の10番目のアデニン塩基がシトシンに変わる置換（配列番号３０）、配列番号１３の44番目のシトシン塩基がアデニン塩基に変わる置換（配列番号３１）、配列番号１３の43番目のアデニン塩基がシトシン塩基に、44番目のシトシン塩基がグアニン塩基に、45番目のアデニン塩基がシトシン塩基に変わる置換（配列番号３２）、配列番号１３の916番目のシトシン塩基がグアニン塩基に、918番目のアデニン塩基がシトシン塩基に変わる置換（配列番号３３）から１つ以上選ばれれば、より耐熱性に優れたβアミラーゼを得ることができる。
　また、本発明のDNAは、βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
(i)配列番号２６～配列番号３３のいずれか１つに記載の塩基配列、
(ii) 配列番号２６～配列番号３３のいずれか１つに記載の塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを有するDNA、又は
(iii)(i)又は(ii)で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよい。
　また、本発明のDNAは、配列番号１、配列番号１３及び配列番号２６～３３に記載の塩基配列の縮重配列からなるDNAであってもよい。ここで、縮重とは、１つのアミノ酸をコードしているコドンが複数種類あることを指す。よって、縮重配列は、例えば、縮重配列中の1つのアミノ酸が例えばアルギニンであった場合、その塩基配列はアルギニンをコードする6種のコドン(CGU、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG)のうちのいずれに対応する配列であってもよい。
　本発明のDNAは、当業者が一般的に行う遺伝子工学の手法を用いることで扱うことができる。配列番号１で示されるDNA配列は、対応したプライマーを用いたPCR処理により得てもいいし、配列情報を元に全合成して得てもよい。
本発明のDNAは、本発明のDNAを有するベクターの形でも提供される。ベクターは当業者が一般的に用い、本遺伝子を組み込む用途を満たせる物であれば限定されないが、例えばpBluescript II SK (+)ベクター、pBluescript II SK（-）ベクターを用いることができる。
　本発明は、本発明のDNAを有するベクターを有する微生物を提供する。宿主となる微生物は、当業者が一般的にベクターのキャリアーとして用いるものであれば特に限定されないが、例えば非病原性の大腸菌、酵母、放線菌、藻類、乳酸菌、枯草菌等を用いることができる。
　本発明は、βアミラーゼの製造方法もまた提供する。
　本発明のβアミラーゼは、βアミラーゼを含む微生物の培養液より単離することにより得てもよい。単離方法は当業者が一般的に用いる方法で行うことができる。製造方法には菌体を培養するステップと、培養物または培養菌体からβアミラーゼを抽出するステップが含まれる。
　菌体を培養するステップは、No. 58株、または本発明のDNAを含む組換え微生物を培養する。組換え体となる宿主は培養ができ、タンパク質を発現させることができれば特に限定されないが、例えば非病原性の大腸菌、酵母、放線菌、藻類、乳酸菌、枯草菌等を用いることができる。
　培養条件は宿主、発現系に合わせて適宜最適になるように調製できる。培地としては、培養対象が増殖可能なものであれば特に限定されない。培地は固体でも液体でもよいが、好ましくは液体である。
　培養法は、培養対象が増殖可能なものであれば特に限定されない。例えば静置培養、震盪培養、嫌気培養等が利用できる。
　例えばNo. 58株を用いる場合次の条件を挙げることができる。用いる培地はアミラーゼ生産菌用液体培地、2×TY 培地（実施例の表１、表２に記載）、LB培地、Nutrient Agar培地(Difco)などが挙げられる。
　培地のpHは、好ましくは6.0～9.0、より好ましくはpH7.0である。
　培養温度は、好ましくは20～50℃、より好ましくは45℃である。
　好気的条件下で、静置培養、振とう培養又は回転培養で培養することができる。
　培養物または培養菌体からβアミラーゼを回収するステップでは、精製ステップでβアミラーゼを含む培養物または培養菌体から精製してβアミラーゼを得ることができる。酵素の精製方法は、培養物又は培養菌体からβアミラーゼを得ることができれば特には限定されないが、例えば、培養上清を遠心分離又はフィルター濾過に供して菌体や固形物などを取り除いた後、限外濾過フィルターによる濾取又は濃縮、塩析やカラムを用いたクロマトグラフィー、活性炭による吸着などを組み合わせることによって本酵素を精製できる。用いるカラムとしては、酵素を失活させずに他のタンパク質や夾雑物と分離できるものであれば特に限定されないが、陰イオン交換クロマトグラフィー用カラム、陽イオン交換クロマトグラフィー用カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー用カラム、ゲル濾過クロマトグラフィー用カラム、アフィニティークロマトグラフィーカラムなどを挙げることができる。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー用カラムであるTOYOPEARL Butyl-650Mカラム、陰イオン交換クロマトグラフィー用であるTOYOPEARL DEAE-650Mカラムが用いられる。
　粗精製、又は精製したタンパク質の検出は、試料中に含まれるタンパク質が分離、検出できれば特に限定されない方法により行うことができる。例えば、SDS-PAGEの様な電気泳動を用いた方法が用いられる。
　後述の酵素活性測定、又は酵素精製などに用いる緩衝液は、実験の用途に応じて適宜変更して利用できる。緩衝液の性質は、酵素の活性や安定性に影響を及ぼさない物が好ましい。緩衝液としては、例えばTris-HClが用いられ得る。
　本発明のβアミラーゼの製造方法は、培養菌体を用いる場合、培養菌体からβアミラーゼを抽出する工程を更に含む。
　培養菌体からβアミラーゼを抽出する方法は特に限定されず、当業者に公知の任意の方法であり得る。βアミラーゼは、例えば、菌体の可溶化(超音波破砕)により細胞表面の構造(例えば細胞膜)の一部又は全体を破壊して得ることができる。抽出に用いる菌体は生菌であっても死菌であってもよい。
　本発明のβアミラーゼはデンプンからマルトースのみを生じさせるので、本発明のβアミラーゼの製造方法によれば、マルトースの製造が容易となる。
　本発明は、本発明のβアミラーゼでデンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法も提供する。
　デンプンの酵素処理は、一般に、生デンプンを加熱して糊化したデンプンに対して行われるため、糖化する工程が酵素処理前に行われる。加熱温度は、生デンプンの種類によって異なるが、小麦やトウモロコシ由来のデンプンは糊化温度が高い。この際に、耐熱性の低いβアミラーゼを用いると、加熱したデンプンの熱により酵素が失活してしまうため、加熱糊化したデンプンを、酵素反応に適切な温度まで冷却する必要が生じる。これにより、デンプンの糖化処理に際して加熱デンプンの冷却コストが生じ、冷却時間も生じることになる。また、基質を冷却して反応させると、雑菌の繁殖リスクも増大する。
　本発明のβアミラーゼは高い熱耐性を有することから、デンプンの冷却コストを低減し、及び／又は冷却時間を短縮することができるため、デンプンの糖化処理に好適に使用できる。このβアミラーゼの高い耐熱性により、加熱処理後のデンプンに加えることも、さらには、加熱処理中のデンプンに加えることも可能である。βアミラーゼ添加後の温度やpHは、上記酵素性質に記載のように、酵素がデンプンを分解できる条件であれば特に限定されないが、本発明のβアミラーゼは基質であるデンプンの温度が70℃以下の温度で添加することができ、60℃以上70℃以下で添加することができる。酵素の基質であるデンプンは、特定の生物によらず、例えば、大豆、小豆、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、サツマイモ、葛、ワラビ、緑豆、ソラマメ、蓮根、キャッサバ、サゴヤシ、カタクリ等を用いることができる。酵素反応は再加熱やpH調整などの薬剤処理で酵素を失活させて反応を止めることができる。
　本発明のβアミラーゼにより、デンプンからマルトースを製造することができる。本発明のβアミラーゼはデンプンからマルトースのみを生じさせるので、本発明によれば、マルトースの製造が容易となる。
　本発明は、本発明の微生物でデンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法も提供する。
　No. 58株は培養すると、βアミラーゼを菌体外酵素として菌体から培養液中に放出する。そのため、No. 58株をデンプンと共に培養すると、菌体外へとβアミラーゼが放出され、放出されたβアミラーゼがデンプンと反応し、マルトースができる。このように、本発明のβアミラーゼを菌体外酵素として放出できるのであれば、培養する菌体はNo. 58株に限らず、No.58株のβアミラーゼを有する組換え微生物でも構わない。この際の培養条件は培養する微生物が培養できる条件であれば特に制限されず、生育に必要なデンプン以外の物質が含まれていても構わない。
　菌体外へとβアミラーゼが放出されない微生物であっても、デンプンを菌体内へ取り込み、菌体内のβアミラーゼによってデンプンをマルトースに変換し、マルトースが菌体外へと放出されるのであれば、用いる組換え微生物はβアミラーゼを菌体外酵素として放出できる微生物に限らないが、βアミラーゼが菌体外へと放出される微生物が好ましい。
　本発明のβアミラーゼを有する微生物により、デンプンからマルトースを製造することができる。本発明のβアミラーゼを有する微生物は、デンプンからマルトースのみを生じさせるため、マルトースの製造が容易となる。
　本発明は、本発明のβアミラーゼで生デンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法も提供する。
　従来のβアミラーゼは、生デンプンに対する活性が低く、生デンプンをそのまま基質として利用することには不向きである。本発明のβアミラーゼは、生デンプンに対する高い酵素活性を保有するので、生デンプンの酵素処理に好適に使用できる。生デンプンの状態は酵素が反応できる状態であれば特に限定されないが、水溶液中に懸濁された状態であることが好ましい。βアミラーゼ添加後の温度やpHは、上記酵素性質に記載のように、酵素がデンプンを分解できる条件であれば特に限定されない。酵素の基質であるデンプンは、特定の生物によらず、例えば、大豆、小豆、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、サツマイモ、葛、ワラビ、緑豆、ソラマメ、蓮根、キャッサバ、サゴヤシ、カタクリ等を用いることができる。酵素反応は加熱やpH調整などの薬剤処理で酵素を失活させて反応を止めることができる。
　本発明のβアミラーゼにより、生デンプンからマルトースを製造することができる。
　本発明は、本発明のβアミラーゼ、又は本発明の微生物を用いる食品の改質方法も提供する。
　食品の改質とは、食品の特性を変化させることを指す。本発明においては、デンプンなどα-1,4グルコシド結合を有する多糖類を含む食品の性質を好ましい形態にすることを指す。例えば、焼成前のパン生地などに本発明の酵素を配合することによる、パン生地の触感の改善、パン容積の増大、パン製品の老化防止（柔らかさの維持）、冷凍または冷蔵保管したパン生地の焼き色の赤色化の防止、モチの柔らかさの維持などがある。使用できる食品は特に限定されないが、好ましくは、デンプンなど上記α-1,4グルコシド結合を有する多糖類を含む食品である。例えばパン、モチ、ドーナッツ、パイ、ピザ、饅頭等の生地が挙げられる。原料としても、小麦由来の原料に限らず、大豆、小豆、大麦、トウモロコシ、イネ(コメ)、ジャガイモ、サツマイモ、葛、ワラビ、緑豆、ソラマメ、蓮根、キャッサバ、サゴヤシ、カタクリ等を用いることができる。
　本発明によるβアミラーゼは、熱耐性及び生デンプンへの活性があるため、食品の改質操作へと好ましく使用することができる。また、No. 58株は、菌体外酵素としてβアミラーゼのみを有するため、パン生地にαアミラーゼやグルコアミラーゼを用いた際に起こる過剰なデンプンの分解やメイラード反応を起こさない。そのため、No. 58株はこれらに用いる精製βアミラーゼの供給源としてきわめて有用である。また、生成物がマルトースのみである場合、食品のできあがりをまろやかな味にできるという利点を有する。本酵素が有する耐熱性により、基質の反応の制御が行いやすい利点も有する。植物由来のβアミラーゼの多くが、至適pHが酸性側にあるため、酵素処理のためにpH調整剤が必要となることが多いのとは異なり、本酵素の至適pHは中性の7付近にあるため、pH調整剤が不要であることもあり得る。本酵素の生デンプンへの活性は糊化していないデンプン質へと作用させることができるため、幅広い範囲のデンプン製品やデンプンを含む基質に用いることもあり得る。
　また、本酵素は優れた熱耐性を有するが、80℃以上の高温でも酵素活性を有するわけではなく、80℃以上の高温では酵素活性が失われる。この性質により、本酵素はパン生地などに本酵素を練り込み焼成させた際は、焼成の過程で酵素活性を失わせることができる。これは焼成の始まりから途中などの、酵素を反応させたい時間だけは基質に対して酵素を反応させつつ、最終的には酵素活性を失わせるような調製を容易に行うことができる。
　本発明は、本発明のβアミラーゼ、又は本発明の微生物を含む酵素剤の形態でも提供される。酵素剤中の本酵素は精製酵素であっても、培養上清のような粗酵素の段階でも構わない。酵素剤はβアミラーゼ単体のみで構成されていても、その酵素性質を大きく損なわない範囲で添加物を適宜配合してもよい。酵素剤の形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などが挙げられる。酵素剤は、スプレーのような噴霧器内に封入されていてもよく、アミラーゼの他にも酵素を含んでいてもよい。
　本酵素と共に含む酵素としては、例えば枝切り酵素、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、αアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ等が挙げられ、これらの酵素を1つ以上組み合わせて用いてもよい。
　添加物としては、例えば、結合剤(アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドンなど)、充填剤(乳糖、砂糖、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシンなど)、崩壊剤(結晶セルロースなど)、非水性賦形剤(アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチルアルコールのような油性エステルなど)、保存剤(p-ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピル、ソルビン酸、トコフェロールなど)、pH調整剤(炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、クエン酸塩、酢酸塩など)、増粘剤(メチルセルロースなど)、酸化防止剤(ビタミンC、ビタミンEなど)、香料(合成香料、天然香料、エステル類など)、乳化剤（レシチン、ソルビタンモノオレエート、ショ糖脂肪酸エステルなど）、膨張剤（炭酸アンモニウムなど）、懸濁化剤(シロップ、ゼラチン、水添加食用脂など)等が挙げられる。
　本酵素剤は、デンプンなどα-1,4グルコシド結合を有する多糖類を、マルトース単位で分解しマルトースを生産する用途や、食品の改質の用途等で広く使用され得る。例えばパン、モチ、ドーナッツ、パイ、ピザ、饅頭等の生地に酵素剤を添加することが挙げられる。また、デンプンを有する小麦、大豆、小豆、大麦、トウモロコシ、イネ(コメ)、ジャガイモ、サツマイモ、葛、ワラビ、緑豆、ソラマメ、蓮根、キャッサバ、サゴヤシ、カタクリ等の穀物そのものや、その破砕物へ添加することができる。酵素剤の添加前に破砕や加熱、薬剤処理などの前処理を行ってもよい。酵素剤を添加後の処理条件は、適宜当業者によって定められ得る。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実験１：耐熱性βアミラーゼを有する細菌のスクリーニングと同定
　土壌試料からβアミラーゼ生産耐熱性菌の単離・分離を行った。スクリーニング元の土壌は、大阪府内の土壌から得られた。この土壌からデンプン資化性菌株を単離した。単離した株はアミラーゼ生産菌用培地(表１)で培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 基本的なpHは7.0にし、実験に応じて培地組成とpHを変更した。スクリーニングに用いる際は、pH7.0に調整後、上記組成に加えて1.0%ゲランガムが加えられ、プレート上で固化して使用した。
　単離したデンプン資化性菌株を1白金耳取り、6mlのアミラーゼ生産菌用液体培地が入った試験管に植菌し、60℃で3日間振盪培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離(3200rpm, 10分, 4℃)することで培養上清を回収し、これを粗酵素サンプルとした。この粗酵素サンプル100μlに、100μlの基質溶液(1.5%可溶性デンプン(メルク社製), 100mM pH7.0Tris-HCl, 5mM CaCl2)を加え、37℃で一晩反応させた。反応後の反応溶液5μlを薄層クロマトグラフィーに供した。
　薄層クロマトグラフィー(TLC)
　薄層クロマトグラフィーに用いるシリカゲルプレートはシリカゲル60 F254(メルク社製)を用いた。
　展開溶媒は1-ブタノール/エタノール/クロロホルム/25%(w/w)アンモニア溶液:(4/5/2/8, v/v/v/v)のものを用いた。
　マルトースの検出には展開後のシリカゲルプレートに対して検出液(1%バニリン含有濃硫酸)を3度吹きつけ、120℃で数分間加熱することで発色させることによって検出させた。
　TLCの結果を図１に示す。スクリーニングの結果、いくつかのマルトース生産株を獲得した。これらの株を精査したところ、1株が可溶性デンプンからマルトースのみを生産することを確認した(図１：枠内のNo.58。cはコントロール)。これによりマルトース生成能が高いNo. 58株を獲得した。
　アミラーゼ活性測定（還元糖定量法）
酵素サンプル(培養上清や後述の粗精製又は精製酵素)100μlを試験管に取り、37℃で10分間プレインキュベートした。基質溶液（1.5% 可溶性デンプン, 100mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 7.0, 37℃）100μlを加え、37℃で10分間反応させた。酵素反応の停止はDNS溶液（0.5% ジニトロサリチル酸, 0.4N NaOH, 30% 酒石酸カリウムナトリウム４水和物）を400μl添加することで行った。次いで、混合溶液を100℃にて5分間煮沸後、冷水にて5分間冷却し、蒸留水を1.8ml添加して攪拌した。攪拌溶液について、分光光度計にて480nmの吸収を測定した。酵素サンプルの代わりに蒸留水を用いて反応させたものをブランクとし、酵素サンプルについての測定値からブランクについての測定値を減じた。酵素活性の１ユニット（U）は1分間に1μmolのマルトースを生成する酵素量と定義した。以下の実験における酵素反応も特に言及が無ければこの方法で行った。
　タンパク質の濃度は分光光度計にて280nmの吸収を測定することで行った。
　βアミラーゼの確認
　獲得したNo. 58株が有するアミラーゼの、温度安定性の評価を行った。獲得したNo. 58株を培養し、培養上清を回収して培養上清サンプルとした。適度に希釈した培養上清サンプルをマイクロチューブに入れ、60℃で保温後、10、20、40、80分後にサンプリングし、氷上で冷却した。冷却後のサンプルの残存酵素活性を、還元糖生成量を定量することで測定し、獲得したアミラーゼの60℃での温度安定性を評価した。なお、コントロールとして、Brevibacillus sp. TMK-672株(TBA株)由来βアミラーゼを同様に処理し、得られたサンプルを用いた。この結果を図２に示す。データは処理時間0分の値を100%として相対値で示した。図２のNo. 58は本発明の株、TBAは比較対象を表す。さらに、得られたアミラーゼがβアミラーゼかどうかの確認は、還元糖生成量と相対KI／I2値の関係を求めることで行った。
　相対KI／I2値は次のように求めた。
酵素溶液200μlを試験管に取り、37℃で10分プレインキュベートし、同じくプレインキュベートした基質溶液を400μl添加後、37℃で10分反応させ、1 mlの反応停止液（0.5N酢酸と0.5N HClを5:1に混合したもの）を添加することで反応を停止した。反応停止後の反応液200μlを別の試験管に取り、5mlのヨウ素溶液（0.005% I2, 0.05% KI）を添加し、20分後に分光光度計で660 nmの吸収を測定した。還元糖量が0の際の相対KI／I2値を100%とした。測定するサンプルの濃度を適宜変え、この値を前述した還元糖定量法によって得られた値に対してプロットした。αアミラーゼのポジティブコントロールとして、ヒト唾液由来αアミラーゼ、βアミラーゼのポジティブコントロールとしてTMK-672株由来βアミラーゼを用い比較することで得られた株由来のアミラーゼがβアミラーゼかを判定した。この結果を図３に示す。図３のHSAはヒト唾液由来αアミラーゼを示す。
　図２の結果より、No. 58株由来の酵素は調べた時間内において活性の低下が全く起こらず、温度安定性が非常に高い酵素であることが明らかとなった。図３の結果、No. 58株由来の酵素はTMK-672株由来βアミラーゼとプロットが一致したことから、本酵素がデンプン鎖を、デンプン鎖の非還元末端側からマルトース単位で切断するβアミラーゼであることが明らかとなった。
　染色体DNAの調製
　No. 58株を2 ×TY 液体培地(表２)100mlに植菌し、37℃で2日間培養し、菌体を遠心分離（6,000rpm, 10分, 4℃）にて回収した。次に、Solution I（50mM グルコース, 25mM Tris-HCl, EDTA, pH8.0）9mlで懸濁後、数mgのリゾチームを加え、37℃で2時間以上インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 pHは7.0に調製した。
実験によっては、培地に100μg/mlの組成のアンピシリンを加えた。
　その後、培養菌体を含むSolution I溶液に、10% SDS溶液を終濃度が0.5%になるように加え、10分間振盪した。さらに、この混合溶液に、5M NaCl溶液をNaClの終濃度が0.7M以上になるように加え、10分間振盪した。その後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、得られたフェノール／クロロホルム添加溶液を遠心分離（13,500rpm, 10分, 4℃）して水層と油層に分離し、水層を回収した。この得られた回収物に氷冷した2-プロパノール12mlを加え、転倒混和後、DNAの沈殿をパスツールピペットで吸い上げて回収した。このDNAを70%エタノール30mlで2回リンスした後、新しいチューブに移し、減圧下で乾燥した後、TEバッファー(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, ph8.0)500μlに懸濁した。懸濁液に、RNase A溶液（10mg/ml）を5μl加え、37℃で30分インキュベートした後、再度フェノール／クロロホルム抽出を行った。ここに3M酢酸ナトリウム50μlと氷冷した2-プロパノール500μlを加え、氷上で10分放置した。DNA沈殿をパスツールピペットで吸い上げて回収し、70%エタノール1mlで2回リンスした後、空のチューブに移し、減圧下で乾燥し、TEバッファー300μlに溶解した。
　　16S rRNAの取得及び解析
16S rRNA遺伝子を、PCRにより増幅した。鋳型には、抽出した染色体DNAを、プライマーには、細菌16S rRNA 遺伝子の中で高度に保存されている領域をもとに設計されたフォワードプライマー (5´- AGRRTTTGATYHTGGYTCAG 3´：配列番号３) とリバースプライマー (5´- TGACGGGCGGTGTGTACAAG -3´：配列番号４)を用いた。16S rRNA領域のPCRによる増幅は、PrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いて行い、温度サイクルは、98℃ 10秒、55℃ 5秒, 72℃ 90秒のサイクルを30サイクル行った。得られたPCR産物を、EcoR Vで消化したpBluescript II SK (+) (Stratagene社製)に挿入し、大腸菌に形質転換後、プラスミドを抽出した。シークエンス解析はEurofins Genomics社に委託した。塩基配列の解析はGENETYX-WIN Ver. 7 (ゼネティックス)を用い、塩基配列の同一性の検索にはNCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のBLAST検索を用いた。
　これらの解析により、本発明のNo. 58株をBacillus halosaccharovorans No. 58株(No.58株)と同定した。この株を2019年4月12日に独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　122号室)に寄託した。受託番号はNITE BP-02937である。
　実験２　βアミラーゼの精製
　No. 58株の大量培養と粗酵素液の取得
　アミラーゼ生産菌用培地の組成を、1.5%デキストリン, 0.3%ペプトン，0.3%酵母エキス，0.3%CaCl2に変更した培地650mlが入った2.0 L三角フラスコ8本に、45℃で48時間震盪培養したNo. 58株溶液6.5mlをそれぞれ植菌し、45℃で48時間震盪培養した。No. 58株の培養液を遠心分離（9,000rpm, 60分, 4℃）することで培養上清を回収し、粗酵素液とした。
　タンパク質の濃度は分光光度計にて280nmの吸収を測定することで行った。
　TOYOPEARL Butyl-650Mカラムによる精製
　得られた培養上清5.0 Lに対して、20%飽和となるように硫酸アンモニウム570gを攪拌しながら少しずつ添加し溶解した。溶解後、遠心分離（10,800rpm, 60分, 4℃）することで上清を回収した。20%飽和硫酸アンモニウムを含む20mM Tris-HClバッファー（pH7.0）で平衡化したTOYOPEARL Butyl-650M 100mlに、回収した上清を流し、同バッファー2.0 Lにて洗浄した。20-0%飽和硫酸アンモニウムを含む20mM Tris-HClバッファー（pH7.0）のリバースリニアグラジエント（1.0 L）にて吸着物質の溶出を行い、10mlずつ分画した。各画分の活性を測定し、βアミラーゼ活性を示す画分を回収し、80%飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを添加・溶解し、一晩4℃で沈殿を形成させた。これを遠心分離（10,800rpm, 30分, 4℃）することで沈殿物を回収した。回収した沈殿物を、少量の20mM Tris HClバッファー（pH7.0）で溶解し、透析膜を用いて大過剰量の20mM Tris-HCl バッファー（pH7.0）に対して透析した。
　TOYOPEARL DEAE-650Mカラムによる精製
得られた透析サンプルを、20mM Tris-HClバッファー（pH7.0）で平衡化したTOYOPEARL DEAE-650M（100ml）に流し、同バッファー500mlにて洗浄した後、0-300mM NaClを含む20mM Tris-HCl バッファー（pH7.0）のリニアグラジエント（1.0 L）で吸着物質の溶出を行い、10mlずつ分画した。各画分の活性を測定し、βアミラーゼ活性を示す画分を回収し、硫安沈殿後、大過剰の20mM Tris-HCl バッファー（pH7.0）に対して透析した。
　SDS-PAGE 
　SDS-PAGEはLaemmliの方法に従った（Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970）。
分離ゲル12.5%、濃縮ゲル5.0%からなるポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：N , N’-メチレンビスアクリルアミド＝29.2：0.8）を作製した。試料サンプルに6 ×サンプルバッファー（0.375M Tris-HCl，60%グリセロール，6%2-メルカプトエタノール，0.003%ブロモフェノールブルー, pH6.8）を添加し、100℃で10分処理した。縦型スラブ電気泳動装置（ATTO社製）を用い、ポリアクリルアミドゲルに6×サンプルバッファーを添加して加熱した試料サンプルを加え、泳動用バッファー（0.1% SDS，25mM Tris，192mMグリシン）中で、20mAの定電流下により電気泳動を行った。電気泳動後、CBB溶液（0.2%クマシーブリリアントブルーR-250，50%エタノール，10%酢酸）中で染色を行い、脱色液（10%メタノール，7.5%酢酸）で脱色した。タンパク質の分子量マーカーにはProtein Molecular Weight Marker（Broad）（タカラバイオ社製）を用いた。
　これら一連の精製実験の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　一連の精製実験により得られた精製酵素を、SDS-PAGEに供した結果を図４に示す。図４より、精製により分子量59.4kDaを示すシングルバンドが得られ、本酵素が単一酵素として精製できたことが示された。以後、得られた精製酵素を用いた。
　実験３：βアミラーゼ配列解析
　N末端アミノ酸配列解析
　精製標品を用いてSDS-PAGEを行った後、ゲルをブロッティング液C（0.02% SDS, 25mM Tris, 20%メタノール, 25mMホウ酸）中で5分間軽く振盪した。ゲルサイズに切った濾紙を6枚用意し、ブロッティング液A（0.02% SDS, 300mM Tris, 20%メタノール）、ブロッティング液B（0.02% SDS, 25mM Tris, 20%メタノール）、ブロッティング液Cにそれぞれ2枚ずつ浸し、15分間振盪した。また、PVDF膜（MILLIPORE社製）をゲルサイズに切り、メタノール中で10分間振盪後、ブロッティング液Cに15分間浸した。次に、セミドライ式ブロッティング装置（Bio-Rad社製）のマイナス極側から濾紙2枚（ブロッティング液C）、ゲル、PVDF膜、濾紙2枚（ブロッティング液 B）、濾紙2枚（ブロッティング液 A）の順に重ね、ゲル1cm2あたり2mAの定電流で50分間泳動し、タンパク質のPVDF膜への転写を行った。転写後のPVDF膜を超純水で軽く洗った後、ポンソーS染色液（0.1% Ponceau S, 5%酢酸）で5分間染色後、超純水で脱色した。目的のバンドの部分を切り取り、チューブ内に回収し乾燥させた。シーケンス解析は北海道大学グローバルファシリティセンター機器分析受託サービスに委託した。
　N末端アミノ酸配列を解析した結果，H2N-Glu-Ile-Lys-Thr-Asp-Tyr-Lys-Ala-Ser-Val-であることがわかった。
　βアミラーゼ遺伝子のクローニング
　βアミラーゼ遺伝子をPCRにより増幅した。鋳型には実験１に記載の方法で調製したNo.58株染色体DNA、プライマーには細菌βアミラーゼの中で高度に保存されている領域をもとに設計したフォワードプライマー（5’-GTNTGGTGGGGNTAYGTNGA-3’：配列番号５）とリバースプライマー（5’-GGRTTRTTCATYTGCCARTG-3’：配列番号６）を用いた。PCR 増幅はPrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用いて行い、温度サイクルは98℃ 10秒，55℃ 5秒，72℃ 50秒のサイクルを30サイクル行った。得られたPCR産物を、制限酵素であるEcoR Vで消化したpBluescript II SK（-）にライゲーションし、大腸菌に形質転換後した。2mlの2×TY培地(100μg/ml アンピシリンを添加)に植菌し、30℃で24 時間震盪培養した。形質転換後の大腸菌から、プラスミドを抽出し、シークエンス解析を行うことでプラスミド中にβアミラーゼ配列が含まれていることを確認した。この取得した遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、決定したβアミラーゼ遺伝子配列から設計したプライマーPS-F（5’-GGCAGCCCAGGTAATTTCTAC-3’：配列番号７）と、PS-R（5’-GGAGGGTTGACTTCACTCCA-3’：配列番号８）を用い、DIG（ジゴキシゲニン）標識プローブを合成した。No. 58株ゲノムDNAを、10種の制限酵素（Sac I, BamH I, Xba I, Sal I, Sph I, Hind III, Bgl II, Spe I, Nhe I, Xho I）と、取得した遺伝子中に切断サイトが存在するEcoR I，Kpn Iを、それぞれ組み合わせもので一晩消化させ、合成したプローブを用いたサザンブロット解析を行った。これより、約6.3kbのBgl II消化遺伝子断片に目的遺伝子全長が含まれていることが予想されたため、約 6.3kbの大きさに相当するBgl II消化遺伝子断片を回収し、BamH I制限酵素で消化したpBluescript II SK（-）にライゲーション後、大腸菌に形質転換した。目的遺伝子を含むプラスミドはプローブの作製時に使用したプライマーを用いたPCR法によるスクリーニングを行うことで取得した。取得したプラスミドは様々な制限酵素で消化し、pBluescript II SK（-）にサブクローニングした後、シークエンス解析を行った。
　シークエンス解析の結果を図５に示す。得られた配列は2536bpからなり（配列番号１１）、そのうち本遺伝子は、1,659bpからなるオープンリーディングフレーム（ORF）(配列番号１)から構成され、開始コドンの上流6bpにリボソーム結合部位(RBS)、上流56bp付近に-10領域、上流82bp付近に-35領域から構成されるプロモーター領域が存在することがわかった。
　推定されるアミノ酸配列を解析した結果、本遺伝子は552アミノ酸からなる前駆体タンパクとして合成されることがわかった（配列番号１２、対応する塩基配列は配列番号１）。決定したN末端領域のアミノ酸配列と完全に一致する配列が存在し、この配列から29アミノ酸からなるシグナル配列（図中下線で示す）が存在し、成熟型タンパクは523アミノ酸から構成され、アミノ酸配列から計算される分子量は59,403であることがわかった(配列番号２、対応する塩基配列は配列番号１３)。成熟型タンパクは、N末端領域にGlycoside hydrolase family 14（GH14）に分類される触媒ドメインと、C末端側にCarbohydrate-binding module 20（CBM20）に分類される基質結合ドメインから構成されることがわかった。
　実験４：βアミラーゼの諸性質の検討
　最適pHおよびpH安定性
　βアミラーゼの最適pHを決定するために、pH4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.2, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.75の50mMユニバーサルバッファー（マッケルベイン緩衝液）中で、pH以外は上記アミラーゼ活性測定と同様の方法で、精製酵素と基質とを反応させ酵素活性を測定した。また、pH安定性を確認するため、酵素溶液をpH3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.2, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.75の50mMユニバーサルバッファー中に加え、それぞれの混合溶液を、4℃で16時間静置した。この混合溶液を、100 mM Tris-HClバッファー（pH7.0）にて10倍希釈することでpHを7.0に戻した。これらの希釈混合溶液を、上記アミラーゼ活性測定と同様の方法で37℃にて10分間反応させることでその残存活性を測定した。pH最適性の測定結果を図６に、pH安定性に関する測定結果を図７に示す。図６、図７において、縦軸は測定された最大活性値を100%とした相対活性値である。図６より、pH7.0付近で本酵素は最大の活性を示した。図７より、本酵素はpH5.0～9.0の範囲で80%以上の残存活性を示すことが明らかとなった。
　最適温度および温度安定性
　βアミラーゼの最適温度を決定するため、酵素溶液を37～70℃の各温度で、温度以外は上記アミラーゼ活性測定と同様の方法で、10分間酵素溶液と基質とを反応させ酵素活性を測定した。また、温度安定性は、酵素溶液（20 mM Tris-HCl バッファー, pH 7.0）を37, 45, 50, 55, 60, 65, 70℃で30分処理後、冷却し、上記アミラーゼ活性測定と同様の方法で37℃にて10分反応させることでその残存活性を測定した。また、60℃および65℃については、処理時間のタイムコース（15，30，45，60，75分）を取り、その残存活性についてダイズβアミラーゼ、Brevibacillus sp. TMK-672株由来βアミラーゼ、Bacillus cereus由来βアミラーゼ、オオムギ由来βアミラーゼについても同様に測定し、結果を比較した。図８に最適温度の測定結果を、図９に60℃での各βアミラーゼの残存活性を、図１０に65℃での各βアミラーゼの残存活性を示した。図８は、測定された最大活性値を100%とした相対活性値を各温度に対して示した。図９、１０の処理時間のグラフでは、処理時間0分の値を100%としてそれぞれ相対値として示した。図８より、本酵素の最適温度が50℃付近であることが分かった。図９からは、大麦由来βアミラーゼ、Bacillus cereus由来βアミラーゼ、Brevibacillus sp. TMK-672株由来βアミラーゼの順に活性が低下し、耐熱性を有することで知られているダイズ由来βアミラーゼで60～80分の処理後に80%程度の残存活性を示した。一方、No. 58株由来βアミラーゼは、大豆由来βアミラーゼよりも優れた耐熱性を示し、本実験の熱処理後でも100%の残存活性を維持した。図１０より、65℃における熱処理は、30分の処理後の残存活性はダイズ由来酵素で25%程度、No. 58株由来酵素で40%程度となった。この数値から本発明のβアミラーゼは65℃でも大豆由来βアミラーゼ等に比べて優れた熱耐性を示すことが示された。
　生デンプン分解活性
　βアミラーゼの生デンプンに対する分解活性を比較するための実験を行った。生デンプンとしては、トウモロコシ由来の物及び小麦由来の物を用いた。各生デンプン1.0mg/mlを、20mM Tris-HClバッファー（pH 7.0）、5 mM CaCl2、酵素0.1μg/mlの存在下で反応させ、適量の反応液を0.4ml DNS溶液が入った試験管に添加することで反応を停止させ、実験１に記載の還元糖定量方法によって生デンプン分解活性を評価した。βアミラーゼとしては、本発明のβアミラーゼ、オオムギ由来のβアミラーゼ、大豆由来のβアミラーゼを各々用いた。オオムギ由来のβアミラーゼは、生デンプンの分解活性があることで知られ、大豆由来のβアミラーゼは生デンプンの活性は弱いが耐熱性が高いことで知られている。小麦由来デンプンは60℃、トウモロコシ由来のデンプンは70℃で反応させた。小麦由来デンプンに対する反応結果を図１１に、トウモロコシ由来デンプンに対する反応結果を図１２に示した。図１１より、小麦由来の生デンプンに対して、オオムギ由来のβアミラーゼ及び大豆由来のβアミラーゼも分解活性はほぼ見られなかったが、本発明のβアミラーゼは、生デンプンを24時間で65%分解した。図１２の結果も同様に、トウモロコシ由来生デンプンに対して、オオムギ由来のβアミラーゼ及び大豆由来のβアミラーゼは分解活性がほぼ見られなかったが、本発明のβアミラーゼは、生デンプンを8時間で27%分解した。これらの結果より、本酵素が、生デンプン分解活性が比較的高いオオムギ由来酵素が反応できないような高温条件で生デンプンを良好に分解した。また、温度安定性は高いが生デンプン分解活性が弱い大豆由来酵素は、生デンプンの分解は見られない。これらの結果より、No. 58株のβアミラーゼは、生デンプンを分解する能力が高く、その活性についても耐熱性が高いことが明らかとなった。
　実験５
　βアミラーゼ遺伝子の大腸菌における発現
　No. 58株由来のβアミラーゼ遺伝子を大腸菌内で異種発現させた。βアミラーゼ遺伝子を大腸菌において発現させるために、まずβアミラーゼ遺伝子のコード領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片を、βアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドを鋳型に、プライマーRBS-F（5’-CCGAGCTCCTCGAGGCGTTTGCTTAGGTTTACGTA-3’：配列番号９）およびexp-R（5’-CCCTGCAGGATCCTACCACTGTATTGTATAACTTG-3’：配列番号１０）を用いたPCRにて増幅した。増幅されたDNA断片をXho IとPst Iで切断し、同制限酵素で切断したpBluescript SK (-) に挿入してE. coli BL21 (DE3)を形質転換した。PCRの条件は実験３の方法と同様である。得られた形質転換体を、2mlの2×TY培地(100μg/ml アンピシリンを添加)に植菌し、30℃で24 時間振とう培養した。遠心分離（10,000rpm，2分，4℃）で菌体を回収し、1mlの20mM Tris-HClバッファー pH7.0，5mM CaCl2に懸濁後、Handy sonic disruptor UD1（トミー精工社製）を用い、30秒×４回のサイクルで超音波破砕した。破砕液を遠心分離（15,000rpm，10分，4℃）した上清を粗酵素として、アミラーゼ活性を測定したところ、可溶性デンプンを基質として還元糖の生成を確認した。TLCを用いて反応産物を検出したところ、マルトースのみであった。酵素活性は培養液1ml当たり55.1U/mlであった。
　実験６　βアミラーゼ遺伝子への部位特異的変異導入
　No. 58株由来のβアミラーゼ遺伝子に対して部位特異的変異導入を行い、変異酵素を作製、その酵素活性を測定した。
　βアミラーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、PCR-mega primer法にて行った。まず、βアミラーゼ遺伝子のコード領域とリボソーム結合部位を含むプラスミドを鋳型に、下記表４に示した４種の変異導入プライマー（配列番号１４～１７）とexp-Rプライマー（配列番号１０）を用い、「βアミラーゼ遺伝子のクローニング」と同様の方法でPCRを行いmega primerを得た。
次に、得られたmega primerとRBS-Fプライマー（配列番号９）、上記βアミラーゼ遺伝子のコード領域とリボソーム結合部位を含むプラスミドを鋳型に、同様の方法にてPCRを行うことで、変異が導入されたβアミラーゼ遺伝子全長を取得した。この遺伝子断片を実験５と同様の方法を用いることで発現プラスミドを構築し、それらをE. coli BL21 (DE3) 株に形質転換することで、βアミラーゼ変異酵素を生産する形質転換体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　得られた各形質転換体を実験５と同様の方法を用いて培養、菌体を破砕することで粗酵素を得た。この粗酵素に対して、実験２と同様の方法を用いて粗酵素を精製した。各変異酵素の精製結果を図１３に示す。
　これらの精製酵素に対して、「βアミラーゼの確認」と同様に温度安定性の評価を行った。各酵素試料をマイクロチューブに入れ、65℃で保温後、15、30、60分後にサンプリングし、氷上で冷却した。冷却後のサンプルの残存酵素活性を、還元糖生成量を定量することで測定し、獲得したアミラーゼの65℃での温度安定性を評価した。なお、コントロールとして未変異の精製酵素も同様に処理し温度安定性を評価した。この結果を図１４に示す。データは処理時間0分の値を100%として相対値で示した。図１４のwtは本発明のNo. 58株のβアミラーゼ、T4P,T15K,T15R,Q306Dはそれぞれ変異酵素を表す（例えば、T4Pの場合、配列番号２の4番目のアミノ酸残基TがPに変異していることを示す）。
　60分後の残存活性は，変異前のβアミラーゼが37.7%であるのに対して、T4Pは80.9%，Q306DEは50.1%，T15Kは44.4%，T15Rは44.2%となり、得られた変異酵素は変異前のβアミラーゼと比較して熱安定性が向上していることが明らかとなった。
　なお、得られた４種の形質転換体が有するβアミラーゼ変異酵素は、それぞれ配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号4位のトレオニンがプロリンへ変わる変異(配列番号１８:図１４のT4P)、又はアミノ酸番号15位のトレオニンがリシンへ変わる変異(配列番号１９:図１４のT15K)、又はアミノ酸番号15位のトレオニンがアルギニンへ変わる変異(配列番号２０:図１４のT15R)、又はアミノ酸番号306位のグルタミンがアスパラギン酸へ変わる変異(配列番号２１:図１４のQ306D)を有している。

Claims (26)

  1. 　(i) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は
    (ii) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列又は
    (iii) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
    からなるβアミラーゼ。
  2. 　(i) 配列番号２又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は
    (ii) 配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列又は
    (iii) 配列番号１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβアミラーゼ。
  3. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照してアミノ酸番号4位に対応する位置にあるトレオニンがプロリンへの置換、又はアミノ酸番号15位に対応する位置にあるトレオニンがリシン若しくはアルギニンへの置換、又はアミノ酸番号306位に対応する位置にあるグルタミンがアスパラギン酸への置換から選ばれる１つ以上の置換を含む、請求項１に記載のβアミラーゼ。
  4. 　(i) 配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列又は
    (ii) 配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列又は
    (iii) 配列番号１８～配列番号２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
    からなる請求項３に記載のβアミラーゼ。
  5. 　βアミラーゼ活性が60℃、10分間の熱処理で、加熱処理していないβアミラーゼと比較して最低80%の活性が残る、請求項１～４のいずれか１つに記載のβアミラーゼ。
  6. 　生デンプン分解活性を有する、請求項１～５のいずれか１つに記載のβアミラーゼ。
  7. 　60℃で生デンプン分解活性を有する、請求項１～６のいずれか１つに記載のβアミラーゼ。
  8. 　分解産物としてマルトースのみを生じる、請求項１～７のいずれか１つに記載のβアミラーゼ。
  9. 　受託番号NITE BP-02937で特定される細菌により産生されるβアミラーゼ。
  10. 　請求項１～４のいずれか１つに記載のβアミラーゼをコードするDNA。
  11. 　βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
    (i)配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列
    (ii)配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列と90%以上同一の塩基配列
    のいずれかを有するDNA、又は
    (iii) (i)又は(ii)で表される塩基配列で表されるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA。
  12. 　βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
    (i)配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列
    (ii)配列番号１で表される塩基配列と90%以上同一の塩基配列
    のいずれかを有するDNA、又は
    (iii) (i)又は(ii)で表される塩基配列で表されるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA。
  13. 　βアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記DNAが、
    (i)配列番号２６～配列番号３３のいずれか１つに記載の塩基配列又は
    (ii) 配列番号２６～配列番号３３のいずれか１つに記載の塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを有するDNA、又は
    (iii) (i)又は(ii)で表される塩基配列で表されるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA。
  14. 　配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列と95%以上同一の塩基配列を有する、請求項１１又は１３に記載のDNA。
  15. 　配列番号１又は配列番号１３で表される塩基配列と99%以上同一の塩基配列を有する、請求項１１、１３又は１４に記載のDNA。
  16. 　配列番号１、配列番号１３及び配列番号２６～３３で表される塩基配列の縮重配列からなるDNA。
  17. 　請求項１０～１６のいずれか１つに記載のDNAを有するベクター。
  18. 　請求項１７に記載のベクターを有する微生物。
  19. 　受託番号NITE BP-02937で特定される細菌。
  20. 　請求項１８または１９に記載の微生物を培養して、培養物からβアミラーゼを抽出する工程を含む、βアミラーゼの製造方法。
  21. 　請求項１～９のいずれか１つに記載のβアミラーゼでデンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法。
  22. 　デンプンの温度が60℃以上70℃以下で請求項５、８又は９に記載のβアミラーゼを添加することを特徴とする、請求項２１に記載のマルトースの製造方法。
  23. 　請求項１８または１９に記載の微生物でデンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法。
  24. 　請求項６～９のいずれか１つに記載のβアミラーゼで生デンプンを処理することを特徴とする、マルトースの製造方法。
  25. 　請求項１～９のいずれか１つに記載のβアミラーゼ、または請求項１８または１９に記載の微生物を用いる、食品の改質方法。
  26. 　請求項１～７のいずれか１つに記載のβアミラーゼ、または請求項１８または１９に記載の微生物を含む酵素剤。
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