KR20120052263A - β?아밀라제를 이용한 식품의 개질 방법 - Google Patents

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마사미치 오카다
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아마노 엔자임 가부시키가이샤
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Abstract

실용성이 우수한 신규 β-아밀라제를 발견하여, 그 실용적인 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류 또는 올리고당류를 포함하는 식품에 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법을 제공한다.

Description

β?아밀라제를 이용한 식품의 개질 방법{METHOD FOR IMPROVEMENT OF FOODS UTILIZING β-AMYLASE}
본 발명은 신규한 β-아밀라제의 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 미생물 유래의 신규 β-아밀라제의 식품 분야에서의 적용에 관한 것이다.
본 출원은 2009년 7월 17일자에 출원된 일본국 특허 출원 제2009-168550호에 따른 우선권을 주장하며, 해당 특허 출원의 전체 내용은 참조에 의해 원용된다.
종래, β-아밀라제는 대두, 밀, 보리, 맥아, 고구마, 감자 등의 식물로부터 기원된 것으로서 알려져 있었다. 특히, 대두, 밀, 보리, 맥아 등의 곡류로부터 추출 및 정제된 β-아밀라제가 제당 산업, 제빵 산업 및 양조 산업에서 사용되는 말토스 함유 시럽의 제조 등에 널리 공업적으로 사용되고 있다. 식물 기원의 β-아밀라제들 중에서, 대두 유래의 것이 효소 활성이 높고, 내열성도 우수하다.
그런데, 최근, 바이오에탄올의 수요 확대로 인해 옥수수의 가격이 상승하고 있다. 이러한 영향으로 농작물도 대두나 밀에서 옥수수로 이동되고 있다. 그래서, 대두, 밀, 보리 등의 제품이 부족하게 되어 이의 가격은 상승하게 되고, 따라서 β-아밀라제의 원료 확보도 어려운 상황이다.
β-아밀라제는, 전분, 글리코겐 등 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류에 작용하여, 비환원성 말단으로부터 말토스 단위로 분해하는 효소이다. β-아밀라제는 오래 전부터 대두나 맥류 등 고등 식물에서 그 존재가 확인되어 왔다. 1972년에 미생물에서 고등 식물 β-아밀라제와 동일한 작용 기전을 나타내는 효소의 존재가 발표된 이후로, β-아밀라제 생산균으로서 다수의 미생물들이 발견되었다(비특허문헌 1).
지금까지 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 폴리믹서(Bacillus polymyxa), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 등의 바실러스 속, 또는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)이나 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 등이 β-아밀라제를 생산하는 균으로서 보고되었다. 그러나, 그 대부분은 생산성이 낮고, 실용화에 도달한 것은 적은 편이다.
한편, 아스퍼질러스 속 등의 사상균으로부터 생산되는 아밀라제는 아밀로스나 아밀로펙틴을 엔도형(endo-type)으로 분해시킨다. 따라서, 상기 아밀라제를 사용하면, 말토스 이외의 글루코스, 말토트리오스 및 그 외의 올리고당이 주로 생성된다. 또한, 상기 아밀라제는 내열성도 낮고, 말토스 생산용으로서의 실용성도 낮다.
바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)는 내열성이 높은 말토스 생성 효소를 생산한다(특허문헌 1, 비특허문헌 2). 이 효소는 전분의 비환원성 말단으로부터 엑소-형의 말토스를 생성시키지만, 생성되는 말토스는 α형이다. 또한, 이 효소는 식물 기원의 β-아밀라제와 같이 엄밀하게 말토스 단위로 가수분해하지 않으며, 반응 초기에는 말토테트라오스(G4), 말토트리오스(G3) 및 말토스(G2) 외에도 소량의 말토펜타오스(G5)나 말토헥사오스(G6)를 생성시키며, 샤딩거(Shardinger) 덱스트린을 말토스와 글루코스로 분해하며, 말토트리오스를 말토스와 글루코스로 분해하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 이 효소에 의한 전분 분해물에는 글루코스가 6?8%로 포함되게 된다. 이에, 상기 효소는 고순도의 말토스 시럽의 제조에는 적합하지 않다.
일본 특허출원 공개번호 소 60-2185호 공보
Handbook of Industrial Carbohydrate Enzymes, Kodansha Scientific Ltd., 1999 H. Outtrup, B. E. Norman, et al., Starch, Vol. 12, pp. 405 to 411
전술한 바와 같이, 현재 β-아밀라제의 주류인 식물 기원의 β-아밀라제는 안정적인 공급이 어렵다. 또한, 식물로부터 얻어지는 효소량은 정해져 있어, 생산량이 제한적이다. 한편, 미생물 유래의 β-아밀라제는, 생산성이 낮거나 대량 배양이 어렵기 때문에, 실용화에 성공한 것은 적은 편이다. 이에, 본 발명은 실용성이 우수한 신규한 β아밀라제를 발견하고, 이의 실용적인 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 감안하여 예의 검토를 거듭하였다. 그 결과, 고초균인 바실러스 플렉서스(Bacillus flexus)가 대두 유래의 β-아밀라제에 필적하는 내열성을 가진 β-아밀라제를 생산함을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 상기 β-아밀라제의 분리 및 정제와, 그 효소의 화학적 성질 결정에 성공하였다. 또한, 상기 β-아밀라제를 코딩하는 유전자의 염기 서열 결정에도 성공하였다. 아울러, 상기 유전자를 포함한 벡터가 도입된 형질전환체를 사용하여 β-아밀라제를 제조하는 것도 가능함을 확인하였다. 한편, 상기 β-아밀라제의 용도를 검토한 결과, 식재료의 제조나 식품의 개질에 유용한 것으로 확인되었다.
본 발명은 상기한 성과에 따라 완성된 것으로, 다음과 같다.
[1] 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류 또는 올리고당을 포함하는 식품에 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 식품의 개질 방법.
[2] 식품이 빵류 내지 빵류 반죽, 떡 내지 떡 과자(rice cake sweet), 및 취반미(steamed rice) 내지 취반미 가공품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한가지 식품인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 식품의 개질 방법.
[3] β-아밀라제가 하기의 효소 화학적 성질을 구비한 β-아밀라제인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2]에 기재된 식품의 개질 방법,
(1) 작용: 다당류 및 올리고당류의 α-1,4 글루코시드 결합에 작용하여 말토스를 유리시킴,
(2) 기질 특이성: 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에는 양호하게 작용하나, 풀룰란(pullulan), 덱스트란, 사이클로덱스트린, 말토트리오스에는 작용하지 않음,
(3) 지적 온도(optimum temperature): 약 55℃,
(4) 지적 pH: 약 8.0,
(5) 온도 안정성: 55℃ 이하에서 안정적임(pH 5.0에서 10분간),
(6) pH 안정성: pH 4?9에서 안정적임(30℃에서 3시간),
(7) 분자량: 약 60,000(SDS-PAGE).
[4] β-아밀라제가 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 등가의 아미노산 서열을 가지는 β-아밀라제인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2]에 기재된 식품의 개질 방법.
[5] 상기 등가의 아미노산 서열이 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열인, [4]에 기재된 식품의 개질 방법.
[6] β-아밀라제에 추가하여 다른 효소도 작용시키는 것을 특징으로 하는, [1] ? [5] 중 어느 한 항에 기재된 식품의 개질 방법.
[7] 상기 다른 효소가 리파제, 포스포리파제, 글루코스 옥시다제, 자일라나제, 프로테아제, 트랜스글루타미나제, 프로테인글루타미나제, 탈분지 효소(debranching enzyme), 풀룰라나제(pullulanase), 이소아밀라제, α-아밀라제, 글루코아밀라제 및 말토제닉α-아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는, [6]에 기재된 식품의 개질 방법.
[8] [1] ? [7] 중 어느 한 항에 기재한 개질 방법에 따라 개질된 식품.
[9] [3] ? [5] 중 어느 한 항에 있어서 정의된 β-아밀라제와, 다른 효소를 배합하여 이루어진 효소 조성물.
[10] 상기 다른 효소가 리파제, 포스포리파제, 글루코스옥시다제, 자일라나제, 프로테아제, 트랜스글루타미나제, 프로테인글루타미나제, 탈분지 효소, 풀룰라나제, 이소아밀라제, α-아밀라제, 글루코아밀라제 및 말토제닉α-아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는, [9]에 기재된 효소 조성물.
[도 1] 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 지적 온도를 나타낸 그래프이다.
[도 2] 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 지적 pH를 나타낸 그래프이다. ●: 구연산 완충액 pH 2, 3, 4, □: 브리튼-로빈슨 완충액 pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.
[도 3] 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 온도 안정성을 나타낸 그래프이다.
[도 4] 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다. ●: 구연산 완충액 pH 2, 3, 4, □: 브리튼-로빈슨 완충액 pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.
[도 5] 정제된 β-아밀라제 및 정제 중인 샘플의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다. 레인 1: 암모늄 설페이트 분획, 레인 2: HiPrepButyl 16/10 FF, 레인 3: HiTrap CM FF, 레인 4: HiLoad 16/60 Superdex200.
[도 6] 발현 플라스미드 pET-BAF의 구조.
[도 7] 말토스 생성량을 비교하여 나타낸 그래프이다. 3종의 β-아밀라제(바실러스 플렉서스 유래, 보리 유래, 밀 유래)의 말토스 생성량을 비교하여 나타낸다.
[도 8] 말토스 생성량을 비교하여 나타낸 그래프이다. 2종의 β-아밀라제(바실러스 플렉서스 유래, 대두 유래)의 말토스 생성량을 비교하여 나타낸다.
[도 9] β-아밀라제의 노화 방지 효과를 나타낸 그래프이다. β-아밀라제가 첨가된 떡(餠, rice cake)을 25℃(좌측), 15℃(중앙), 4℃(우측)에서 보존하여, 경화 억제 효과를 조사하였다.
(용어)
본 발명에서 「단백질을 코딩하는 DNA」는 그것을 발현시켰을 때 상기 단백질을 수득할 수 있게 하는 DNA, 즉 상기 단백질의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 DNA를 말한다. 따라서, 코돈의 축중(degeneracy)도 고려된다.
본 명세서에서 용어 「분리된」은 「정제된」과 상호 호환적으로 사용된다. 본 발명의 효소(β-아밀라제)와 관련하여 사용되는 경우의 「분리된」은, 본 발명의 효소가 천연 재료로부터 유래하는 경우, 상기 천연 재료에 상기 효소 이외의 성분을 실질적으로 포함하지 않는(특히 협잡 단백질을 실질적으로 포함하지 않음) 상태를 말한다. 구체적으로, 예를 들면, 본 발명의 분리된 효소내에, 협잡 단백질의 함유량은 중량 환산으로 전체의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 또한 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1% 미만이다. 한편, 본 발명의 효소가 유전공학적 방법에 따라 제조되는 경우, 용어 「분리된」은, 사용된 숙주 세포로부터 유래되는 다른 성분이나 배양액 등이 실질적으로 포함되어 있지 않은 상태를 말한다. 구체적으로, 예를 들면, 본 발명의 분리된 효소내 협잡 성분의 함유량은 중량 환산으로 전체의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 또한 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1% 미만이다. 그리고, 이와 다른 의미인 것이 명확하지 않은 한, 본 명세서에서 단순히 「β-아밀라제」로 기재하는 경우에는, 「분리된 상태의 β-아밀라제」를 의미한다. β-아밀라제 대신 사용되는 용어 「본 효소」에 대해서도 동일하게 적용된다.
DNA에 대해 사용되는 경우의 「분리된」은, 본래 천연에 존재하고 있는 DNA의 경우에는, 전형적으로는, 천연 상태에서 공존하는 그 외의 핵산으로부터 분리된 상태인 것을 말한다. 단, 천연 상태에서 인접한 핵산 서열(예, 프로모터 영역의 서열이나 터미네이터 서열 등) 등의 일부의 다른 핵산 성분을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 경우, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, 천연 상태에서 공존하는 다른 DNA 성분을 실질적으로 포함하지 않는다. 한편, cDNA 분자 등의 유전공학적 방법에 따라 제조되는 DNA의 경우, 「분리된」 상태는, 바람직하게는, 세포 성분이나 배양액 등을 실질적으로 포함하지 않는다. 마찬가지로, 화학 합성에 의해 제조되는 DNA의 경우, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, dNTP 등의 전구체(원재료)나 합성 과정에 사용되는 화학물질 등을 실질적으로 포함하지 않는다. 그리고, 이와 다른 의미를 나타내는 것이 명확하지 않은 한, 본 명세서에서 단순히 「DNA」라고 기재한 경우에는 분리된 상태의 DNA를 의미한다.
(β-아밀라제 및 그 생산균)
본 발명의 제1 측면은 β-아밀라제(이하, 「본 효소」로도 지칭됨) 및 그 생산균을 제공한다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 바실러스 플렉서스가 내열성 β-아밀라제를 생산하는 것을 발견하였다. 또한, 상기 β-아밀라제의 분리 및 생산에 성공하였고, 아래에 나타낸 바와 같이, 이의 효소 화학적 성질 결정에도 성공하였다.
(1) 작용
본 효소는 β-아밀라제이며, 다당류 및 올리고당류의 α-1,4 글루코시드 결합에 작용하여 말토스를 유리시킨다. 글루코스는 거의 유리되지 않는다.
(2) 기질 특이성
본 효소는 기질 특이성이 우수하여 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에 양호하게 작용한다. 이에 비해, 풀룰란, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 말토트리오스에는 작용하지 않는다. 가용성 전분을 기질로 사용하는 경우의 활성을 기준(100%)으로 하였을 때의 상대 활성이 50% 이상이면, 「본 효소가 양호하게 작용하는 기질」로 판단된다. 마찬가지로, 상대 활성이 10% 미만이면, 「본 효소가 작용하지 않은 기질」로 판단된다. 본 효소는 말토트리오스 및 사이클로덱스트린(α, β 또는 γ)에 대한 실질적인 작용을 가지고 있지 않다. 그리고, 본 효소의 반응성 및 기질 특이성은 후술하는 실시예에 나타낸 방법(β-아밀라제 활성 측정 방법 (1))으로 측정 및 평가할 수 있다.
(3) 지적 온도
본 효소의 지적 온도는 약 55℃이다. 본 효소는 약 50℃ ? 약 60℃에서 높은 활성을 나타낸다. 지적 온도는 후술하는 β-아밀라제 활성 측정법(0.1 M 인산-염산 완충액(pH 5.0) 중에서)에 따른 측정으로 산출된 값이다.
(4) 지적 pH
본 효소의 지적 pH는 약 8.0이다. 본 효소는 pH 약 6.0 ? 약 9.0에서 높은 활성을 나타낸다. 지적 pH는, 예를 들면, pH 2?4의 pH 범위의 구연산 완충액 중에서, pH 4?11의 pH 범위의 경우에는 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 측정한 결과를 기초로 판단한다.
(5) 온도 안정성
본 효소는 대두 유래의 β-아밀라제에 필적하는 우수한 내열성을 나타낸다. 10 mM 아세트산 칼슘이 포함된 0.1 M 아세트산-염산 완충액(pH 5.0) 중에서 55℃ 조건으로 10분간 처리하였을 때에도 본 효소는 90% 이상의 활성을 유지한다.
(6) pH 안정성
본 효소는 pH 4?9라는 넓은 pH 범위에서 안정된 활성을 나타낸다. 즉, 처리에 제공되는 효소 용액의 pH가 이 범위내에 있으면, 30℃에서 3시간 처리 후, 최대 활성의 70% 이상의 활성을 나타낸다. 지적 pH는, 예를 들면, pH 2?4의 pH 범위의 경우 구연산 완충액 중에서, pH 4?11의 범위의 경우에는 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 측정한 결과를 바탕으로 판단된다.
(7) 분자량
본 효소의 분자량은 약 60,000(SDS-PAGE에 따름)이다.
본 효소는 바람직하게는 바실러스 플렉서스(Bacillus flexus)로부터 유래되는 β-아밀라제이다. 여기서 「바실러스 플렉서스로부터 유래되는 β-아밀라제」는, 바실러스 플렉서스로 분류되는 미생물(야생주 또는 변이주일 수 있음)에 의해 생산되는 β-아밀라제, 또는 바실러스 플렉서스(야생주 또는 변이주일 수 있음)의 β-아밀라제 유전자를 이용하여 유전공학적 방법에 따라 얻어진 β-아밀라제를 의미한다. 따라서, 바실러스 플렉서스로부터 취득한 β-아밀라제 유전자(또는 상기 유전자를 변형한 유전자)를 도입한 숙주 미생물에 의해 생산되는 재조합체도, 「바실러스 플렉서스로부터 유래되는 β-아밀라제」에 해당된다.
본 효소가 유래된 바실러스 플렉서스를, 설명의 편의상, 본 효소의 생산균이라고 한다. 본 효소의 생산균의 예로서, 후술하는 실시예에 나타낸 바실러스 플렉서스 DSM1316(DSMZ, 독일), DSM1320(DSMZ, 독일), DSM1667(DSMZ, 독일), APC9451을 들 수 있다. APC9451 주는 이하 소정의 기탁 기관에 기탁되어, 용이하게 입수 가능하다.
기탁 기관: NITE 바이오테크놀러지 본부 특허 미생물 기탁 센터(우편번호 292-0818 일본 지바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)
기탁일(수령일): 2008년 4월 9일
수탁 번호: NITE BP-548
이상과 같이, 취득에 성공한 본 효소의 성질과 상태에 대한 상세한 내용이 명확해졌다. 그 결과, 본 효소가 내열성과 기질 특이성이 우수한 것으로 판명되었다. 따라서, 본 효소는 식품 가공 및 당화 용도에 적절하다.
본 발명자들이 추가로 검토한 결과로서, 바실러스 플렉서스에 의해 생산되는 β-아밀라제의 아미노산 서열(서열번호 7)이 결정되었다. 이에, 본 발명의 일 태양은, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 구성되는 것이 특징적이다. 여기서, 일반적으로, 어떤 단백질의 아미노산 서열의 일부에 변형을 가할 경우, 변형을 가한 후의 단백질이 변형 전의 단백질과 동등한 기능을 가지는 경우가 있다. 즉, 아미노산 서열의 변형이 단백질의 기능에 실질적인 영향을 주지 않으며, 단백질의 기능이 변형 전후에 유지될 수 있다. 이에 본 발명은 다른 양태로서 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열과 등가의 아미노산 서열로 이루어지며 β-아밀라제 활성을 가진 단백질(이하, 「등가 단백질」이라 함)을 제공한다. 여기서의 「등가의 아미노산 서열」이란, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열과 일부 상이하지만 이러한 상이가 단백질의 기능(여기서는 β-아밀라제 활성)에 실질적인 영향을 부여하지 않는 아미노산 서열을 지칭한다. 「β-아밀라제 활성을 가진다」란, 전분, 글리코겐 등의, 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류나 올리고당류에 작용하여, 비환원성 말단로부터 말토스 단위로 분해하는 활성을 의미하나, 이러한 활성의 정도는 β-아밀라제로서의 기능을 발휘할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 단, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일한 수준 또는 그보다 높은 수준인 것이 바람직하다.
「아미노산 서열의 일부 상이」란, 전형적으로는, 아미노산 서열을 구성하는 1 내지 수개의 아미노산의 결실, 치환, 또는 1 내지 수개의 아미노산의 부가, 삽입 또는 이들 조합에 의해, 아미노산 서열에 변이(변화)가 생긴 것을 의미한다. 여기서, 아미노산 서열의 상이는 β-아밀라제 활성이 유지되는 한 허용된다(활성에 다소의 변동이 있을 수 있음). 이러한 조건을 만족시키는 한, 아미노산 서열이 상이한 위치는 특별히 한정되지 않으며, 또한 복수의 위치에서 상이가 있을 수도 있다. 여기에서 복수는, 예를 들면, 전체 아미노산의 약 30% 미만에 해당되는 수이며, 바람직하게는 약 20% 미만에 해당되는 수이며, 보다 바람직하게는 약 10% 미만에 해당되는 수이며, 보다 더 바람직하게는 약 5% 미만에 해당하는 수이며, 가장 바람직하게는 약 1% 미만에 해당되는 수이다. 즉, 등가 단백질은, 서열번호 7의 아미노산 서열과, 예를 들면, 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 동일성을 가진다.
바람직하게는, β-아밀라제 활성에 필수가 아닌 아미노산 잔기에 보존적인 아미노산 치환을 수행함으로써, 등가 단백질을 수득한다. 여기서, 「보존적인 아미노산 치환」은, 어떤 아미노산 잔기를 비슷한 성질의 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 아미노산 잔기는 측쇄에 따라 알칼리성 측쇄(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소루신), 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)과 같이, 몇개의 패밀리로 분류되어 있다. 보존적인 아미노산 치환은, 바람직하게는, 동일한 패밀리에 속하는 아미노산 잔기간의 치환이다.
「등가 단백질」은 부가적인 성질을 가질 수도 있다. 그러한 성질로서, 예컨대, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질에 비해 안정성이 우수한 성질, 저온 및/또는 고온에서만 상이한 기능을 발휘하는 성질, 지적 pH가 상이한 성질 등을 들 수 있다.
여기서, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산(이하, 이들을 포괄하는 용어로서 「2개의 서열」이 사용됨)의 동일성(%)은, 예를 들면, 이하의 단계에 의해 결정할 수 있다. 먼저, 최적 비교가 가능하도록 2개의 서열을 정렬시킨다(예, 제1 서열에 갭을 도입하여 제2 서열과의 정렬을 최적화할 수도 있음). 제1 서열의 특정 위치의 분자(아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드)가, 제2 서열의 대응하는 위치의 분자와 동일하다면, 그 위치의 분자가 동일하다고 할 수 있다. 2개의 서열의 동일성은, 그 2개의 서열에 공통되는 동일 위치의 수에 대한 함수이며(즉, 동일성(%) = 동일 위치의 수/위치의 총 수 x 100), 바람직하게는, 정렬의 최적화에 필요한 갭의 수와 크기도 고려된다. 2개의 서열 간의 비교와 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 실현 가능하다. 서열의 비교에 이용가능한 수학적 알고리즘의 구체예로서는 Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68에 기재된 것과, Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77에 기재된 변조된 알고리즘이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 알고리즘은, Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에 기재된 NBLAST 프로그램 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 내장되어 있다. 본 발명의 핵산 분자에 대한 등가의 뉴클레오티드 서열을 입수하기 위해서는, 예를 들면, NBLAST 프로그램으로 score = 100, wordlength = 12로서 BLAST 뉴클레오티드 검색을 행하면 된다. 본 발명의 폴리펩티드 분자에 대한 등가의 아미노산 서열을 입수하기 위해서는, 예를 들면, XBLAST 프로그램으로 score = 50, wordlength = 3으로서 BLAST 폴리펩티드 검색을 행하면 된다. 비교를 위한 갭 정렬을 수득하기 위해서는, Altschul 등 (1997) Amino Acids Research 25(17): 3389-3402에 기재된 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST를 이용하는 경우, 대응되는 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 상세하게는, http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조할 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용가능한 다른 수학적 알고리즘의 예로는, Myers 및 Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17에 기재된 알고리즘이 있다. 이와 같은 알고리즘은, 예컨대, GENESTREAM 네트워크 서버(IGH Montpellier, 프랑스) 또는 ISREC 서버에서 이용가능한 ALIGN 프로그램에 내장되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, 예컨대 PAM120 잔기 질량표를 사용하고, 갭길이 패널티=12, 갭 패널티=4로 할 수 있다.
2개의 아미노산 서열 간의 동일성은, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 이용하고, 갭 가중 = 12, 10, 8, 6 또는 4, 갭 길이 가중 = 2, 3 또는 4에서 결정할 수 있다. 또한, 2개의 핵산 서열의 상동성은, GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 이용가능함)의 GAP 프로그램을 사용하여, 갭 가중 = 50, 갭 길이 가중 = 3에서 결정할 수 있다.
본 효소는 보다 큰 단백질(예, 융합 단백질)의 일부일 수도 있다. 융합 단백질에 부가되는 서열로는, 예컨대, 다중 히스티딘 잔기와 같이 정제에 유용한 서열, 재조합 생산시 안정성을 확보하기 위한 부가 서열 등을 들 수 있다.
상기 아미노산 서열을 포함하는 본 효소는 유전공학적 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 본 효소를 코딩하는 DNA로 적정 숙주 세포(예, 대장균)를 형질전환시키고, 형질전환체내에서 발현된 단백질을 회수함으로써, 제조할 수 있다. 회수된 단백질은 목적에 따라 적절하게 정제된다. 이와 같이 재조합 단백질로서 본 효소를 수득한다면, 여러가지 수식(modification)도 가능하다. 예를 들면, 본 효소를 코딩하는 DNA와 다른 적절한 DNA를 동일한 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 이용하여 재조합 단백질을 생산함으로써, 임의의 펩티드 내지 단백질이 연결된 재조합 단백질로 구성된 본 효소를 수득할 수 있다. 또한, 당쇄 및/또는 지방질의 부가, 또는 N 말단 또는 C 말단의 프로세싱이 이루어지는 등의 수식이 행해질 수도 있다. 이상과 같은 수식에 의해, 재조합 단백질의 추출, 정제의 간편화 또는 생물학적 기능의 부가 등이 가능하다.
(β-아밀라제를 코딩하는 DNA)
본 발명의 제2 측면은 본 효소를 코딩하는 유전자, 즉 신규한 β-아밀라제 유전자를 제공한다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함한다. 상기 태양의 구체예는 서열번호 6에 나타낸 염기 서열로 구성된 DNA이다.
그런데, 일반적으로, 어떤 단백질을 코딩하는 DNA의 일부에 변형을 가한 경우, 변형을 가한 후의 DNA에 의해 코딩되는 단백질이, 변형 전의 DNA에 의해 코딩되는 단백질과 동등한 기능을 가질 수 있다. 즉, DNA 서열의 변형이 코딩되는 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않으며, 코딩되는 단백질의 기능이 변형 전후에 유지될 수 있다. 이에 본 발명은 다른 양태로서, 서열번호 6에 나타낸 염기 서열과 등가의 염기 서열을 포함하며, β-아밀라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA(이하, 「등가 DNA」라 함)를 제공한다. 여기서의 「등가의 염기 서열」은, 서열번호 6에 나타낸 핵산과 일부 상이하지만, 이러한 상이가 그로부터 코딩되는 단백질의 기능(여기서는 β-아밀라제 활성)에 실질적인 영향을 미치지 않는 염기 서열을 말한다.
등가 DNA에 대한 구체예는, 서열번호 6에 나타낸 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대해 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA이다. 여기서 「엄격 조건」은, 이른바 특이적인 하이브리드는 형성되고, 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 말한다. 이와 같은 엄격 조건은, 당업자에게 공지된 것으로서, 예를 들면, Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)나 Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)을 참조하여 설정할 수 있다. 엄격 조건으로는, 예컨대, 혼성화 용액(50% 포름아미드, 10x SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 사이트레이트, pH 7.0), 5x 덴하트(Denhardt) 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA, 50 mM 인산 버퍼(pH7.5)를 사용하여, 약 42℃ 내지 약 50℃에서 인큐베이션한 다음, 0.1x SSC, 0.1% SDS를 사용하여 약 65℃ 내지 약 70℃에서 세정하는 조건을 들 수 있다. 또한, 바람직한 엄격 조건으로는, 예를 들면, 혼성화 용액으로서 50% 포름아미드, 5x SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 사이트레이트, pH 7.0), 1x 덴하트 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA, 50 mM 인산 버퍼(pH7.5)를 사용하는 조건을 들 수 있다.
등가 DNA에 대한 다른 구체예로서, 서열번호 6에 나타낸 염기 서열을 기준으로 1 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 염기 서열로 구성되며, β-아밀라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 염기의 치환이나 결실 등은 복수의 부위에서 이루어질 수도 있다. 여기에서 「복수」는, 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 입체 구조에서의 아미노산 잔기의 위치나 종류에 따라 상이하지만, 예를 들면, 2 내지 40개의 염기, 바람직하게는 2 내지 20개의 염기, 보다 바람직하게는 2 내지 10개의 염기이다. 이상과 같은 등가 DNA는, 예컨대, 제한 효소 처리, 엑소뉴클레아제나 DNA 리가제 등에 의한 처리, 위치 지정 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), 또는 랜덤 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 따른 변이 도입 등을 이용하여, 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하도록, 서열번호 6에 나타낸 염기 서열을 포함하는 DNA를 변형시킴으로써, 수득할 수 있다. 또한, 자외선 조사 등 다른 방법에 의해서도 등가 DNA를 수득할 수 있다.
등가 DNA의 또다른 예로서, SNP(1 염기다형)로 대표되는 다형에 기인하여 상기와 같은 염기의 상이가 인정되는 DNA를 들 수 있다.
본 발명의 유전자는, 본 명세서 또는 첨부된 서열목록에 개시된 서열 정보를 참고하여, 표준적인 유전공학적 방법, 분자 생물학적 방법, 생화학적 방법 등을 사용함으로써 분리된 상태로 제조할 수 있다. 구체적으로, 적절한 바실러스 플렉서스의 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리, 또는 바실러스 플렉서스의 균체내 추출액으로부터, 본 발명의 유전자에 특이적으로 혼성화가능한 올리고 뉴클레오티드 프로브 및 프라이머를 적절하게 이용하여 제조할 수 있다. 올리고 뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는, 시판 중인 자동화 DNA 합성 장치 등을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다. 그리고, 본 발명의 유전자를 제조하기 위해 사용되는 라이브러리의 제작 방법에 대해서는, 예를 들면, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있다.
예를 들면, 서열번호 6에 나타낸 염기 서열을 포함하는 유전자는, 상기 염기 서열 또는 그 상보 서열의 전체 또는 일부를 프로브로 한 혼성화 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 일부에 특이적으로 혼성화하도록 디자인된 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응(예, PCR)을 이용하여 증폭 및 분리할 수 있다. 또한, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열이나 서열번호 6에 나타낸 염기 서열의 정보를 토대로 하여, 화학 합성에 의해 목적 유전자를 수득할 수도 있다(참고 문헌: Gene, 60(1), 115-127 (1987)).
이하, 본 발명의 유전자의 취득 방법에 대한 구체예를 나타낸다. 먼저, 바실러스 플렉서스로부터 본 효소(β-아밀라제)를 분리 및 정제하고, 이의 부분 아미노산 서열 정보를 수득한다. 부분 아미노산 서열의 결정 방법으로, 예를 들면, 정제된 β-아밀라제를 직접 통상적인 방법에 따른 에드만 분해법[저널 오브 바이오로지칼 케미스트리, 제256권, 제7990?7997 페이지(1981)]에 의해 아미노산 서열 분석[단백질 서열분석기-476A, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사제 등]에 제공한다. 단백질 가수분해 효소의 작용에 의해 제한적인 가수분해를 수행하여, 얻어진 펩티드 단편을 분리 및 정제하고, 얻어진 정제 펩티드 단편에 대해 아미노산 서열 분석을 행하는 것이 유효하다.
이렇게 수득한 부분 아미노산 서열 정보를 기초로 β-아밀라제 유전자를 클로닝한다. 예를 들면, 혼성화 방법 또는 PCR을 이용하여 클로닝을 행할 수 있다. 혼성화 방법을 이용하는 경우, 예를 들면, Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
PCR 방법을 이용하는 경우, 이하의 방법을 이용할 수 있다. 먼저, β-아밀라제를 생산하는 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 부분 아미노산 서열의 정보를 기초로 디자인한 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행하여, 목적 유전자 단편을 수득한다. PCR 방법은, PCR 테크놀로지[PCR Technology, 에르리히(Erlich) HA 편집, 스톡톤프레스사(Stocktonpress), 1989년 발행]에 기재된 방법에 준하여 행한다. 또한, 이 증폭 DNA 단편에 대하여 통상적으로 사용되는 방법, 예컨대, 다이데옥시 체인 터미네이터 방법으로 염기 서열을 결정하면, 결정된 서열에서 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머의 서열 이외의 β-아밀라제의 부분 아미노산 서열에 대응되는 서열이 확인되므로, 목적한 β-아밀라제 유전자의 일부를 입수할 수 있다. 수득된 유전자 단편을 프로브로 하여, 또한, 혼성화 방법 등을 행함으로써, β-아밀라제의 전체 길이를 코딩하는 유전자를 클로닝할 수 있다.
후술하는 실시예에서는, 바실러스 플렉서스에 의해 생산되는 β-아밀라제를 코딩하는 유전자의 서열을 PCR 방법을 이용하여 결정하였다. 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 코딩하는 유전자의 전체 염기 서열은 서열번호 6에 나타낸다. 또한, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하였다(서열번호 7). 그리고, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대응되는 염기 서열은 서열번호 6에 기재된 서열 외에도 여러가지가 존재한다.
전체 염기 서열이 밝혀진 β-아밀라제 유전자(서열번호 6)의 전체 또는 일부분을 혼성화용 프로브로서 사용함으로써, 다른 β-아밀라제를 생산하는 미생물의 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터, 서열번호 6의 β-아밀라제 유전자와 상동성이 높은 DNA를 선별할 수 있다.
마찬가지로, PCR용 프라이머를 디자인할 수 있다. 이러한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행함으로써, 상기 β-아밀라제 유전자와 상동성이 높은 유전자 단편을 검출하고, 또한 그 유전자 전체를 수득할 수도 있다.
얻어진 유전자의 단백질을 제조하고, 이의 β-아밀라제 활성을 측정함으로써, β-아밀라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자인지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 수득되는 유전자의 염기 서열(또는 이로부터 코딩되는 아미노산 서열)을 상기 β-아밀라제 유전자의 염기 서열(또는 이로부터 코딩되는 아미노산 서열)과 비교하여 유전자 구조나 상동성을 조사함으로써, β-아밀라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는지의 여부를 판정하는 것도 가능하다.
1차 구조 및 유전자 구조가 명확해졌으므로, 랜덤 변이 또는 부위 특이적 변이의 도입에 의해 변형형 β-아밀라제(1개 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환 중 적어도 1개가 행해진 유전자)를 수득하는 것이 가능하다. 이로써, β-아밀라제 활성을 가지지만, 지적 온도, 안정 온도, 지적 pH, 안정 pH, 기질 특이성 등의 성질이 상이한, β-아밀라제를 코딩하는 유전자를 수득할 수 있다. 또한, 유전공학적으로 변형된 β-아밀라제를 제조할 수도 있다.
여기서, 변이 도입시, 계획은, 예를 들면, 유전자 서열 상의 특징적인 서열을 참작하여 행해진다. 특징적인 서열의 참작은, 예를 들면, 그 단백질의 입체 구조 예측, 기존의 단백질과의 상동성을 고려함으로써 행할 수 있다.
랜덤 변이의 도입 방법의 예로, DNA를 화학적으로 처리하는 방법으로서 아황산 수소 나트륨을 작용시켜 시토신 염기를 우라실 염기로 변환시키는 트랜지션 변이 유발법[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 제79권, 제1408?1412페이지(1982)], 생화학적 방법으로서, [α-S] dNTP의 존재 하에 이중 가닥을 합성하는 과정에 염기 치환이 이루어지게 하는 방법[진(Gene), 제64권, 제313?319페이지(1988)], PCR를 사용하는 방법으로서, 반응계에 망간을 가하여 PCR를 행하여 뉴클레오티드의 합성 정확성을 낮추는 방법[애널라이티컬 바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 제224권, 제347?353페이지(1995)] 등이 있다.
부위 특이적인 변이를 도입하는 방법의 예로는, 앰버 변이를 이용하는 방법[갭이 삽입된 듀플렉스(gapped duplex) 방법, 핵산 리서치(Nucleic Acids Research), 제12권, 제24호, 제9441?9456페이지(1984)], 제한 효소의 인지 부위를 이용하는 방법[Analytical Biochemistry, 제200권, 제81?88 페이지(1992), Gene, 제102권, 제67?70 페이지(1991)], dut(dUTPase)와 ung(우라실 DNA 글리코실라제) 변이를 이용하는 방법[쿠켈(Kunkel) 방법, Kunkel method, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 제82권, 제488?492페이지(1985)], DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제를 이용한 앰버 변이를 이용하는 방법[올리고뉴클레오티드 다이렉티드 듀얼 앰버(Oligonucleotide-directed Dual Amber: ODA) 방법, Gene, 제152권, 제271?275 페이지(1995), 일본 특허출원 공개번호 평7-289262호 공보], DNA의 수복계(修復系)를 유발하는 숙주를 이용하는 방법(일본 특허출원 공개번호 평8-70874호 공보), DNA 사슬 교환 반응을 촉매하는 단백질을 이용하는 방법(일본 특허출원 공개번호 평8-140685호 공보), 제한 효소의 인지 부위가 부가된 2종의 변이 도입용 프라이머를 사용한 PCR에 의한 방법(미국 특허 제5,512,463호), 불활성화 약제 내성 유전자를 포함하는 이중가닥 DNA 벡터와 2종의 프라이머를 이용한 PCR에 의한 방법[Gene, 제103권, 제73?77 페이지(1991)], 앰버 변이를 이용한 PCR에 의한 방법[국제 공개 WO98/02535호 공보] 등이 있다.
시판 키트를 사용하여, 부위 특이적인 변이를 용이하게 도입할 수도 있다. 시판 중인 키트로서, 예를 들면, 갭드 듀프렉스 방법을 이용한 Mutan(등록상표)-G(타카라주조 사제), 쿠켈법을 이용한 Mutan(등록상표)-K(타카라주조 사제), ODA법을 이용한 Mutan(등록상표)-ExpressKm(타카라주조 사제), 변이 도입용 프라이머와 피로코커스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제를 이용한 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit[스트라타진(STRATAGENE) 사제] 등을 사용할 수 있으며, 또한, PCR 방법을 차용하는 키트로서 TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit(타카라주조 사제), Mutan(등록상표)-Super Express Km(타카라주조 사제) 등을 사용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따라 β-아밀라제의 1차 구조 및 유전자 구조가 제공됨으로써, β-아밀라제 활성을 가진 단백질을 저렴한 비용으로 고순도로 유전공학적으로 제조 가능해진다.
(재조합 벡터)
본 발명의 새로운 측면은 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서, 용어 「벡터」는 여기에 삽입된 핵산 분자를 세포 등의 타겟 내로 수송할 수 있는 핵산성 분자를 지칭하며, 그 종류나 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노수반 바이러스 벡터, RNA 종양 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등)의 형태를 취할 수 있다.
사용 목적(클로닝, 단백질의 발현)에 따라, 또한, 숙주 세포의 종류를 고려하여, 적절한 벡터가 선택된다. 벡터에 대한 구체적인 예로는, 대장균을 숙주로 하는 벡터(M13 파지 또는 이의 변형체, λ 파지 또는 이의 변형체, pBR322 또는 이의 변형체(pB325, pAT153, pUC8 등) 등), 효모를 숙주로 하는 벡터(pYepSec1, pMFa, pYES2 등), 곤충 세포를 숙주로 하는 벡터(pAc, pVL 등), 포유류 세포를 숙주로 하는 벡터(pCDM8, pMT2PC 등) 등이 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 「발현 벡터」란, 이에 삽입된 핵산을 목적 세포(숙주 세포) 내에 도입할 수 있고, 또한 상기 세포내에서 발현시킬 수 있는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 통상적으로 삽입된 핵산의 발현에 필요한 프로모터 서열이나 발현을 촉진시키는 인핸서 서열 등을 포함한다. 선택 마커를 포함하는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 발현 벡터를 사용한 경우, 선택 마커를 이용하여 발현 벡터의 도입의 유무(및 그 정도)를 확인할 수 있다.
본 발명의 유전자의 벡터에의 삽입, 선택 마커 유전자의 삽입(필요에 따라), 프로모터의 삽입(필요에 따라) 등은 표준적인 재조합 DNA 기술(예, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있는, 제한 효소 및 DNA 리가제를 사용한 주지의 방법)을 사용하여 행할 수 있다.
(형질전환체)
또한, 본 발명은 본 발명의 유전자가 도입된 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체에는 본 발명의 유전자가 외래성 분자로서 존재하게 된다. 본 발명의 형질전환체는, 바람직하게는, 상기 본 발명의 벡터를 이용한 형질감염 또는 형질전환에 의해 제조된다. 형질감염 또는 형질전환은 인산 칼슘 공침강법, 전기충격(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)), 리포펙션(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1984)), 마이크로인젝션(Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 366-370(1976)), Hanahan의 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983)), 아세트산 리튬 법(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989)), 프로토플라스트-폴리에틸렌 글리콜법(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984)) 등에 의해 실시할 수 있다.
숙주 세포로서는 미생물, 동물 세포, 식물 세포 등을 사용할 수 있다. 미생물로서는, 대장균, 바실러스 속, 스트렙토마이세스 속, 락토코커스 속 등의 세균, 사카로마이세스 속, 피키아 속, 클루베로마이세스 속 등의 효모, 아스퍼질러스 속, 페니실리움 속, 트리코더마 속 등의 사상균을 들 수 있다. 동물 세포로서는 베큘로바이러스 계통을 들 수 있다.
(β-아밀라제의 제조법)
본 발명의 추가적인 측면은 β-아밀라제의 제조법을 제공한다. 본 발명의 제조법의 일 태양에서는, 본 효소(β-아밀라제)의 생산능력을 가진 바실러스 플렉서스를 배양하는 단계(단계 (1) 및 배양 후의 배양액 및/또는 균체로부터β-아밀라제를 회수하는 단계(단계 (2))이 수행된다.
단계 (1)에서, 바실러스 플렉서스로서, 예를 들면, 상기의 바실러스 플렉서스 DSM1316, DSM1320, DSM1667, APC9451 등을 사용할 수 있다. 배양법과 배양 조건은 목적 효소가 생산되는 한 특별히 한정되지 않는다. 즉, 본 효소가 생산되는 것을 조건으로서, 사용하는 미생물의 배양에 적합한 방법이나 배양 조건을 적절하게 설정할 수 있다. 배양법은 액체 배양, 고체 배양 중 어느 한가지일 수 있지만, 바람직하게는 액체 배양이 이용된다. 액체 배양을 예를 들어 그 배양 조건을 설명한다.
배양 배지는 사용 미생물이 생육가능한 배양 배지라면, 임의의 배지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루코스, 슈크로스, 겐티노오비오스, 가용성 전분, 글리세린, 덱스트린, 당밀, 유기산 등의 탄소원, 추가로, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 인산 암모늄, 아세트산 암모늄, 또는 펩톤, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 밀기울(wheat bran), 육류 엑기스 등의 질소원, 추가로, 칼륨염, 마그네슘염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 철염, 아연 염 등의 무기염이 첨가된 것을 사용할 수 있다. 사용 미생물의 생육을 촉진하기 위해, 비타민, 아미노산 등을 배양 배지에 첨가할 수도 있다. 배양 배지의 pH는 예를 들면, 약 3?10, 바람직하게는 약 7?8 정도로 조정하고, 배양 온도는 통상 약 10?50℃, 바람직하게는 약 20?37℃ 정도로, 1?7일간, 바람직하게는 3?4일간, 호기 조건하에서 배양한다. 배양법은, 예컨대, 진탕 배양법, 용기-발효기(jar fermenter)에 의한 호기성 심부 배양법을 이용할 수 있다.
이상의 조건에서 배양한 후, 배양액 또는 균체로부터 β-아밀라제를 회수한다(단계 (2)). 배양액으로부터 회수하는 경우, 예를 들면, 배양물 상청액을 여과, 원심 처리 등을 수행함으로써 불용물을 제거한 다음, 한외 여과막에 의한 농축, 암모늄 설페이트 침전 등의 염석, 투석, 이온 교환 수지 등의 각종 크로마토그래피 등을 적절하게 조합하여 분리 및 정제함으로써, 본 효소를 수득할 수 있다.
한편, 균체내에서 회수하는 경우, 예를 들면, 균체를 가압 처리, 초음파 처리 등에 의해 파쇄한 후, 상기와 동일하게 분리 및 정제함으로써, 본 효소를 수득할 수 있다. 그리고, 여과 및 원심 처리 등에 의해 미리 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 상기 일련의 공정(균체의 파쇄, 분리, 정제)을 행할 수도 있다.
그리고, 발현의 확인이나 발현 산물의 확인은 β-아밀라제에 대한 항체를 사용하여 행하는 것이 편리하지만, β-아밀라제 활성을 측정함으로써 발현의 확인을 행할 수도 있다.
본 발명의 다른 태양에서는, 상기의 형질전환체를 사용하여 β-아밀라제를 제조한다. 이러한 태양의 제조법에서는, 먼저, 여기에 도입된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 조건하에서 상기의 형질전환체를 배양한다(단계 (i)). 다양한 벡터 숙주계에 대한 형질전환체의 배양 조건은 공지되어 있으며, 당업자이면 적절한 배양 조건을 용이하게 설정할 수 있다. 배양 단계에 이어, 생산된 단백질(즉, β-아밀라제)을 회수한다(단계 (ii)). 회수 및 그 후의 정제는, 상기 태양의 경우와 동일하게 수행할 수 있다. 본 효소의 정제도는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 최종 형태는 액체상 또는 고체상(분체상이 포함됨)일 수 있다.
(효소 조성물)
본 발명의 효소는, 예컨대 효소 조성물(효소제)의 형태로 제공된다. 효소 조성물은, 유효 성분(본 발명의 효소) 외에도, 부형제, 완충제, 현탁제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등을 포함할 수 있다. 부형제로서는 유당, 소르비톨, D-만니톨, 백당 등을 사용할 수 있다. 완충제로서는 인산염, 구연산염, 아세트산염 등을 사용할 수 있다. 안정제로서는 프로필렌글리콜, 아스코르빈산 등을 사용할 수 있다. 보존제로서는 페놀, 염화 벤즈알코늄, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸파라벤 등을 사용할 수 있다. 방부제로서는 염화 벤즈알코늄, 파라옥시 벤조산, 클로로부탄올 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 효소 조성물의 일 태양은, 본 발명의 효소(바실러스 플렉서스 유래 β 아밀라제) 외에도, 다른 효소를 유효 성분으로서 포함한다. 이로써, 복합적인 효소 반응이 가능한 효소 조성물이 제조된다. 상기 「다른 효소」로는, 리파제, 포스포리파제, 글루코스 옥시다제, 자일라나제, 프로테아제, 트랜스글루타미나제, 프로테인글루타미나제, 탈분지 효소, 풀룰라나제, 이소아밀라제, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 말토제닉 α-아밀라제 등을 들 수 있다. 탈분지 효소로는, 예컨대, Kleistase PL45(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)가 있으며, 풀룰라나제로는, 예컨대 풀룰라나제 「Amano」3(Amano Enzyme Inc.)가 있으며, 이소아밀라제로는 슈도모나스 아밀로더라모사(Pseudomonas amyloderamosa) 유래의 효소가 있으며, α-아밀라제로는, 예컨대 Kleistase P8(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)나 Biozyme L(Amano Enzyme Inc.)이 있으며, 글루코아밀라제로는, 예컨대, Gluczyme AF6(Amano Enzyme Inc.)가 있으며, 말토제닉 α-아밀라제로는, 예컨대, 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 효소를 들 수 있다. 아울러, 「다른 효소」로서 2종 이상의 효소를 사용할 수도 있다.
(β-아밀라제의 용도)
본 발명의 또 다른 측면은, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 용도로서, 말토스의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 말토스 제조 방법에서, 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류 또는 올리고당류를 포함하는 기질에, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 작용시킨다. 기질의 예로는 가용성 전분, 감자 전분, 옥수수 전분, 아밀로펙틴, 글리코겐 및 말토 올리고당을 들 수 있다. 기질의 순도는 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 다른 물질과 혼재된 상태에서 기질에 β-아밀라제를 작용시킬 수 있다. 또한, 2종 이상의 기질에 동시에 β-아밀라제를 작용시킬 수도 있다.
본 발명의 말토스 제조 방법은 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 사용하는 것이 특징적이며, 바람직하게는, β-아밀라제로서 상기 본 발명의 β-아밀라제(본 효소)를 사용한다. 본 발명의 말토스 제조 방법은 예컨대 말토스 함유 시럽이나 말토스 물엿(maltose starch syrup)의 생산에 이용된다.
본 발명의 추가적인 측면은, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를, 빵류 및 빵 반죽의 품질 개량제, 떡(rice cake) 및 떡 과자(rice cake sweet)의 노화 방지제, 또는 취반미(steamed rice)의 노화 방지제 등으로서 이용하는 방법을 제공한다. 이와 같은 식품의 특성을 변화시키는 방법을 본 발명에서는 「식품의 개질 방법」이라고 한다. 본 발명의 식품의 개질 방법에 따라 개질 가능한 식품은, 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류 또는 올리고당류를 포함하는 식품이다. 상기 조건을 만족시키는 한, 식품은 한정되지 않는다. 본 발명에서 개질 가능한 식품의 예는 빵류 내지 빵류 반죽, 떡 내지 떡과자, 취반미이다. 본 발명에서, 「빵류 내지 빵류 반죽」은, 소맥분을 주원료로 하여, 여기에 물 등을 가하고, 또한, 유지, 당류, 유제품, 난, 이스트 푸드, 각종 효소류, 각종 유화제 등의 원료를 필요에 따라 첨가한 후, 이스트의 첨가의 유무에 상관없이, 반죽 공정을 거쳐 얻어진 일반적 반죽, 떡이나 만두의 반죽이나 도너츠 반죽, 파이 반죽, 피자 반죽, 핫케이크 반죽, 스폰지 케이크 반죽, 크레페 반죽, 교자 반죽 등, 및 이들 반죽을 성형, 가열(오븐이나 솥 등에서 굽는 과정, 찌는 과정, 기름에 튀기는 과정 등) 등으로 수득되는 제품(빵, 도너츠, 파이, 피자, 핫케이크, 스폰지 케이크, 크레페, 교자 등)을 의미한다. 소맥분 이외의 곡물, 예를 들면, 호밀 등을 혼입하여 얻어진 반죽, 제품 등도 포함한다.
본 발명에 있어서 「떡 내지 떡과자」란, 판떡(plate rice cake), 찹쌀떡(大福餠, daifukumochi), 카시와 모찌(kashiwamochi), 쑥떡, 사꾸라모찌, 경단(團子, rice dumpling), 스아마(suama), 우이로(uiro), 백옥경단(rice flour dumplings), 규히모찌(gyuhimochi), 카루칸만쥬(karukan manju), 죠요만쥬(jouyou manju) 등, 쌀 또는 쌀가루를 주원료로 사용하고, 여기에 물을 가하여 당류 등의 원료를 필요에 따라 더 첨가하고, 이를 혼합한 떡 반죽, 및 이를 찌거나 함으로써 얻어지는 제품을 말한다. 그리고, 여기서의 「쌀 또는 쌀가루」란, 멥쌀이나 찹쌀 또는 멥쌀을 수세하여 건조하고 분쇄함으로써 수득한 상신분(上新粉), 일반 쌀가루와 찹쌀을 수세 및 건조하여 제분하여 수득한 떡 가루 등을 포함한다. 또한, 쌀 또는 쌀가루를 구성하고 있는 전분도 포함된다.
본 발명에서 「취반미 내지 취반미 가공품」은, 쌀 종류로 밥을 지은 것 및 취반미를 가공하여 수득되는 것을 의미한다. 여기서 말하는 쌀 종류는 쌀, 찹쌀, 현미 등의 쌀 종류 전체를 지칭한다. 이들 재료는 단독으로 사용하거나, 복수 종을 혼합 사용하거나, 또는 다른 곡류와 혼합하여 사용할 수 있다. 취사의 단계에서 조미, 풍미 등을 부가한 것(적반(red-bean rice), 타키코미밥(seasoned steamed rice), 죽 등), 취반미에 조미, 풍미를 부가한 것(리조토, 죽 등), 또는 취반미를 이용한 각종 식품(주먹밥, 초밥, 도시락, 쌀국수) 등도 「취반미 내지 취반미 가공품」에 해당된다.
본 발명의 개질 방법에서는, 상기와 같은 식품에 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 작용시킨다. β-아밀라제를 작용시키는 시기는 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로는 원재료에 β-아밀라제를 첨가 및 혼합시켜 식품의 제조 및 가공을 행함으로써, 또는 제조 및 가공 중에 식품에 β-아밀라제를 첨가함으로써 효소를 작용시킨다. β-아밀라제의 첨가량은, 개질 대상 식품, 개질의 정도 등에 따라 달라지지만, 예를 들면, 식품 100 g 당 2 U 내지 40 U이다. 아울러, 본원에서 활성치는 후술한 β-아밀라제 활성 측정 방법(2)에 따라 정해진다.
본 발명의 말토스 생성법 또는 빵류, 떡, 취반미 등의 식품의 개질 방법에 있어서, β-아밀라제에 추가하여 다른 효소를 병용할 수도 있다. 상기 「다른 효소」로서, 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류 또는 올리고당류에 작용하는 효소를 사용할 수 있다. 상기 효소의 예는 탈분지 효소, 풀룰라나제, 이소아밀라제, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 말토제닉α-아밀라제이다. 탈분지 효소로서는, 예를 들면, Kleistase PL45(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)가 있으며, 풀룰라나제로서는 예를 들면, 풀룰라나제 「Amano」3(Amano Enzyme Inc.)가 있으며, 이소아밀라제로서는 슈도모나스 아밀로더라모사 유래의 효소가 있으며, α-아밀라제로서는 예를 들면, Kleistase P8(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)나 Biozyme L(Amano Enzyme Inc.)이 있으며, 글루코아밀라제로서는 예를 들면, Gluczyme AF6(Amano Enzyme Inc.)가 있으며, 말토제닉α-아밀라제로서는 예를 들면, 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 효소를 들 수 있다. 빵류, 떡, 취반미 등의 식품의 개질 방법에 있어서, 「다른 효소」로서 리파제, 포스포리파제, 글루코스옥시다제, 자일라나제, 프로테아제, 트랜스글루타미나제, 프로테인글루타미나제 등을 사용할 수도 있다. 그리고, 「다른 효소」로서 2종 이상의 효소를 사용할 수도 있다.
전형적으로, β-아밀라제와 「다른 효소」는 동시에 작용시킨다. 단, β-아밀라제를 작용시킨 후 「다른 효소」를 작용시킬 수 있으며, 또는 이와는 반대 순서로 양자를 작용시킬 수 있다.
실시예
<β-아밀라제 활성 측정 방법(1)>
β-아밀라제의 활성은 하기와 같이 측정하였다. 즉, 1% 가용성 전분 및 10 mM 아세트산 칼슘을 포함하는 0.1 M 인산-염산 완충액(pH5.0) 0.5 ml에 효소 용액 0.5 ml를 첨가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후, DNS 용액(0.2% DNS, 80 mM NaOH, 0.2 M 포타슘 소듐 타르트레이트 테트라하이드레이트) 2.5 ml을 첨가하여 반응을 정지한다. 반응 정지 후, 5분간 끓인(자비(煮沸)) 다음, 파장 530 nm에서 흡광도를 측정한다. 파장 530 nm에서 흡광도가 1이 되는 효소량을 1단위(U)로 한다.
1. 바실러스 플렉서스(Bacillus flexus) 유래 β-아밀라제의 확인
바실러스 플렉서스 DSM1316, DSM1320, DSM1667, APC9451로 구성된 4주에 대해, 표 1에 나타낸 조성의 액체 배양 배지를 사용하여 30℃에서 3일간 진탕 배양하였다.
β-아밀라제 생산 배지
(w/v)
옥수수 침지액 2%
가용성 전분 4%
칼슘 카보네이트 2%
얻어진 배양 상청액의 β-아밀라제 활성을 상기 β-아밀라제 활성 측정법에 의해 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타낸다.
활성 (u/ml)
DSM1316 4.0
DSM1320 14.8
DSM1667 4.0
APC9451 5.7
2. 바실러스 플렉서스 APC9451 유래 β-아밀라제의 생산 및 정제
바실러스 플렉서스 APC9451을 표 1에 나타낸 조성의 액체 배양 배지를 사용하여 30℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양 상청액을 UF 막(AIP-0013, Asahi Kasei Corporation)으로 4배 농축한 후, 60% 포화 농도가 되도록 황산 암모늄을 첨가하였다. 침전된 분획을 20 mM 아세트산 완충액(pH5.5)에 재용해시키고, 이어 20% 포화 농도가 되도록 황산 암모늄을 첨가하였다. 생성된 침전물을 원심 분리에 의해 제거한 후, 20% 포화 농도의 황산 암모늄을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH5.5)으로 평형화한 HiPrep Butyl 16/10 FF 컬럼(GE Healthcare)에 주입하고, 20% 포화 농도에서 0% 포화 농도로의 황산 암모늄의 직선 농도 구배에 의해, 흡착된 β-아밀라제 단백질을 용리시켰다.
수집한 β-아밀라제 활성 분획을 UF 막으로 농축한 후, 20 mM 아세트산 완충액(pH5.5)으로 평형화한 HiTrap CM FF 컬럼(GE Healthcare Ltd.)에 주입하고, 0 M에서 0.5 M까지의 NaCl 직선 농도 구배에 의해, 흡착된 β-아밀라제 단백질을 용리시켰다.
또한, 수집한 β-아밀라제 활성 분획을 UF 막으로 농축한 후, 0.15 M NaCl이 포함된 20 mM 아세트산 완충액(pH5.5)으로 평형화한 HiLoad 16/60 Superdex200 컬럼(GE Healthcare Ltd.)에 주입하고, 동일 완충액으로 용리시켰다. β-아밀라제 활성 분획을 모아 한외 여과막으로 탈염 농축하여, 정제된 효소 샘플을 수득하였다. 수득된 정제된 효소를 대상으로 하기의 여러가지 특성에 대한 검토를 실시하고, N 말단 아미노산 서열 분석과 내부 펩티드 아미노산 서열 분석을 실시하였다.
그리고, 각 단계의 정제 결과는 표 3에 나타낸다. 최종 단계의 비활성(specific activity )은 미정제 효소(crude enzyme)에 비해 2270배였다. 도 5에, 정제 공정의 각 단계의 샘플을 10-20%의 농도 구배 겔에서 SDS-PAGE(CBB 염색) 수행한 결과를 나타낸다. 본 정제 효소 샘플(레인 4)은 SDS-PAGE에서 단일 단백질인 것으로 확인되었다.
총 단백질량 (mg) 총 활성 (U) 상대 활성 (u/mg) 회수율 (%)
농축액 27200 18700 0.69 100
황산 암모늄 2856 9054 3.17 48
부틸 FF 59.9 4120 68.8 22
CM FF 0.64 656 1031 4
Superdex 200 0.084 132 1569 1
3. 내열성 β-아밀라제의 여러가지 성질
(1) 지적 반응 온도
상기 β-아밀라제 활성 측정법에 준하여 반응 온도 25℃, 37℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 및 70℃에서 반응시켰다. 최고 활성이 나타나는 온도에서의 값을 100%로 하여, 상대적인 활성으로 나타내었다. 지적 반응 온도는 55℃ 부근이었다(도 1).
(2) 지적 반응 pH
기질로는 1% 가용성 전분을 사용하고, 각 완충액(구연산 완충액 pH2, pH3, pH4, 브리튼-로빈슨 완충액 pH4, pH5, pH6, pH7, pH8, pH9, pH10, pH11) 중에서, 37℃에서 10분간의 반응 조건하에서 측정하였다. 최대 활성값이 나타나는 pH에서의 값을 100%로 하여, 상대적인 활성으로 나타내었다. 지적 반응 pH는 약 8.0 부근이었다(도 2).
(3) 온도 안정성
20 U/ml의 효소액을 37℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 및 70℃의 각 온도 하에서, 10 mM 아세트산 칼슘이 포함된 0.1 M 아세트산-염산 완충액(pH5.0) 중에서 10분간 열처리한 후, 잔존 활성을 상기 β-아밀라제 활성 측정법에 의해 측정하였다. 열 처리하지 않은 활성을 100%로 하여, 잔존 활성으로 표시하였다. 55℃에서의 10분간의 열처리시 잔존 활성은 90% 이상이었고, 55℃ 까지 안정적이었다(도 3).
(4) pH 안정성
각 완충액(구연산 완충액 pH2, pH3, pH4, 브리튼-로빈슨 완충액 pH4, pH5, pH6, pH7, pH8, pH9, pH10, pH11) 중에서 30℃로 3시간 처리한 후, 상기 β-아밀라제 활성 측정법에 의해 활성을 측정하였다. 최대 활성이 나타난 pH에서의 값을 100%로 하여, 상대적인 활성으로 나타내었다. 지적 반응 pH는 4?9였다(도 4).
(5) SDS-PAGE에 의한 분자량 측정
SDS-PAGE는 Laemmli 등의 방법에 따라 행하였다. 사용한 분자량 마커는 Low Molecular Weight Calibration Kit for Electrophoresis (GE Healthcare)이며, 표준 단백질로서 포스포릴라제 b(97,000 Da), 알부민(66,000 Da), 오발부민(45,000 Da), 카본 안하이드라제(30,000 Da), 트립신 저해제(20,100 Da), α-락트알부민(14,400 Da)이 포함되어 있었다. 겔 농도 10-20%의 농도 구배 겔(Wako)을 사용하여, 20 mA/겔로 약 80분간 전기영동을 수행하였고, 분자량을 구한 결과, 분자량은 약 60 kDa이었다(도 5).
(6) 등전점
암포라인(ampholine)을 사용한 등전점 포커싱(600 V, 4℃, 48시간 통전)에 의해 측정한 결과, 본 효소의 등전점은 9.7이었다.
(7) 금속 이온 및 저해제의 영향
10 mM 아세트산 칼슘이 포함된 0.1 M 아세트산-염산 완충액(pH5.0) 중의 β-아밀라제에, 1 mM의 각종 금속 이온 또는 저해제를 각각 첨가하여, 30℃에서 30분간 처리한 후, 상기 β-아밀라제 활성 측정법에 의해 활성을 측정하였다. 그 결과는 표 4에 나타낸다. 무첨가시를 100%로 하여, 상대적인 활성으로 표시한다. 활성은 Cu 이온, 요오드 아세트산, PCMB, SDS에 의해 저해되었다.
상대 활성 (%)
Na+ 88
K+ 96
Ca2+ 130
Mn2+ 222
Mg2+ 103
Zn2+ 96
Cu2+ 46
Fe2+ 105
Fe3+ 113
EDTA 97
N-에틸말레이미드 93
PCMB 25
모노아이오도아세트산 14
SDS 37
무첨가 100
(8) 기질 특이성
각 기질에 대해 β-아밀라제 활성을 조사하였다. 가용성 전분에 대한 활성을 100%로 하여, 상대적인 활성으로 나타내었다. 올리고당류에 대해 하기 나타낸 말토스 정량법에 의해 말토스 생성량을 조사하였다. 0.5%의 각 말토 올리고당에 대해 0.1 U/ml의 효소를 37℃에서 30분간 반응시킨 후, HPLC(Aminex carbohydrate HPX-42 A, BIO-RAD)에서 말토스를 정량하였다. 가용성 전분을 기질로 사용하였을 때의 말토스 생성량을 100%로 하여, 각 말토 올리고당에 대한 상대 활성을 말토스 생성량으로부터 구하였다.
그 결과는 표 5에 나타낸다. 가용성 전분에 대한 말토스 생성량을 100%로 하여, 상대적인 활성으로 나타낸다. 사이클로덱스트린, 풀룰란, 덱스트란은 거의 분해되지 않았다. 올리고당의 경우 말토트리오스에는 작용하지 않았고, 다른 올리고당에는 양호하게 작용하였다.
기질 상대 활성 (%)
말토트리오스 0
말토테트라오스 75
말토펜타오스 102
말토헥사오스 131
말토헵타오스 111
α-사이클로덱스트린 0
β-사이클로덱스트린 1.4
γ-사이클로덱스트린 0.6
아밀로스 98
아밀로펙틴 83
풀룰란 3.4
덱스트란 1.9
글리코겐 51
감자 전분 78
옥수수 전분 85
왁시 옥수수 전분 106
가용성 전분 100
4. 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 코딩하는 유전자 단편의 취득
(a) 염색체 DNA의 분리
1에서 수득한 바실러스 플렉서스(Bacillus flexus)의 균체로부터 사이토?미우라 방법(Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963)에 의해 게놈 DNA를 준비하였다.
(b) 부분 아미노산 서열의 결정
1에서 얻어진 β-아밀라제의 정제 샘플을 아미노산 서열 해석에 제공하여, 잔기 10개의 N 말단 아미노산 서열(서열번호 1)과 내부 펩티드 아미노산 서열(서열번호 2, 3)을 결정하였다.
(c) PCR에 의한 DNA 프로브의 제작
N 말단 아미노산 서열과 내부 아미노산 서열을 기초로, 2종의 혼성 올리고 뉴클레오티드를 합성하여 PCR 프라이머를 사용하였다(서열번호 4, 5). 이들 프라이머와 바실러스 플렉서스(Bacillus flexus)의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여, 하기 조건에서 PCR 반응을 행하였다.
<PCR 반응액>
10× PCR 반응 완충액(TaKaRa) 5.0 ㎕
dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TaKaRa) 4.0 ㎕
25 mM MgCl2 5 ㎕
100 uM 센스 프라이머 3.0 ㎕
100 uM 안티센스 프라이머 3.0 ㎕
증류수 28.5 ㎕
염색체 DNA 용액(140 ㎍/ml) 1 ㎕
LA Taq DNA 폴리머라제(TaKaRa) 0.5 ㎕
<PCR 반응 조건>
스테이지 1: 변성(94℃, 5분) 1 사이클
스테이지 2: 변성(94℃, 30초) 30 사이클
어닐링(48℃, 30초)
신장(72℃, 1분)
얻어진 약 0.86 kb의 DNA 단편을 pGEM-Teasy(Promega사)에 클로닝한 후, 염기 서열을 확인한 바, 센스 프라이머의 바로 다음과 안티센스 프라이머의 바로 앞부분에서 상기의 부분 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열이 발견되었다. 본 DNA 단편을 전장 유전자의 클로닝을 위한 DNA 프로브로 사용하였다.
(d) 유전자 라이브러리의 제작
바실러스 플렉서스의 염색체 DNA의 써던 혼성화 분석을 실시한 결과, KpnI 분해물에서 프로브 DNA와 혼성하는 약 5.0 kb의 싱글 밴드가 확인되었다. 이러한 약 5.0 kb의 KpnI DNA 단편을 클로닝하기 위해, 이하와 같이 유전자 라이브러리를 제작하였다. 상기 (a)에서 제조한 염색체 DNA에 KpnI 처리를 행하였다. 바실러스 플렉서스의 게놈 DNA 28 ㎍, 10× L 완충액 3 ㎕, 증류수 26 ㎕ 및 KpnI 1 ㎕를 혼합하여, 37℃에서 15시간 처리하였다. 얻어진 분해물을 KpnI 처리된 pUC19(TaKaRa) 벡터에 라이게이션하여, 유전자 라이브러리를 수득하였다.
(e) 유전자 라이브러리의 스크리닝
상기 (c)에서 수득한 0.86 kb의 DNA 단편을 DIG-High Prime(Roche)를 사용하여 표지하였다. 이를 DNA 프로브로 사용하여, (d)에서 수득한 유전자 라이브러리에 대한 콜로니 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 얻어진 포지티브 콜로니로부터 플라스미드 pUC19-BAF를 입수하였다.
(f) 염기 서열의 결정
플라스미드 pUC19-BAF의 염기 서열을 정해진 방법에 따라 결정하였다. β-아밀라제를 코딩하는 염기 서열(1638 bp)을 서열번호 6에 나타낸다. 또한, 서열번호 6에 의해 코딩되는 아미노산 서열(545 아미노산)을 서열번호 7에 나타낸다. 이 아미노산 서열에서, (b)에서 결정된 N 말단 영역 아미노산 서열(서열번호 1)과 내부 아미노산 서열(서열번호 2, 3)이 발견되었다.
5. 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 대장균에서의 발현
(a) β-아밀라제의 대장균 발현용 플라스미드의 구축
N 말단 영역의 아미노산 서열과 C 말단 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 기초로, 2종의 올리고뉴클레오티드(서열번호 8, 9)를 합성하여, PCR 프라이머로 사용하였다. 센스 프라이머에는 NdeI 제한 효소 인지 부위가, 안티센스 프라이머에는 XhoI 제한 효소 인지 부위가 부가된다. 이들 프라이머와 β-아밀라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pUC19-BAF를 주형으로 사용하고, 아래 조건 하에서 PCR 반응을 행하였다.
<PCR 반응액>
10× PCR 반응 완충액(TOYOBO) 5.0 ㎕
dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TOYOBO) 5.0 ㎕
10 uM 센스 프라이머 1.5 ㎕
10 uM 안티센스 프라이머 1.5 ㎕
25 mM MgSO4 2 ㎕
증류수 33 ㎕
플라스미드 pUC19-BAF 용액(83㎍/ml) 1.0 ㎕
KOD-Plus-DNA 폴리머라제(TOYOBO) 1.0 ㎕
<PCR 반응 조건>
스테이지 1: 변성(94℃, 2분) 1 사이클
스테이지 2: 변성(94℃, 15초) 30 사이클
어닐링(60℃, 30초)
신장(68℃, 2분)
입수한 PCR 산물을 전기 영동으로 확인한 다음, GENE CLEANE III로 정제(34 ㎕)하고, 여기에 4 ㎕의 10× H 완충액, NdeI 1 ㎕ 및 XhoI 1 ㎕를 첨가하여, 37℃에서 15시간 동안 효소 처리하였다. 제한 효소 처리액을 전기 영동에 의해 확인한 다음, 정제하여, 미리 NdeI 및 XhoI로 처리된 벡터 pET20(b)(TAKARA BIO INC.)에 연결시켜, 발현 플라스미드 pET-BAF를 수득하였다(도 6). 또한, pET-BAF에서 β-아밀라제를 코딩하는 염기 서열이 정확함을 확인하였다.
(b) β-아밀라제의 대장균에서의 발현
발현 플라스미드 pET-BAF를 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에 도입하였다. 암피실린 내성주로서 입수한 형질전환체들 중에서, 콜로니 PCR에 의해 목적 β-아밀라제 유전자가 삽입된 pET-BAF를 유지하는 균주를 선별하였다. 또한 대조군으로서 발현 벡터 pET20(b)를 가진 대장균 BL21(DE3)의 형질전환체도 입수하였다. 이들 형질전환체를 50 ㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배양 배지 4 ml에서, 18℃, 160 rpm에서 47시간 동안 배양하고, 집균하였다. 균체를 0.5 ml의 20 mM 아세트산 완충액(pH5.5)에 현탁하고, 여기에 φ0.1 mm의 유리 비즈 0.25 g을 첨가한 다음, 멀티-비드 쇼커(Yasui Kikai Corporation)에 의해 균체를 파쇄하였다. 파쇄 조건은, ON 30초, OFF 30초를 3.5회 사이클로 반복하였다. 수득한 무세포-추출물(Cell free-extract)을 원심분리하여, 가용성 성분을 수득하였다.
얻어진 샘플에 대해 상기 β-아밀라제 활성 측정법에 준하여 활성 측정을 실시하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
활성 (U/ml) 단백질 (mg/ml) 비활성 (U/mg)
pET-BAF 43.5 7.9 5.5
pET20(b) 0.4 8.0 0.05
<β-아밀라제 활성 측정 방법(2)>
또한, 아래의 방법으로도 β-아밀라제 활성을 측정하였다. 즉, 0.5% 가용성 전분이 포함된 0.05 M 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH5.0) 10 ml에 효소 용액 1 ml를 첨가하여, 40℃에서 30분간 인큐베이션한 후, Fehling's 용액(1.25 M NaOH, 0.62 M 포타슘 소듐 타르트레이트 테트라하이드레이트, 0.14 M 구리 설페이트(II) 펜타하이드레이트) 4 ml를 가하여 반응을 정지시킨다. 반응 정지 후, 2분간 끓인 다음, 2.26 M 포타슘 요오다이드 시약 2 ml과 0.25% 황산 시약 2 ml을 첨가하여, 0.005 mol/L 소듐 티오설페이트 용액으로 적정을 수행한다. 반응 시간 30분간에 10 mg의 글루코스에 상당하는 환원력을 증가시키는 효소량을 1단위(U)로 한다. 아래 실시예에서는 이러한 방법으로 측정한 활성 값을 사용한다.
6. 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제에 의한 말토스 시럽의 제조
6-1. 기질 농도의 영향
덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)을 20%?35%로 제조하고, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 0.6 U/g-DS 첨가하여, pH5.8에서 62℃에서 42시간 동안 반응시켰다. 반응 후 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)으로 분석한 결과로서 표 7에 나타낸다. 즉, 고농도 덱스트린에 대해서도 높은 말토스 생성능력이 확인되었다.
기질 농도 G1 G2 G3 G4 G5≤
20% 0.00% 56.38% 7.37% 1.57% 34.68%
25% 0.00% 57.48% 7.29% 1.11% 34.12%
30% 0.00% 57.85% 7.28% 0.98% 33.89%
35% 0.00% 57.42% 7.29% 1.02% 34.27%
6-2. 반응 온도의 영향
30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)(pH5.8)에 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 4 U/g-DS 첨가하여, 56℃ 및 65℃에서 42시간 동안 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을, 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)으로 분석하여, 그 결과를 표 8에 나타낸다. 즉, 고온에서도 높은 말토스 생성능력이 확인되었다.
온도 G1 G2 G3 G4 G5≤
56℃ 0.20% 59.81% 7.60% 0.78% 31.61%
65℃ 0.17% 59.50% 7.33% 0.75% 32.25%
6-3. 반응 pH의 영향 및 탈분지 효소와의 조합
여러가지 pH에서, β-아밀라제와 탈분지 효소를 조합하여, 덱스트린으로부터 말토스 시럽을 제조하였다. 30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)을 pH5.8?7.0로 준비하여, β-아밀라제를 1 U/g-DS 사용하고, 탈분지 효소로서 Kleistase PLF(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)를 3.3 ㎕/g-DS 첨가하여, 62℃에서 42시간 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)로 분석하였고, 그 결과를 표 9에 나타낸다.
pH G1 G2 G3 G4 G5≤
pH5.8 0.16% 80.48% 12.72% 2.64% 4.00%
pH6.0 0.17% 78.08% 12.46% 2.92% 6.37%
pH6.5 0.18% 76.76% 12.34% 2.72% 8.00%
pH7.0 0.22% 69.57% 11.22% 2.92% 16.07%
이와 같이, 탈분지 효소와의 조합에 의해, 말토스를 80% 이상으로 생성시킬 수 있었다. 또한, 중성 범위에서도 충분한 생성능력이 있었다.
6-4. 효소 첨가량의 영향, 및 보리 유래 및 밀 유래의 β-아밀라제의 비교
30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)에 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제, Biozyme ML(보리 β-아밀라제, Amano Enzyme Inc.), 및 Biozyme KL(밀 β-아밀라제, Amano Enzyme Inc.)를 첨가하고, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제의 경우에는 pH5.8 및 62℃에서, 그 외의 경우에는 pH5.5 및 58℃에서 42시간 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)로 분석하였고, 그 결과를 도 7 및 표 10에 나타낸다.
효소 첨가량 (U/g-DS) G1 G2 G3 G4 G5≤
바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제 0.2 0.12% 38.68% 6.59% 4.94% 49.67%
0.4 0.16% 53.70% 7.08% 2.46% 36.60%
0.6 0.13% 55.60% 6.99% 1.12% 36.16%
0.8 0.15% 58.38% 7.20% 0.83% 33.44%
1.0 0.15% 59.14% 7.16% 0.74% 32.81%
Biozyme-ML 0.4 0.12% 24.44% 4.09% 4.71% 66.64%
0.6 0.13% 33.96% 5.26% 5.10% 55.55%
0.8 0.14% 45.09% 6.83% 4.56% 43.38%
1.0 0.00% 48.77% 7.04% 3.44% 40.75%
1.5 0.13% 53.27% 6.99% 1.24% 38.37%
2.0 0.15% 56.05% 7.15% 0.78% 35.87%
Biozyme-KL 1.0 0.00% 15.12% 3.32% 3.80% 77.76%
1.2 0.11% 21.16% 3.94% 4.42% 70.37%
1.4 0.11% 25.14% 4.42% 4.69% 65.64%
1.6 0.14% 31.49% 5.31% 5.11% 57.59%
1.8 0.12% 32.25% 5.47% 4.76% 57.40%
2.0 0.14% 39.47% 6.42% 4.80% 49.17%
3.0 0.00% 54.15% 7.16% 1.09% 37.60%
4.0 0.00% 54.30% 6.69% 0.76% 37.98%
이와 같이, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제는 첨가량 1.0 U/g-DS의 경우에 59.14%로 말토스를 생성시켜, 보리 유래 효소의 경우 첨가량 2.0 U/g-DS에서의 56.06%, 밀 유래 효소의 경우 첨가량 4.0 U/g-DS에서의 54.30%의 말토스 생성량과 비교하여, 명백하게 우수하였다.
6-5. 효소 첨가량의 영향 및 대두 유래의 β-아밀라제와의 비교
30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)에 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제 또는 Biozyme M5(대두 β-아밀라제, Amano Enzyme Inc.), 및 탈분지 효소로서 Kleistase PLF(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)를 3.3 ㎕/g-DS 첨가하여, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제는 pH5.8에서, 대두 유래 효소는 pH5.5에서, 62℃에서 42시간 동안 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)로 분석하였고, 그 결과를 도 8 및 표 11에 나타낸다.
효소 첨가량 (U/g-DS) G1 G2 G3 G4 G5≤
바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제 0.5 0.16% 73.88% 12.27% 4.64% 9.05%
0.6 0.15% 76.67% 12.49% 3.81% 6.88%
0.7 0.16% 78.14% 12.56% 3.31% 5.83%
0.8 0.12% 79.75% 12.88% 3.21% 4.04%
0.9 0.17% 80.10% 12.74% 2.79% 4.20%
1.0 0.16% 80.48% 12.72% 2.64% 4.00%
Biozyme-M5 0.5 0.15% 71.46% 11.69% 2.82% 13.88%
0.6 0.15% 73.90% 11.95% 2.58% 11.42%
0.7 0.14% 75.15% 12.06% 2.43% 10.22%
0.8 0.15% 76.32% 12.14% 2.36% 9.03%
0.9 0.15% 77.18% 12.23% 2.34% 8.10%
1.0 0.15% 78.51% 12.40% 1.38% 7.56%
이와 같이, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제는 첨가량 1.0 U/g-DS에서 80.48%로 말토스를 생성하였으며, 이는 대두 효소 첨가량 1.0 U/g-DS에서의 78.51%의 말토스 생성량에 비해 명확하게 우수하였다.
6-6. α-아밀라제와의 조합(1)
30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)(pH5.8)을 제조하고, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 0.5 U/g-DS, 탈분지 효소로서 Kleistase PLF(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)를 3.3 ㎕/g-DS로 첨가하여, 62℃에서 42시간 반응시켰다. 이 반응액에 α-아밀라제 제제 Kleistase L1(세균 유래, Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)를, 0.198, 0.264, 0.330 ㎕/g-DS 첨가하여, 다시 6시간 및 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)로 분석하였고, 그 결과를 표 12에 나타낸다.
Kleistase L1의 첨가량 (㎕/g-DS) 반응 시간 (h) G1 G2 G3 G4 G5≤
첨가전 0 0.18% 73.00% 12.37% 5.27% 9.18%
0.198 6 0.19% 74.51% 13.04% 5.58% 6.68%
24 0.21% 75.56% 13.84% 6.31% 4.08%
0.264 6 0.19% 74.12% 13.10% 5.64% 6.95%
24 0.22% 75.51% 13.92% 6.37% 3.98%
0.330 6 0.19% 74.87% 13.35% 5.78% 5.81%
24 0.26% 75.41% 13.97% 6.42% 3.94%
이와 같이, α-아밀라제를 첨가함으로써, 말토스 수율을 향상시키고, 또한 G5 이상의 고분자 올리고당을 감소시킬 수 있었다. 이로써, 반응 후의 여과 특성의 개선을 기대할 수 있다.
6-7. α-아밀라제와의 조합(2)
30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)(pH5.8)을 제조하고, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제를 0.6 U/g-DS로, 탈분지 효소로서 Kleistase PLF(Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)를 3.3 ㎕/g-DS로, 및 α-아밀라제 제제로서 Kleistase L1(세균 유래, Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.)를 0.02 ㎕/g-DS 첨가하여, 62℃에서 42시간 동안 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)로 분석하였고, 그 결과를 표 13에 나타낸다.
α-아밀라제 G1 G2 G3 G4 G5≤
무첨가 0.16% 62.52% 11.48% 6.62% 19.22%
Kleistase L1 0.25% 65.96% 16.00% 9.06% 8.73%
이와 같이, α-아밀라제를 첨가함으로써, 말토스 수율을 향상시키고, 또한 G5 이상의 고분자 올리고당을 감소시킬 수 있었다. 이로써, 반응 후의 여과 특성의 개선을 기대할 수 있다.
6-8. α-아밀라제와의 조합(3)
30% 덱스트린 용액(Nissi Co., Ltd., NSD100)(pH5.8)을 제조하고, 바실러스 플렉서스 유래의 β-아밀라제 0.6 U/g-DS 및 α-아밀라제 제제로서 Biozyme L(누룩곰팡이 유래, Amano Enzyme Inc.) 0.10 ㎕/g-DS를 첨가하여, 62℃에서 42시간 동안 반응시켰다. 반응 후의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 MCI GEL CK04S(Mitsubishi Chemical Corporation)로 분석하였고, 그 결과를 표 14에 나타낸다.
α-아밀라제 G1 G2 G3 G4 G5≤
무첨가 0.17% 27.34% 5.83% 5.49% 61.17%
Kleistase L1 0.21% 33.09% 14.95% 11.72% 40.03%
이와 같이, α-아밀라제를 첨가함으로써, 말토스 수율 향상과 더불어 G5 이상의 고분자 올리고당을 감소시킬 수 있었다. 이로써, 반응 후의 여과 특성의 개선을 기대할 수 있다.
7. β-아밀라제에 의한 제빵에서의 영향
β-아밀라제를 빵 반죽에 첨가하여 빵을 제조하였다. 야마가타(山形) 빵용 기본 재료(강력분 260 g; 설탕 13 g; 식염 5.2 g; 쇼트닝 10.4 g; L-아스코르빈산 0.013 g; 냉수 192 g; 드라이 이스트 3.1 g), 또는 이 재료에 β-아밀라제 80 U를 첨가한 것을, 자동 홈 베이커리 SD-BT50(Panasonic Corporation)에 넣었다.
소성 후, 빵을 26℃에서 1시간 방랭하고, 이어서, 이것을 수분 증발을 방지하기 위해 비닐 봉투에 넣어 26℃에서 보존하였다. 1일 또는 5일간 보존한 후, 빵을 2 cm의 두께로 슬라이싱하고, 빵의 중앙부를 직경 47 mm의 원기둥 형태로 잘랐다. 빵의 경도를, FUDOH rheometer NRM-2002 J(RHEOTECH Co., Ltd.)를 사용하여, 압축 스피드 2 mm/분으로 1.5 cm 압축한 경우의 최대 하중을 측정하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다.
부드러움
1일 후 5일 후
효소 첨가군 100% 151%
효소 무첨가군 100% 207%
효소 무첨가군 및 효소 첨가군을 대상으로, 각각 1일 보존한 빵의 경도를 100%로 하여, 5일 보존시의 빵의 경도를 비교하였다. 그 결과, 효소 첨가군은 151%로, 무첨가군(207%)에 비해, 빵의 경화가 억제되었으며, 부드러움이 유지되었다.
8. β-아밀라제에 의한 떡의 노화 방지에 대한 영향
상신분 200 g에 물 165 g을 첨가한 후, 키친 에이드 믹서 KSM5(KitchenAid)에 넣어, 플랫 비터(flat beater)에 의해 균일하게 한 후, 15분간 강한 불에서 쪄서 떡 반죽을 만들었다. 수득한 떡 반죽을 다시 키친 에이드 믹서에 넣어 도우 훅(dough hook)으로 빚었다. 반죽 온도를 55℃로 식힌 후, β-아밀라제 120 U를 첨가하여, 균일하게 분산되도록 3분간 치대어 떡을 만들었다. 만든 떡을 공기가 들어가지 않게 샬레에 채워 넣어, 4℃, 15℃ 및 25℃에서 3일간 정치하였다. 매일, 떡을 직경 28 mm의 원기둥형으로 잘라내, FUDOH rheometer NRM-2002 J(RHEOTECH Co., Ltd.)를 사용하여, 직경 15 mm의 플런저로 압축 스피드 2 mm/분으로 5 mm 압축한 경우의 응력을 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 효소 첨가군은, 무첨가군과 비교하여, 응력에 변화가 없는, 즉 떡의 경화가 억제됨을 알 수 있다. 이러한 경화 억제 효과는 저온 보존시에도 유효하였다.
9. β-아밀라제에 의한 취반미에 대한 영향
쌀 75 g을 수세한 후, 물 150 mL을 첨가하거나, 또는 이 재료에 β-아밀라제 30 U를 첨가하여, 2시간 실온에 정치한 후, 정해진 방법에 의해 취사하여 밥을 지었다. 조리한 취반미를 4℃에서 7일간 보존하였다. 보존 전후의 호화도를 BAP 방법으로 측정하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
호화도
1일 후 7일 후
효소 첨가군 96.2% 62.9%
무첨가군 95.3% 59.7%
BAP 방법에 따른 호화도는, 효소 첨가군이 취사 직후 96.2%, 7일 후 62.9%이었다. 아울러, 무첨가군의 경우에는 취사 직후 95.3%, 7일 후 59.7%이었다. 효소 첨가군에서는 호화도의 저하가 억제되어, 즉 전분의 노화의 진행이 억제되었다.
본 발명의 β-아밀라제는 대두 유래의 β-아밀라제에 필적하는 내열성을 나타내며, 고온에서의 반응이 요구되는 용도에 매우 적합하다. 본 발명의 β-아밀라제를 이용하면, 잡균 오염의 우려가 낮은 고온에서 효소 반응을 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 β-아밀라제는, 말토스 시럽의 제조 등의 전분의 당화, 또는 빵류 또는 빵 반죽의 개선, 떡 또는 떡 과자의 노화 방지, 취반미의 노화 방지 등의 식품 가공 등의 용도에 특히 유용하다.
본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다. 특허청구범위의 내용으로부터 벗어나지 않으면서, 당업자가 용이하게 도달할 수 있는 범위내에서의 여러가지 변형 태양도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 명시된 논문, 공개 특허 공보 및 특허 공보 등의 내용은, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
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MATSUNAGA, Akiko OKADA, Masamichi YAMAGUCHI, Shotaro <120> METHOD FOR PROPERTY MODIFICATION OF FOOD USING BETA-AMYLASE <130> AE09009P <150> JP P2009-168550 <151> 2009-07-17 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus flexus <400> 1 Ala Val Asn Gly Gln Ser Phe Asn Ser Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus flexus <400> 2 Leu Ala His Gln Ala Phe Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus flexus <400> 3 Leu Ser Tyr Asn Ser Thr Tyr Gly Asp 1 5 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> I <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 gcngtnaayg gncarwsntt yaa 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 rtcaarngcy tgrtgngcna r 21 <210> 6 <211> 1638 <212> DNA <213> Bacillus flexus <400> 6 atgtacaagc caattaaaaa gtttgcatca cttattgttt tgttaagttt tgttgccgct 60 ttcatattag ggccaaccaa tagccaagca gcggtaaatg gacagtcgtt taactcgaat 120 tacaagacct atttaatggc accactaaag aaagtaacgg agtttactac gtgggaagct 180 tttgaaaatg accttcggaa ggcaaagcaa aatgggtttt acgctgtgac agtagatttt 240 tggtggggag atatggagaa aaacggtgac cagcagttcg acttttctta tgcacagcga 300 ttcgcacagg cagctcgaaa tgcgggaata aaaatggtgc cgattatctc gacgcatcaa 360 tgtggtggaa atgtaggaga tgactgtaac acgcctcttc cttcatggat ttggaatact 420 aaaacagatg atagcctata ttttaaatca gaaacaggta cagtaaacaa agaaacagta 480 aacccattag cgacagacgt aattacaaaa cagtacgggg agctatacac agcatttgcg 540 caagcgttag caccgtataa agacgttatt ccaaaggttt atttatcagg gggaccagct 600 ggtgagcttc gctatccttc atatacagct gctgatggga caggctaccc ttctagaggg 660 aaatttcaag catacacaga ctttgcaaaa tctaaattcc aaatgtgggc cgttaacaag 720 tatggctcgt tagcgggtgt aaaccaagca tggggactaa gtttaacatc aacatcacaa 780 attttaccac cttcagatgg gaatcagttt ttaaaggatg gatataacac aaactatgga 840 aaagactttc tagaatggta tcaaggagtt ctgcaagacc atgcaaagcg tattggagca 900 ttagctcatc aagcctttga tccggtgttt aatgtgcctg taggagctaa aatagcaggg 960 atacactggc aatataataa tccaacaatg cctcatgctg ctgaaaagcc agcgggttat 1020 aataactaca gtacgttatt agactcattt aaaacagcca agctagattt gacgtttacg 1080 tgcttagaaa tggttgatag cgggacatat cctgagtatt caatgccaaa aacgttagta 1140 aaagaagttg caagcctagc aaacgcaaaa gggattgtat taaatggtga aaatgcttta 1200 agtatcggaa gtgaagagca gtataaacgc gcagctgaaa tgacatttaa ctataacttt 1260 gcgggcttta cgcttttaag attctatgat gttattaata actcaacgcg tatgagccag 1320 tttaatcagc acttaaatat aaaaccggtt gcacagacaa tggttgttaa aaatgcacct 1380 acatcgtctg gagagagtgt ttacatcgtc ggagatcgtc ctgaacttgg acagtgggac 1440 acaatcgctt atccaattaa actctcttac aactcaacgt acggagattg gagaggaacc 1500 gttaatttcc cagccgatcg aagcgttcag ttcaaagcga ttatcaagcg ctcggatggc 1560 tcattaaaat catggcaacc aacccagcag tattggaatg ttccaggaac gcctacaacg 1620 tatacgaata attggtaa 1638 <210> 7 <211> 545 <212> PRT <213> Bacillus flexus <400> 7 Met Tyr Lys Pro Ile Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Val Leu Leu Ser 1 5 10 15 Phe Val Ala Ala Phe Ile Leu Gly Pro Thr Asn Ser Gln Ala Ala Val 20 25 30 Asn Gly Gln Ser Phe Asn Ser Asn Tyr Lys Thr Tyr Leu Met Ala Pro 35 40 45 Leu Lys Lys Val Thr Glu Phe Thr Thr Trp Glu Ala Phe Glu Asn Asp 50 55 60 Leu Arg Lys Ala Lys Gln Asn Gly Phe Tyr Ala Val Thr Val Asp Phe 65 70 75 80 Trp Trp Gly Asp Met Glu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Phe Asp Phe Ser 85 90 95 Tyr Ala Gln Arg Phe Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Gly Ile Lys Met 100 105 110 Val Pro Ile Ile Ser Thr His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Asp 115 120 125 Cys Asn Thr Pro Leu Pro Ser Trp Ile Trp Asn Thr Lys Thr Asp Asp 130 135 140 Ser Leu Tyr Phe Lys Ser Glu Thr Gly Thr Val Asn Lys Glu Thr Val 145 150 155 160 Asn Pro Leu Ala Thr Asp Val Ile Thr Lys Gln Tyr Gly Glu Leu Tyr 165 170 175 Thr Ala Phe Ala Gln Ala Leu Ala Pro Tyr Lys Asp Val Ile Pro Lys 180 185 190 Val Tyr Leu Ser Gly Gly Pro Ala Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Ser Tyr 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Gly Thr Gly Tyr Pro Ser Arg Gly Lys Phe Gln Ala 210 215 220 Tyr Thr Asp Phe Ala Lys Ser Lys Phe Gln Met Trp Ala Val Asn Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Ser Leu Ala Gly Val Asn Gln Ala Trp Gly Leu Ser Leu Thr 245 250 255 Ser Thr Ser Gln Ile Leu Pro Pro Ser Asp Gly Asn Gln Phe Leu Lys 260 265 270 Asp Gly Tyr Asn Thr Asn Tyr Gly Lys Asp Phe Leu Glu Trp Tyr Gln 275 280 285 Gly Val Leu Gln Asp His Ala Lys Arg Ile Gly Ala Leu Ala His Gln 290 295 300 Ala Phe Asp Pro Val Phe Asn Val Pro Val Gly Ala Lys Ile Ala Gly 305 310 315 320 Ile His Trp Gln Tyr Asn Asn Pro Thr Met Pro His Ala Ala Glu Lys 325 330 335 Pro Ala Gly Tyr Asn Asn Tyr Ser Thr Leu Leu Asp Ser Phe Lys Thr 340 345 350 Ala Lys Leu Asp Leu Thr Phe Thr Cys Leu Glu 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Claims (10)

  1. 글루코스의 α-1,4 결합을 주쇄로 하는 다당류 또는 올리고당류를 포함하는 식품에 바실러스 플렉서스(Bacillus flexus) 유래의 β-아밀라제를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 식품의 개질 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식품이 빵류 내지 빵류 반죽(dough), 떡(rice cake) 내지 떡 과자(rice cake sweet), 및 취반미(steamed rice) 내지 취반미 가공품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식품인 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 β-아밀라제가 하기 효소 화학적 성질을 구비한 β-아밀라제인 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법:
    (1) 작용: 다당류 및 올리고당류의 α-1,4 글루코시드 결합에 작용하여 말토스를 유리시킴,
    (2) 기질 특이성: 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에는 양호하게 작용하나, 풀룰란(pullulan), 덱스트란, 사이클로덱스트린, 말토트리오스에는 작용하지 않음,
    (3) 지적(optimum) 온도: 약 55℃,
    (4) 지적 pH: 약 8.0,
    (5) 온도 안정성: 55℃ 이하에서 안정적임(pH 5.0에서 10분간),
    (6) pH 안정성: pH 4?9에서 안정적임(30℃에서 3시간),
    (7) 분자량: 약 60,000(SDS-PAGE).
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 β-아밀라제가 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 등가의 아미노산 서열을 가진 β-아밀라제인 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 등가의 아미노산 서열이 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 β-아밀라제에 추가하여 다른 효소도 작용시키는 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 다른 효소가 리파제, 포스포리파제, 글루코스옥시다제, 자일라나제, 프로테아제, 트랜스글루타미나제, 프로테인글루타미나제, 탈분지 효소, 풀룰라나제, 이소아밀라제, α-아밀라제, 글루코아밀라제 및 말토제닉 α-아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는 식품의 개질 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 개질 방법에 따라 개질된 식품.
  9. 제3항 내지 제5항 중 어느 한항에 따라 정의된 β-아밀라제와, 다른 효소를 배합하여 이루어진 효소 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 다른 효소가 리파제, 포스포리파제, 글루코스옥시다제, 자일라나제, 프로테아제, 트랜스글루타미나제, 프로테인글루타미나제, 탈분지 효소, 풀룰라나제, 이소아밀라제, α-아밀라제, 글루코아밀라제 및 말토제닉 α-아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
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