CN102595910B

CN102595910B - 利用β-淀粉酶的食品改性方法

Info

Publication number: CN102595910B
Application number: CN200980160448.7A
Authority: CN
Inventors: 松永亚希子; 冈田正通; 山口庄太郎
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2029-12-22
Also published as: JP5715346B2; EP2454942A4; WO2011007404A1; EP2454942A1; EP2454942B1; KR20120052263A; DK2454942T3; US20120121760A1; EP2454942A8; CN102595910A; US8895088B2; JP2011036237A

Abstract

本发明的课题是发现实用性优异的新型β淀粉酶，提供它的实用性用途。本发明提供一种食品改性方法，其特征在于，使来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶作用于含有以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖或寡糖的食品。

Description

利用β-淀粉酶的食品改性方法

技术领域

本发明涉及新型β-淀粉酶的用途。具体而言，涉及来自微生物的新型β-淀粉酶在食品领域的应用。本申请基于在2009年7月17日申请的日本专利申请第2009-168550号要求优先权，该专利申请的全部内容通过参照而援引于此。

背景技术

以往，β-淀粉酶已知为起源于大豆、小麦、大麦、麦芽、甘薯、马铃薯等植物的酶。其中，从大豆、小麦、大麦、麦芽等谷物中提取、精制而成的β-淀粉酶在工业上被广泛使用，以制备在制糖产业、制面包产业和酿造产业中使用的含有麦芽糖的糖浆等。在植物源β-淀粉酶中，来自大豆的酶的酶活性高，耐热性也优异。

但是，近年来因生物乙醇的需求扩大而导致玉米价格高涨。受此影响，种植也由大豆、小麦转向玉米。因此，大豆、小麦、大麦等缺货而价格高涨，造成难以确保β-淀粉酶原料的情况。

β-淀粉酶是作用于淀粉、糖原等以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖类，从非还原性末端以麦芽糖单元进行分解的酶。β-淀粉酶已知自古以来存在于大豆、麦类等高等植物中。自1972年宣布在微生物中也存在显示与高等植物β-淀粉酶同样的作用机理的酶以来，发现了作为β-淀粉酶生产菌的许多微生物(非专利文献1)。

迄今为止作为生产β-淀粉酶的菌，报道有蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)等芽孢杆菌属；或者链霉菌属(Streptomyces sp.)；或者假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等。但是其多数生产率低，达到实用化的菌少。

另一方面，曲霉属等丝状菌生产的淀粉酶以内向型分解直链淀粉、支链淀粉。因此，使用该淀粉酶时，麦芽糖以外的葡萄糖、麦芽三糖、其它寡糖也大量生成。另外，该淀粉酶的耐热性也低、作为麦芽糖生产用的实用性低。

嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)生产耐热性高的麦芽糖生成酶(专利文献1、非专利文献2)。该酶从淀粉的非还原性末端以外向型生成麦芽糖，但生成的麦芽糖是α型。另外，报道了该酶不是像植物源β-淀粉酶那样严格地以麦芽糖单元进行水解，而是在反应初期除了麦芽四糖(G4)、麦芽三糖(G3)和麦芽糖(G2)以外还生成少量的麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)，将环(Shardinger)糊精分解成麦芽糖和葡萄糖，以及将麦芽三糖分解成麦芽糖和葡萄糖。因此，利用该酶的淀粉分解物中含有6～8％的葡萄糖。因此，该酶不适于制备高纯度的麦芽糖糖浆。

专利文献

专利文献1：日本特开昭60-2185号公报

非专利文献

非专利文献1：工业用碳水化合物酶手册，讲谈社科学，1999年

非专利文献2：H.Outtrup和B.E.Norman等，淀粉(Starch)第12卷，第405页～411页

发明内容

如上所述，如今对于作为β-淀粉酶的主流的植物源酶，难以稳定地供给。另外，由植物得到的酶量确定，其生产量有限。另一方面，对于来自微生物的酶，由于生产率低或者难以大量培养之类的理由，所以达到实用化的酶少。因此，本发明的课题是发现实用性优异的新型β淀粉酶，提供其实用用途。

本发明人等鉴于上述课题反复进行认真研究。结果发现作为枯草杆菌的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)生产具有与来自大豆的β-淀粉酶匹敌的耐热性的β-淀粉酶。另外，本发明人等成功地将该β-淀粉酶进行分离、精制，确定其酶化学的性质。进而，还成功确定了编码该β-淀粉酶的基因的碱基序列。而且，确认可通过使用导入有含有该基因的载体的转化体而制备β-淀粉酶。另一方面，研究了该β-淀粉酶的用途，结果显示对于食品材料的制备、食品的改性有用。

本发明依据上述成果而完成，如下所述。

[1]一种食品改性方法，其特征在于，使来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶作用于含有以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖或寡糖的食品。

[2]如[1]所述的食品改性方法，其特征在于，食品是选自面包类乃至面包类生面团、饼乃至糕饼、及米饭乃至米饭加工品中的任一种食品。

[3]如[1]或[2]所述的食品改性方法，其特征在于，β-淀粉酶是具备下述酶化学性质的β-淀粉酶，

(1)作用：作用于多糖类和寡糖类的α-1，4糖苷键，游离出麦芽糖；

(2)底物特异性：良好地作用于淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖，而不作用于普鲁兰多糖、葡聚糖、环糊精、麦芽三糖；

(3)最适温度：约55℃；

(4)最适pH：约8.0；

(5)温度稳定性：在55℃以下稳定(pH 5.0，10分钟)；

(6)pH稳定性：在pH 4～9下稳定(30℃，3小时)；

(7)分子量：约60000(SDS-PAGE)。

[4]如[1]或[2]所述的食品改性方法，其特征在于，β-淀粉酶是具有序列号7所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列等价的氨基酸序列的β-淀粉酶。

[5]如[4]所述的食品改性方法，其特征在于，等价的氨基酸序列是与序列号7所示的氨基酸序列90％以上同源的氨基酸序列。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的食品改性方法，其特征在于，不仅使β-淀粉酶作用，也使其它酶作用。

[7]如[6]所述的食品改性方法，其特征在于，其它酶是选自脂肪酶、磷脂酶、葡糖氧化酶、木聚糖酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶、脱支酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶及麦芽糖α-淀粉酶中的一种以上的酶。

[8]一种食品，是利用[1]～[7]中任一项所述的改性方法改性而得的。

[9]一种酶组合物，是将[3]～[5]中任一项所定义的β-淀粉酶和其它酶配合而成的。

[10]如[9]所述的酶组合物，其特征在于，其它酶是选自脂肪酶、磷脂酶、葡糖氧化酶、木聚糖酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶、脱支酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶及麦芽糖α-淀粉酶中的一种以上的酶。

附图说明

[图1]是表示来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的最适温度的图表。

[图2]是表示来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的最适pH的图表。●：柠檬酸缓冲液pH2、3、4，□：伯瑞坦-罗比森缓冲液pH4、5、6、7、8、9、10、11

[图3]是表示来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的温度稳定性的图表。

[图4]是表示来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的pH稳定性的图表。●：柠檬酸缓冲液pH2、3、4，□：伯瑞坦-罗比森缓冲液pH4、5、6、7、8、9、10、11

[图5]是表示精制β-淀粉酶以及精制途中的样品的SDS-PAGE结果的图。泳道1：硫酸铵组分、泳道2：HiPrepButyl 16/10FF、泳道3：HiTrap CM FF、泳道4：HiLoad 16/60 Superdex200

[图6]表达质粒pET-BAF的结构。

[图7]是表示麦芽糖生成量的比较的图表。比较3种β-淀粉酶(来自弯曲芽孢杆菌、来自大麦、来自小麦)的麦芽糖生成量。

[图8]是表示麦芽糖生成量的比较的图表。比较2种β-淀粉酶(来自弯曲芽孢杆菌、来自大豆)的麦芽糖生成量。

[图9]是表示β-淀粉酶的抗老化效果的图表。在25℃(左)、15℃(中央)、4℃(右)下保存添加有β-淀粉酶的饼，研究硬化抑制效果。

具体实施方式

(用语)

在本发明中，所谓“编码蛋白质的DNA”是指使其表达时得到该蛋白质的DNA，即是指具有与该蛋白质的氨基酸序列对应的碱基序列的DNA。因此，也考虑密码子的简并。

在本说明书中，用语“分离”可与“精制”交换使用。在用于本发明的酶(β-淀粉酶)时，“分离”是指当本发明的酶来自天然材料时，在该天然材料中基本上不含有该酶以外的成分(特别是基本上不含有杂蛋白质)的状态。具体而言，例如在本发明的分离的酶中，杂蛋白质的含量以重量换算计为总体的约小于20％，优选约小于10％，进一步优选约小于5％，更进一步优选约小于1％。另一方面，本发明的酶是利用基因工程学方法调制的酶时，用语“分离”是指基本上不含有来自所使用的宿主细胞的其它成分、培养液等的状态。具体而言，例如在本发明的分离的酶中杂成分的含量以重量换算计为总体的约小于20％，优选约小于10％，进一步优选约小于5％，更进一步优选约小于1％。应予说明，在没有明确表示与其不同的意思的情况下，本说明书中简单地记载“β-淀粉酶”时，是指“分离状态的β-淀粉酶”。对用于代替β-淀粉酶的用语“本酶”也同样。

在用于DNA时的“分离”在原本天然存在的DNA的情况下，典型地是指从在天然状态下共存的其它核酸中分离的状态。但是，可以含有天然状态下邻接的核酸序列(例如启动子区域的序列、终止子序列等)等一部分其它核酸成分。例如在为基因组DNA时的“分离”状态下，优选基本上不含有在天然状态下共存的其它DNA成分。另一方面，在为利用cDNA分子等基因工程学方法调制的DNA时的“分离”状态下，优选基本上不含有细胞成分、培养液等。同样地，在为利用化学合成调制的DNA时的“分离”状态下，优选基本上不含有dNTP等前体(原材料)、合成过程中使用的化学物质等。应予说明，在没有明确表示与其不同的意思的情况下，在本说明书中简单地记载“DNA”时，是指分离状态的DNA。

(β-淀粉酶及其生产菌)

本发明的第1方式提供β-淀粉酶(以下，也称为“本酶”)及其生产菌。如后述实施例所示，本发明人等认真研究，结果发现弯曲芽孢杆菌产生耐热性β-淀粉酶。另外，成功地将该β-淀粉酶进行分离、生成，并且如下所示，成功地确定其酶化学性质。

(1)作用

本酶是β-淀粉酶，作用于多糖类和寡糖类的α-1，4糖苷键，游离出麦芽糖。葡萄糖几乎不游离。

(2)底物特异性

本酶的底物特异性优异，对淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖作用良好。与此相对，对普鲁兰多糖、葡聚糖、环糊精、麦芽三糖不起作用。将以可溶性淀粉为底物时的活性设为基准(100％)时，如果相对活性为50％以上，则判断“是本酶作用良好的底物”。同样地如果相对活性小于10％，则判断“是本酶不起作用的底物”。本酶对麦芽三糖和环糊精(α、β、或γ)不具有实质性作用。应予说明，本酶的反应性和底物特异性可以用在后述实施例中示出的方法(β-淀粉酶活性测定方法(1))进行测定、评价。

(3)最适温度

本酶的最适温度约为55℃。本酶在约50℃～约60℃下显示高活性。最适温度是利用根据后述β-淀粉酶活性测定方法(0.1M磷酸-盐酸缓冲液(pH5.0)中)的测定而算出的值。

(4)最适pH

本酶的最适pH约为8.0。本酶在pH为约6.0～约9.0下显示高活性。例如对于pH 2～4的pH区域，在柠檬酸缓冲液中进行测定，对于pH 4～11，在伯瑞坦-罗比森缓冲液中进行测定，以其结果为基础判断最适pH。

(5)温度稳定性

本酶显示与来自大豆的β-淀粉酶匹敌的优异的耐热性。即使在含有10mM乙酸钙的0.1M乙酸-盐酸缓冲液(pH5.0)中于55℃的条件下处理10分钟，本酶也维持90％以上的活性。

(6)pH稳定性

本酶在pH 4～9这样宽的pH域中显示稳定的活性。即，如果供处理的酶溶液的pH在该范围内，则于30℃处理3小时后，显示最大活性的70％以上的活性。例如对于pH 2～4的pH区域，在柠檬酸缓冲液中进行测定，对于pH 4～11，在伯瑞坦-罗比森缓冲液中进行测定，以其结果为基础判断最适pH。

(7)分子量

本酶的分子量约是60000(利用SDS-PAGE法)。

本酶优选是来自弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)的β-淀粉酶。这里的“来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶”是指被分类为弯曲芽孢杆菌的微生物(可以是野生株也可以是突变株)生产的β-淀粉酶、或者利用弯曲芽孢杆菌(可以是野生株也可以是突变株)的β-淀粉酶基因通过基因工程学方法而得到的β-淀粉酶。因此，利用导入有由弯曲芽孢杆菌取得的β-淀粉酶基因(或改变该基因而得的基因)的宿主微生物所生产的重组体也属于“来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶”。

为了说明方便，将成为本酶来源的弯曲芽孢杆菌称为本酶的生产菌。作为本酶的生产菌的例子，可举出在后述实施例中表示的弯曲芽孢杆菌DSM1316(DSMZ，德国)、DSM1320(DSMZ，德国)、DSM1667(DSMZ，德国)、APC9451。APC9451株如下所述保藏在规定的保藏机构，可容易地获得。

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)专利微生物保藏中心(292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)

保藏日(接受日)：2008年4月9日

保藏号：NITE BP-548

如上所述，明确了成功取得的本酶的性状的详细情况。结果可知本酶的耐热性优异、底物特异性优异。因此，本酶适于食品加工和糖化用途。

本发明人等进一步研究的结果确定了弯曲芽孢杆菌产生的β-淀粉酶的氨基酸序列(序列号7)。因而，本发明的一个方式具备由具有序列号7的氨基酸序列的蛋白质构成这样的特征。在此，一般而言，在对某种蛋白质的氨基酸序列的一部分实施改变时，有时改变后的蛋白质具有与改变前的蛋白质同等的功能。即有时氨基酸序列的改变不对蛋白质的功能给与实质性的影响，蛋白质的功能在改变前后得到维持。因而，作为本发明的其它方式，提供由与序列号7表示的氨基酸序列等价的氨基酸序列构成且具有β-淀粉酶活性的蛋白质(以下，也称为“等价蛋白质”)。这里的“等价氨基酸序列”是指与序列号7所示的氨基酸序列一部分不同但该不同不对蛋白质的功能(这里是β-淀粉酶活性)给与实质性影响的氨基酸序列。“具有β-淀粉酶活性”是指作用于淀粉、糖原等以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖类或寡糖类而从非还原性末端以麦芽糖单元进行分解的活性，但该活性的程度只要能发挥作为β-淀粉酶的功能就没有特别限定。其中，优选与由序列号7所示的氨基酸序列构成的蛋白质相同程度或比其高。

“氨基酸序列的一部分不同”典型地是指因构成氨基酸序列的1～数个氨基酸的缺失、取代、或者1～数个氨基酸的添加、插入、或者它们的组合而导致在氨基酸序列中发生突变(变化)。这里的氨基酸序列的不同只要β-淀粉酶活性得以保持则允许(活性多少可以有变动)。只要满足该条件，则氨基酸序列不同的位置没有特别限定，或者可以在多个位置产生不同。这里的多个例如是相当于小于总氨基酸的约30％的数目，优选相当于小于约20％的数目，进一步优选相当于小于约10％的数目，更进一步优选相当于小于约5％的数目，最优选相当于小于约1％的数目。即等价蛋白质与序列号7的氨基酸序列例如具有约70％以上、优选约80％以上、进一步优选约90％以上、更进一步优选约95％以上、最优选约99％以上的同源性。

优选通过在对β-淀粉酶活性不必需的氨基酸残基中发生保守性氨基酸取代而得到等价蛋白质。这里的“保守性氨基酸取代”是指将某氨基酸残基替换成具有相同性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这几种类别。保守性氨基酸取代优选为同一类别内的氨基酸残基间的取代。

“等价蛋白质”可以具有附加的性质。作为该性质，例如可举出与由序列号7所示的氨基酸序列构成的蛋白质相比稳定性优异这样的性质、仅在低温和/或高温下才发挥不同功能的性质、最适pH不同的性质等。

但是，两个氨基酸序列或两个核酸(以下，作为含有它们的用语，使用“两个序列”)的同源性(％)例如可以用以下顺序来确定。首先，以可进行最适比较的方式将两个序列进行排列(例如可以在第一序列中导入空位而使得与第二序列的比对达到最适化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。两个序列的同源性是该两个序列中共同的相同位置的数目的函数(即，同源性(％)＝同一位置的数目/位置的总数×100)，优选将比对的最适化中所需的空位的数目和尺寸也纳入考虑。两个序列的比较和同源性的确定可以利用数学算法来实现。作为在序列比较中可利用的数学算法的具体例，有Karlin及Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。这种算法已被编入Altschul等在(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序及XBLAST程序(版本2.0)。要得到与本发明的核酸分子等价的核苷酸序列，例如可以在NBLAST程序中以score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索。要得到与本发明的多肽分子等价的氨基酸序列，例如可以在XBLAST程序中以score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索。为了获得用于比较的空位比对，可以利用在Altschul等(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。在利用BLAST及GappedBLAST时，可以使用对应程序(例如XBLAST及NBLAST)的缺省参数。详细而言例如请参考NCBI的网页。作为可用于序列比较中的其它数学算法的示例，有Myers及Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这种算法例如已被编入可在GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比较中使用ALIGN程序时，例如可使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12、空位罚分＝4。

两个氨基酸序列的同源性可如下确定：用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，使空位权重＝12、10、8、6或4，使空位长权重＝2、3或4。另外，可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com中利用)的GAP程序，使空位权重＝50、空位长权重＝3来确定两个核酸序列的同源度。

本酶可以是更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部份。作为在融合蛋白质中所附加的序列，例如可举出多重组氨酸残基之类的对精制有用的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可以通过基因工程学方法而容易地进行调制。例如可以通过用编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)、回收转化体内表达的蛋白质而制得。回收的蛋白质可根据目的而适当精制。如果由此得到本酶作为重组蛋白质，则可以进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入同一载体而使用该载体进行重组蛋白质的生产，则可以得到由连接有任意的肽乃至蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。另外，可以实施糖链和/或脂质的附加、或者N末端或C末端的加工的修饰。利用如上修饰，可以简化重组蛋白质的提取、精制，或者附加生物学的功能等。

(编码β-淀粉酶的DNA)

本发明的第2方面提供编码本酶的基因、即新型的β-淀粉酶基因。在一个方式中，本发明的基因由编码序列号7的氨基酸序列的DNA构成。该方式的具体例是由序列号6所示的碱基序列构成的DNA。

然而，一般在对编码某蛋白质的DNA的一部分实施改变的情况下，有时改变后的DNA编码的蛋白质与改变前的DNA编码的蛋白质具有相同的功能。即，有时DNA序列的改变对编码的蛋白质的功能没有给与实质性的影响，编码的蛋白质的功能在改变前后得以维持。因此，作为其它方式，本发明提供具有与序列号6所示的碱基序列等价的碱基序列的、编码保持β-淀粉酶活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“等价DNA”)。这里的“等价的碱基序列”是指虽然与序列号6所示的核酸一部分不同但不会因该不同而使其编码的蛋白质的功能(这里是β-淀粉酶活性)受到实质性影响的碱基序列。

等效DNA的具体例是对与序列号6的碱基序列互补的碱基序列在严谨性条件下进行杂交的DNA。在此的“严谨性条件”是指形成所谓特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这种严谨型条件为本领域技术人员所公知，例如可参考Molecular Cloning(Third Edition，Cold SpringHarbor Lab oratory Press，New York)、Current protocols in molecularbiology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)进行设定。作为严谨性条件，例如可举出使用杂交液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃下进行温育，其后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下进行清洗的条件。作为更优选的严谨性条件，例如可举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

作为等价DNA的其它具体例，可以举出由以序列号6所示的碱基序列为基准且包括1个或多个碱基的取代、缺失、插入、添加、或倒位的碱基序列构成的、编码具有β-淀粉酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以发生在多个部位。这里的“多个”是指根据该DNA编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类不同而异，但例如为2～40个碱基、优选为2～20个碱基、更优选为2～10个碱基。如上所述的等效DNA例如可通过以下得到：利用限制性内切酶处理、基于核酸外切酶或DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(MolecularCloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)或随机突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)的突变导入等，以包含碱基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的方式改变具有序列号6所示的碱基序列的DNA，从而得到。并且，也可以利用紫外线照射等其它方法得到等效DNA。

作为等效DNA的进一步的其它示例，可举出由于SNP(单核苷酸多态性)所代表的多态性而可确认如上碱基的不同的DNA。

本发明的基因可以通过参考本说明书或附加的序列表所示的序列信息，使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法等而调制成分离的状态。具体而言，可以由适当的弯曲芽孢杆菌的基因组DNA文库或cDNA文库、或者弯曲芽孢杆菌的菌体内提取液，适当使用对本发明的基因能特异性地进行杂交的寡聚核苷酸探针·引物而调制。寡聚核苷酸探针·引物可以利用市售的自动化DNA合成装置等而容易地合成。应予说明，对用于调制本发明的基因的文库的制作方法，例如可参考Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。

例如，如果为具有序列号6的碱基序列的基因，则可利用以该碱基序列或其互补序列的整体或一部分为探针的杂交法进行分离。此外，可利用核酸扩增反应(例如PCR)进行扩增及分离，该核酸扩增反应使用以对该碱基序列的一部分进行特异性杂交的方式设计而成的合成寡核苷酸引物。此外，也可以以序列号7所示的氨基酸序列、序列号6的碱基序列的信息为基础，通过化学合成而获得作为目标的基因(参考文献：Gene，60(1)，115-127(1987))。

以下，例示本发明的基因的取得法的具体例。首先，从弯曲芽孢杆菌中分离、精制本酶(β-淀粉酶)，得到涉及其部分氨基酸序列的信息。作为确定部分氨基酸序列的方法，例如将精制的β-淀粉酶直接按照常规方法供以利用Edman降解法〔The Journal of biological chemistry，第256卷，第7990～7997页(1981)〕进行氨基酸序列分析〔ProteinSequencer 476A，Applied Biosystems公司制等〕。使蛋白质水解酶作用而进行限制性水解，将所得的肽片段进行分离精制，对所得的精制肽片段进行氨基酸序列分析，这是有效的。

以这样得到的部分氨基酸序列的信息为基础，克隆β-淀粉酶基因。例如可以利用杂交法或PCR进行克隆。利用杂交法时，例如可使用Molecular Cloning(Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)中记载的方法。

利用PCR法时，可使用以下的方法。首先，以产生β-淀粉酶的微生物的基因组DNA为模板，使用以部分氨基酸序列的信息为基础进行设计的合成寡聚核苷酸引物进行PCR反应，得到目标基因片段。PCR法根据PCR技术(PCR Technology，Erlich HA编辑，Stocktonpress公司，1989年发行)记载的方法进行。进而，若对该扩增DNA片段使用通常所用的方法，例如双脱氧链终止法来确定碱基序列，则在经确定的序列中除了合成寡聚核苷酸引物的序列以外还发现与β-淀粉酶的部分氨基酸序列对应的序列，而可获得目标β-淀粉酶基因的一部分。以所得的基因片段为探针进一步进行杂交法等，从而能够克隆编码β-淀粉酶全长的基因。

在后述实施例中，利用PCR法确定编码弯曲芽孢杆菌产生的β-淀粉酶的基因的序列。将编码来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的基因的全碱基序列示于序列号6。另外，确定了该碱基序列编码的氨基酸序列(序列号7)。应予说明，与序列号7所示的氨基酸序列对应的碱基序列除序列号6记载的序列以外还存在多个。

通过将明确了全碱基序列的β-淀粉酶基因(序列号6)的整体或一部分用作杂交用的探针，从而可以从其它产生β-淀粉酶的微生物的基因组DNA文库或cDNA文库中选择出与序列号6的β-淀粉酶基因同源性高的DNA。

同样地，可以设计PCR用的引物。通过使用该引物进行PCR反应，从而可以检测出与上述β-淀粉酶基因同源性高的基因片段，进而也可以得到其基因整体。

通过制备所得基因的蛋白质且测定该β-淀粉酶活性，从而可确认是否为编码具有β-淀粉酶活性的蛋白质的基因。另外，通过将所得基因的碱基序列(或其编码的氨基酸序列)与上述β-淀粉酶基因的碱基序列(或其编码的氨基酸序列)进行比较，从而也可以研究基因结构、同源性，判定是否编码具有β-淀粉酶活性的蛋白质。

由于一级结构和基因结构得到明确，所以可以利用随机突变或部位特异性突变的导入而得到改变型β-淀粉酶(实施有1个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代中的至少1种的基因)。由此，可以得到编码具有β-淀粉酶活性而最适温度、稳定温度、最适pH、稳定pH、底物特异性等性质不同的β-淀粉酶的基因。另外，可以基因工程学地制备改变型β-淀粉酶。

在此，导入突变时的计划例如可参考基因序列上的特征序列而进行。特征序列的参考例如可以考虑该蛋白质的立体结构预测、与已知蛋白质的同源性来进行。

若例示导入随机突变的方法，则作为化学处理DNA的方法，为使亚硫酸氢钠作用而引发将胞嘧啶碱基变换为尿嘧啶碱基的转换突变的方法〔Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第79卷，第1408～1412页(1982)〕，作为生化学方法，为在存在〔α-S〕dNTP的情况下合成双链的过程中引发碱基取代的方法〔Gene，第64卷，第313～319页(1988)〕，作为使用PCR的方法，为向反应系加入锰进行PCR而降低核苷酸获取的正确性的方法〔AnalyticalBiochemistry，第224卷，第347～353页(1995)〕等。

若例示导入部位特异性突变的方法，则为利用琥珀突变的方法〔缺口双链(gapped duplex)法，Nucleic Acids Research，第12卷，第24号，第9441～9456页(1984)〕、利用限制性内切酶的识别部位的方法〔Analytical Biochemistry，第200卷，第81～88页(1992)，Gene、第102卷，第67～70页(1991)〕、利用dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖苷酶)突变的方法〔Kunkel法，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA，第82卷，第488～492页(1985)〕、利用使用了DNA聚合酶和DNA连接酶的琥珀突变的方法〔Oligonucleotide-directed Dual Amber：ODA法，Gene，第152卷，第271～275页(1995)，日本特开平7-289262号公报〕、利用诱导了DNA的修复系统的宿主的方法(日本特开平8-70874号公报)、利用催化DNA链交换反应的蛋白质的方法(日本特开平8-140685号公报)、基于使用添加了限制性内切酶的识别部位的2种突变导入用引物的PCR的方法(美国专利第5,512,463号)、基于使用具有非活化耐药性基因的双链DNA载体和2种引物的PCR的方法〔Gene，第103卷，第73～77页(1991)〕、利用琥珀突变的PCR的方法〔国际公开WO98/02535号公报〕等。

通过使用市售的试剂盒，也能将部位特异性突变容易地导入。作为市售的试剂盒，例如可使用以下试剂盒：使用缺口双链法的Mutan(注册商标)-G(宝酒造公司制)、使用Kunkel法的Mutan(注册商标)-K(宝酒造公司制)、使用ODA法的Mutan(注册商标)-ExpressKm(宝酒造公司制)、使用突变导入用引物和来自强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的DNA聚合酶的QuikChangeTM定点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)〔STRATAGENE公司制〕等，此外，作为利用PCR法的试剂盒，可使用TaKaRa LA聚合酶链反应在体外突变试剂盒(PCR in vitro Mutagenesis Kit)(宝酒造公司制)、Mutan(注册商标)-Super Express Km(宝酒造公司制)等。

这样，通过本发明提供β-淀粉酶的一级结构和基因结构，从而可以廉价且高纯度地进行具有β-淀粉酶活性的蛋白质的基因工程学制备。

(重组载体)

本发明的另一方面涉及含有本发明的基因的重组载体。本说明书中的用语“载体”是指能将插入该载体的核酸分子输送至细胞等靶内的核酸分子，对其种类、形态没有特别限定。因此，本发明的载体可以采用质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等)的形态。

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，还考虑宿主细胞的种类，而选择适当的载体。若举出载体的具体例，则有以大肠杆菌为宿主的载体(M13噬菌体或其变异体、λ噬菌体或其变异体、pBR322或其变异体(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母为宿主的载体(pYepSec1、pMFa、pYES2等)、以昆虫细胞为宿主的载体(pAc、pVL等)、以哺乳类细胞为宿主的载体(pCDM8、pMT2PC等)等。

本发明的重组载体优选为表达载体。“表达载体”是指可以将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内，且能够使之在该细胞内表达的载体。表达载体通常含有对插入的核酸的表达必需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。还可以使用含有选择标记的表达载体。使用该表达载体时，可以利用选择标记来确认表达载体导入的有无(及其程度)。

本发明的基因的向载体的插入、选择标记基因的插入(需要的情况下)、启动子的插入(需要的情况下)等可使用标准的重组DNA技术(例如可参考Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，是使用限制性内切酶及DNA连接酶的公知方法)进行。

(转化体)

本发明还涉及导入有本发明的基因的宿主细胞(转化体)。在本发明的转化体中，本发明的基因会作为外源性分子存在。本发明的转化体优选通过使用上述本发明载体的转染乃至转化而调制。转染、转化可通过磷酸钙共沉降法、电穿孔(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂质体(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))、显微注射(Graessmann，M.& Graessmann，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166，557-580(1983))、乙酸锂法(Schiestl，R.H.et al.，Curr.Genet.16，339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton，M.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，1470-1474(1984))等实施。

作为宿主细胞，可使用微生物、动物细胞、植物细胞等。作为微生物，可举出大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)属、链霉菌(Streptomyces)属、乳球菌(Lactococcus)属等细菌、酵母菌(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属等酵母、曲霉(Aspergillus)属、青霉(Penicillium)属、木霉(Trichoderma)属等丝状菌。作为动物细胞，可举出杆状病毒系统。

(β-淀粉酶的制备法)

本发明的另一方面提供β-淀粉酶的制备法。本发明的制备法的一个方式中，进行培养具有生产本酶(β-淀粉酶)的能力的弯曲芽孢杆菌的步骤(步骤(1))以及从培养后的培养液和/或菌体中回收β-淀粉酶的步骤(步骤(2))。

作为步骤(1)中的弯曲芽孢杆菌，例如可使用上述弯曲芽孢杆菌DSM1316、DSM1320、DSM1667、APC9451等。培养法和培养条件只要能生产目标酶则没有特别限定。即，可以将生产本酶作为条件而适当设定适于培养所用微生物的方法、培养条件。作为培养法，液体培养、固体培养中的任一种均可，优选利用液体培养。以液体培养为例，说明其培养条件。

作为培养基，只要是所用微生物可生长的培养基就可任意使用。例如，可使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进而添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵的培养基；或者使用添加有蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉提取物等氮源，进而添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所用微生物的生长，可以向培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调整为约3～10、优选为约7～8左右，培养温度通常为约10～50℃、优选为约20～37℃左右，在需氧条件下培养1～7天、优选3～4天左右。作为培养方法，例如可利用振荡培养方法，利用发酵罐的需氧深层培养方法。

在以上条件下进行培养后，从培养液或菌体中回收β-淀粉酶(步骤(2))。从培养液中回收时，例如可通过将培养上清进行过滤、离心处理等而去除不溶物，然后通过适当组合利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等来进行分离、精制，从而得到本酶。

另一方面，从菌体内回收时，例如可将菌体通过加压处理、超声波处理等进行破碎后，与上述同样地进行分离、精制，从而得到本酶。应予说明，也可以利用过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体，然后进行上述一系列工序(菌体的破碎、分离、精制)。

应予说明，对表达的确认、表达产物的确认，使用针对β-淀粉酶的抗体进行是简便的，但也可以通过测定β-淀粉酶活性而进行表达的确认。

本发明的其它方式中，可使用上述转化体制备β-淀粉酶。该方式的制备法中，首先，在产生由导入其中的基因所编码的蛋白质的条件下培养上述转化体(步骤(i))。关于各种载体宿主体系，转化体的培养条件是公知的，本领域技术人员能容易地设定适当的培养条件。在培养步骤后，回收产生的蛋白质(即β-淀粉酶)(步骤(ii))。对于回收和其后的精制，与上述方式的情况同样地进行即可。本酶的精制度没有特别限定。另外，最终形态可以是液态也可以是固态(包括粉状)。

(酶组合物)

本发明的酶例如可以以酶组合物(酶剂)的形式提供。酶组合物除了有效成分(本发明的酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

本发明的酶组合物的一种方式是除本发明的酶(来自弯曲芽孢杆菌的β淀粉酶)以外还含有其它酶作为有效成分。由此，成为可进行复合酶反应的酶组合物。作为该“其它酶”，可举出脂肪酶、磷脂酶、葡糖氧化酶、木聚糖酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶、脱支酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖α-淀粉酶等。作为脱支酶例如可举出Kleistase PL45(大和化成公司制)，作为支链淀粉酶例如可举出支链淀粉酶“Amano”3(天野酶公司制)，作为异淀粉酶可举出来自淀粉皮假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)的酶，作为α-淀粉酶例如可举出Kleistase P8(大和化成公司制)或BiozymeL(天野酶公司制)，作为葡糖淀粉酶例如可举出Gluczyme AF6(天野酶公司制)，作为麦芽糖α-淀粉酶例如可举出来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的酶。应予说明，作为“其它酶”可采用两种以上的酶。

(β-淀粉酶的用途)

本发明的另一方面提供生成麦芽糖的方法作为来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的用途。本发明的麦芽糖生成法中，使来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶作用于由以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖或寡糖构成的底物。作为底物的例子，可举出可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、支链淀粉、糖原、麦芽寡糖。底物的纯度没有特别限定。因此，可以使β-淀粉酶作用于与其它物质混杂状态下的底物。另外，也可以使β-淀粉酶同时作用于两种以上的底物。

本发明的麦芽糖生成法的特征在于，使用来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶，优选使用上述本发明的β-淀粉酶(本酶)作为β-淀粉酶。本发明的麦芽糖生成法例如可用于含麦芽糖的糖浆、麦芽糖糖稀的生产。

本发明的另一方面为提供利用来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶作为面包类及面包生面团的品质改良剂、饼·糕饼的抗老化剂、或米饭的抗老化剂等的方法。本发明中将这种使食品特性改变的方法称为“食品改性方法”。可利用本发明的食品改性方法而改性的食品是含有以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖或寡糖的食品。只要满足该条件，则不限定食品。如果例示用本发明可改性的食品，则是面包类乃至面包类生面团、饼乃至糕饼、米饭。本发明中“面包类乃至面包类生面团”是指以小麦粉为主要原料，向其中加水等，进而根据需要添加油脂、糖类、乳制品、蛋、发酵食物、各种酶类、各种乳化剂等原料后，无论有无添加酵母均经过混捏工序而得到的一般的生面团、饼或馒头生面团、炸面圈生面团、馅饼生面团、匹萨生面团、烤饼生面团、海绵蛋糕生面团、薄脆饼生面团、饺子生面团等，以及将这些生面团进行成型、加热(用烤箱或炊具等烤、蒸、油炸等而得到的制品(面包、炸面圈、馅饼、匹萨、烤饼、海绵蛋糕、薄脆饼、饺子等)。还包括混入小麦粉以外的谷物，例如黑麦等而得到的生面团、制品等。

本发明中“饼乃至糕饼”是指板饼、豆馅团子、槲叶饼、艾糕、樱叶饼、丸子、点心、米粉糕、日本米粉饺子、牛皮糖饼、轻羹馒头、薯蓣馒头等的以米或米粉为主要原料，向其中加水，进而根据需要添加糖类等原料且混合而得的饼生面团、以及将它们蒸制而得的制品。应予说明，这里的“米或米粉”包括粳米、糯米、或者将粳米水洗且干燥粉碎而得的上新粉、并新粉以及将糯米水洗且干燥制粉而得的糯米粉等。进而，也包括构成米或米粉的淀粉。

本发明中“米饭乃至米饭加工品”是指将米类做成的米饭及将米饭加工而得的制品。这里的米类是指米、糯米、糙米等所有米类。这些材料可单独使用，也可混合多种，进而还可以混合其它谷类。在做饭步骤实施调味、添加风味等的制品(红豆饭、菜饭、粥等)，对米饭进行调味、添加风味等的制品(肉汁烩饭、粥等)、或利用米饭的各种食品(饭团、寿司、便当、米粉)等也属于“米饭乃至米饭加工品”。

本发明的改性方法中，使来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶作用于如上述的食品。使β-淀粉酶作用的时间没有特别限定，但通常是通过在原材料中添加、混合β-淀粉酶而进行食品的制备、加工，或者通过向制备、加工中的食品里添加β-淀粉酶从而使酶作用。β-淀粉酶的添加量也随改性对象的食品、改性程度等不同而异，但例如是每100g食品为2U～40U。应予说明，这里的活性值由后述的β-淀粉酶活性测定方法(2)所规定。

本发明的麦芽糖生成法或面包类、饼、米饭等食品的改性方法中，除了β-淀粉酶以外，还可并用其它酶。作为该“其它酶”，可使用作用于以葡萄糖的α-1，4键为主链的多糖或寡糖的酶。该酶的例子是脱支酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖α-淀粉酶。作为脱支酶例如可举出Kleistase PL45(大和化成公司制)，作为支链淀粉酶例如可举出支链淀粉酶“Amino”3(天野酶公司制)，作为异淀粉酶可举出来自淀粉皮假单胞菌的酶，作为α-淀粉酶例如可举出KleistaseP8(大和化成公司制)或Biozyme L(天野酶公司制)，作为葡糖淀粉酶例如可举出Gluczyme AF6(天野酶公司制)，作为麦芽糖α-淀粉酶例如可举出来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的酶。在面包类、饼、米饭等食品的改性方法中，作为“其它酶”也可使用脂肪酶、磷脂酶、葡糖氧化酶、木聚糖酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶等。应予说明，也可采用两种以上的酶作为“其它酶”。

典型地，可使β-淀粉酶和“其它酶”同时发挥作用。但是，也可以使β-淀粉酶作用后使“其它酶”作用，或者也可以以与其相反顺序使两者作用。

实施例

<β-淀粉酶活性测定方法(1)>

β-淀粉酶的活性如下测定。即，在含有1％可溶性淀粉和10mM乙酸钙的0.1M磷酸-盐酸缓冲液(pH5.0)0.5ml中添加酶溶液0.5ml，在37℃下温育30分钟后，加入DNS溶液(0.2％DNS，80mM NaOH，0.2M酒石酸钠钾四水合物)2.5ml停止反应。反应停止后，煮沸5分钟，测定波长为530nm处的吸光度。将波长为530nm处的吸光度成为1的酶量作为1个单位(U)。

1.来自弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)的β-淀粉酶的确认

对于4株弯曲芽孢杆菌DSM1316、DSM1320、DSM1667、APC9451，使用表1所示组成的液体培养基在30℃下振荡培养3天。

[表1]

β-淀粉酶生产培养基

	(w/v)
		玉米浆	2％
可溶性淀粉	4％
		碳酸钙	2％

用上述β-淀粉酶活性测定法对所得培养上清液中的β-淀粉酶活性进行测定。将其结果示于表2。

[表2]

	活性(u/ml)
		DSM1316	4.0
DSM1320	14.8
		DSM1667	4.0
APC9451	5.7

2.来自弯曲芽孢杆菌APC9451的β-淀粉酶的生产和精制

使用表1所示组成的液体培养基将弯曲芽孢杆菌APC9451在30℃下振荡培养3天。用UF膜(AIP-0013，旭化成公司制)将得到的培养上清液浓缩4倍后，以成为60％饱和浓度的方式添加硫酸铵。将沉淀组分再次溶解于20mM乙酸缓冲液(pH5.5)中，接着以成为20％饱和浓度的方式添加硫酸铵。用离心除去生成的沉淀后，提供到用含有20％饱和浓度的硫酸铵的20mM乙酸缓冲液(pH5.5)平衡化的HiPrep Butyl16/10 FF柱(GE Healthcare公司制)上，利用从20％饱和浓度到0％饱和浓度的硫酸铵线性浓度梯度，洗脱吸附的β-淀粉酶蛋白质。

用UF膜浓缩收集的β-淀粉酶活性组分后，提供到用20mM乙酸缓冲液(pH5.5)平衡化的HiTrap CM FF柱(GE Healthcare公司制)上，利用从0M到0.5M的NaCl线性浓度梯度，洗脱吸附的β-淀粉酶蛋白质。

进而，用UF膜浓缩收集的β-淀粉酶活性组分后，提供到用含有0.15M NaCl的20mM乙酸缓冲液(pH5.5)平衡化的HiLoad 16/60Superdex200柱(GE Healthcare公司制)上，用相同缓冲液洗脱。收集β-淀粉酶活性组分，用超滤膜进行脱盐浓缩，得到精制酶标准品。得到的本精制酶供以下述各种性质的研究，还供以N末端氨基酸序列分析和内部肽氨基酸序列分析。

应予说明，将各步骤中的精制结果示于表3。最终阶段的比活性是粗酶的2270倍。图5中示出用10-20％的梯度凝胶将精制工序中的各步骤的样品进行SDS-PAGE(CBB染色)的结果。可知本精制酶标准品(泳道4)在SDS-PAGE中是单一蛋白质。

[表3]

3.耐热性β-淀粉酶的各种性质

(1)最适反应温度

根据上述β-淀粉酶活性测定法，使反应温度为25℃、37℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃而进行反应。以将显示最高活性的温度的值设为100％的相对活性表示。最适反应温度为55℃附近(图1)。

(2)最适反应pH

底物中使用1％可溶性淀粉，在各缓冲液(柠檬酸缓冲液pH2、pH3、pH4，伯瑞坦-罗比森缓冲液pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11)中于37℃、10分钟的反应条件下进行测定。以将显示最大活性值的pH值设为100％的相对活性表示。最适反应pH为约8.0附近(图2)。

(3)温度稳定性

在37℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的各温度下将20U/ml的酶液在含有10mM乙酸钙的0.1M乙酸-盐酸缓冲液(pH5.0)中热处理10分钟后，用上述β-淀粉酶活性测定法测定残存活性。以将对热未处理的活性设为100％的残存活性表示。在55℃、10分钟的热处理中，具有90％以上的残存活性，到55℃为止是稳定的(图3)。

(4)pH稳定性

在各缓冲液(柠檬酸缓冲液pH2、pH3、pH4，伯瑞坦-罗比森缓冲液pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11)中在30℃下处理3小时后，用上述β-淀粉酶活性测定法测定活性。以将显示最大活性值的pH值设为100％的相对活性表示。最适反应pH是4～9(图4)。

(5)利用SDS-PAGE的分子量测定

SDS-PAGE按照Laemmli等的方法进行。应予说明，使用的分子量标记是电泳低分子量标定试剂盒(GE Healthcare公司)，作为标准蛋白质，含有磷酸化酶b(97000Da)、白蛋白(66000Da)、卵清蛋白(45000Da)、碳酸酐酶(30000Da)、胰蛋白酶抑制剂(20100Da)、α-乳清蛋白(14400Da)。使用凝胶浓度为10-20％的梯度凝胶(Wako)以20mA/凝胶进行约80分钟电泳，求出分子量，结果分子量约为60kDa(图5)。

(6)等电点

利用使用了两性电解质的等电点聚焦(600V，4℃，通电48小时)进行测定，结果本酶的等电点是9.7。

(7)金属离子和抑制剂的影响

在含有10mM乙酸钙的0.1M乙酸-盐酸缓冲液(pH5.0)中的β-淀粉酶中分别添加1mM的各种金属离子或抑制剂，在30℃下处理30分钟后，用上述β-淀粉酶活性测定法测定活性。将其结果示于表4。以将未添加的情况设为100％的相对活性表示。受到Cu离子、碘代乙酸、PCMB、SDS抑制。

[表4]

	相对活性(％)
		Na⁺	88
K⁺	96
		Ca²⁺	130
Mn²⁺	222
		Mg²⁺	103
Zn²⁺	96
		Cu²⁺	46
Fe²⁺	105
		Fe³⁺	113
EDTA	97
		N-乙基马来酰亚胺	93
PCMB	25
		一碘乙酸	14
SDS	37
		无添加	100

(8)底物特异性

研究对于各底物的β-淀粉酶活性。以将对于可溶性淀粉的活性设为100％的相对活性表示。对于寡糖类，采用以下所示的麦芽糖的定量法研究麦芽糖生成量。在37℃下使0.1U/ml的酶对0.5％的各麦芽寡糖反应30分钟后，用HPLC(Aminex carbohydrate HPX-42A，BIO-RAD公司)进行麦芽糖的定量。将以可溶性淀粉为底物时的麦芽糖生成量设为100％，由麦芽糖生成量求出对于各麦芽寡糖的相对活性。

将结果示于表5。以将对于可溶性淀粉的麦芽糖生成量设为100％的相对活性表示。环糊精、普鲁兰多糖、葡聚糖几乎未分解。对于寡糖而言，不对麦芽三糖起作用，对其它寡糖作用良好。

[表5]

底物	相对活性(％)
		麦芽三糖	0
麦芽四糖	75
		麦芽五糖	102
麦芽六糖	131
		麦芽七糖	111
α-环糊精	0
		β-环糊精	1.4
γ-环糊精	0.6
		直链淀粉	98
支链淀粉	83
		普鲁兰多糖	3.4
葡聚糖	1.9
		糖原	51
马铃薯淀粉	78
		玉米淀粉	85
蜡质玉米淀粉	106
		可溶性淀粉	100

4.编码来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶的基因片段的取得

(a)染色体DNA的分离

利用齐藤·三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta，72，619-629，1963)从1.中得到的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)的菌体中调制基因组DNA。

(b)部分氨基酸序列的确定

将1.中得到的β-淀粉酶的精制标准品提供给氨基酸序列解析，确定10个残基的N末端氨基酸序列(序列号1)和内部肽氨基酸序列(序列号2、3)。

(c)利用PCR制作DNA探针

以N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列为基础，合成2种混合寡聚核苷酸，作为PCR引物(序列号4、5)。将这些引物和弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)的染色体DNA作为模板，在以下条件下进行PCR反应。

<PCR反应液>

10×PCR反应缓冲液(TaKaRa公司) 5.0μl

dNTP混合液(各自2.5mM，TaKaRa公司) 4.0μl

25mM MgCl₂ 5μl

100μM正义引物 3.0μl

100μM反义引物 3.0μl

蒸馏水 28.5μl

染色体DNA溶液(140μg/ml) 1μl

LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司) 0.5μl

<PCR反应条件>

步骤1：改性(94℃、5分钟) 1个循环

步骤2：改性(94℃、30秒) 30个循环

退火(48℃、30秒)

延伸(72℃、1分钟)

将得到的约0.86kb的DNA片段克隆到pGEM-Teasy(Promega公司)上后确认碱基序列，结果在紧邻正义引物之后和紧邻反义引物之前发现编码上述部分氨基酸序列的碱基序列。将本DNA片段作为用于全长基因克隆的DNA探针。

(d)基因文库的制作

弯曲芽孢杆菌的染色体DNA的Southern杂交解析的结果是在KpnI分解物中确认了与探针DNA杂交的约5.0kb的单条带。为了克隆该约5.0kb的KpnI DNA片段，如下制作基因文库。进行上述(a)中调制的染色体DNA的KpnI处理。将28μg弯曲芽孢杆菌的基因组DNA、3μl的10×L缓冲液、26μl蒸馏水和1μl KpnI混合，在37℃下处理15小时。将得到的分解物连接到KpnI处理的pUC19(TaKaRa公司)载体上，得到基因文库。

(e)基因文库的筛选

使用DIG-High Prime(Roche公司)标记在上述(c)中得到的0.86kb的DNA片段。将其作为DNA探针，将在(d)中得到的基因库通过菌落杂交而进行筛选。从得到的阳性菌落中得到质粒pUC19-BAF。

(f)碱基序列的确定

根据通常方法确定质粒pUC19-BAF的碱基序列。将编码β-淀粉酶的碱基序列(1638bp)示于序列号6。另外将由序列号6编码的氨基酸序列(545氨基酸)示于序列号7。在该氨基酸序列中发现在(b)中确定的N末端区域氨基酸序列(序列号1)和内部氨基酸序列(序列号2、3)。

5.来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶在大肠杆菌中的表达

(a)β-淀粉酶在大肠杆菌中的表达质粒的构建

以编码N末端区域氨基酸序列和C末端区域氨基酸序列的DNA序列为基础合成2种寡聚核苷酸(序列号8、9)，作为PCR引物。在正义引物中添加NdeI限制性内切酶识别部位，在反义引物中添加XhoI限制性内切酶识别部位。将这些引物和具有β-淀粉酶基因的质粒pUC19-BAF作为模板在以下条件下进行PCR反应。

<PCR反应液>

10×PCR反应缓冲液(TOYOBO公司) 5.0μl

dNTP混合液(各自2.5mM，TOYOBO公司) 5.0μl

10μM正义引物 1.5μl

10μM反义引物 1.5μl

25mM MgSO₄ 2μl

蒸馏水 33μl

质粒pUC19-BAF溶液(83μg/ml) 1.0μl

KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司) 1.0μl

<PCR反应条件>

步骤1：改性(94℃、2分钟) 1个循环

步骤2：改性(94℃、15秒) 30个循环

退火(60℃、30秒)

延伸(68℃、2分钟)

用电泳确认得到的PCR产物后，用GENE CLEANE III精制(34μl)，加入4μl的10×H缓冲液以及NdeI 1μl和XhoI 1μl，在37℃下酶处理15小时。用电泳确认、精制限制性内切酶处理液后，连接在预先以NdeI和XhoI处理过的载体pET20(b)(Takara Bio株式会社)上，得到了表达质粒pET-BAF(图6)。另外，可确认编码pET-BAF中的β-淀粉酶的碱基序列正确。

(b)β-淀粉酶在大肠杆菌中的表达

将表达质粒pET-BAF导入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)中。从所得转化体中利用菌落PCR选择保持插入有目标β-淀粉酶基因的pET-BAF的菌株作为氨苄青霉素耐药菌株。另外还得到具有表达载体pET20(b)的大肠杆菌BL21(DE3)的转化体作为对照。将这些转化体接种于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基4ml中，在18℃下以160rpm培养47小时。将菌体悬浮于0.5ml的20mM乙酸缓冲液(pH5.5)中，加入φ0.1mm的玻璃珠0.25g，利用多珠冲击器(MultiBeads Shocker，安井机械公司制)破碎菌体。破碎条件是将ON 30秒、OFF 30秒重复3.5个循环。将得到的无细胞提取物供给于离心分离，得到可溶性成分。

对于得到的样品，根据上述β-淀粉酶活性测定法进行活性测定，将结果示于以下表6。

[表6]

	活性(U/ml)	蛋白质(mg/ml)	比活性(U/mg)
				pET-BAF	43.5	7.9	5.5
pET20(b)	0.4	8.0	0.05

<β-淀粉酶活性测定方法(2)>

另外，也可以用以下方法测定β-淀粉酶活性。即，在含有0.5％可溶性淀粉的0.05M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)10ml中添加酶溶液1ml，在40℃下温育30分钟后，加入菲林试剂(1.25M NaOH，0.62M酒石酸钠钾四水合物，0.14M硫酸铜(II)五水合物)4ml停止反应。反应停止后，煮沸2分钟，添加2.26M碘化钾试剂2ml和0.25％硫酸试剂2ml，用0.005mol/L硫代硫酸钠液进行滴定。将在30分钟的反应时间内增加相当于10mg的葡萄糖的还原能力的酶量设为1单位(U)。对于以下实施例，使用由本法测定的活性值。

6.利用来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶制备麦芽糖糖浆

6-1.底物浓度的影响

将糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)调制成20％～35％，添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶0.6U/g-DS，在pH5.8、62℃的条件下反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GEL CK04S(三菱化成工业制)分析反应后的糖组成，将结果示于表7。由此可见，即使对于高浓度糊精也显示高的麦芽糖生成能力。

[表7]

底物浓度	G1	G2	G3	G4	G5≤
						20％	0.00％	56.38％	7.37％	1.57％	34.68％
25％	0.00％	57.48％	7.29％	1.11％	34.12％
						30％	0.00％	57.85％	7.28％	0.98％	33.89％
35％	0.00％	57.42％	7.29％	1.02％	34.27％

6-2.反应温度的影响

在30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)(pH5.8)中添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶4U/g-DS，在56℃、65℃的条件下反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GEL CK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于表8。由此可见，即使在高温下也显示高的麦芽糖生成能力。

[表8]

温度	G1	G2	G3	G4	G5≤
						56℃	0.20％	59.81％	7.60％	0.78％	31.61％
65℃	0.17％	59.50％	7.33％	0.75％	32.25％

6-3.反应pH的影响以及与脱支酶的组合

在各种pH下，将β-淀粉酶和脱支酶进行组合，由糊精制备麦芽糖糖浆。将30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)制成pH5.8～7.0，添加β-淀粉酶1U/g-DS、作为脱支酶的kleistase PLF(大和化成公司制)3.3μl/g-DS，在62℃下反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GELCK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于表9。

[表9]

pH	G1	G2	G3	G4	G5≤
						pH5.8	0.16％	80.48％	12.72％	2.64％	4.00％
pH6.0	0.17％	78.08％	12.46％	2.92％	6.37％
						pH6.5	0.18％	76.76％	12.34％	2.72％	8.00％
pH7.0	0.22％	69.57％	11.22％	2.92％	16.07％

由此可见，通过将脱支酶进行组合从而可以生成80％以上的麦芽糖。另外，即使在中性区域也具有充分的生成能力。

6-4.酶添加量的影响以及与来自大麦和来自小麦的β-淀粉酶的比较

在30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)中添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶、Biozyme ML(大麦β-淀粉酶，天野酶公司制)、和BiozymeKL(小麦β-淀粉酶，天野酶制)，在为来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶时，在pH5.8、62℃下反应42小时，在为其它酶时，在pH5.5、58℃下反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GEL CK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于图7和表10。

[表10]

由此可见，来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶以1.0U/g-DS的添加量生成59.14％的麦芽糖，与大麦酶以2.0U/g-DS的添加量为56.06％、小麦酶以4.0U/g-DS的添加量为54.30％的麦芽糖生成量相比，明显优异。

6-5.酶添加量的影响以及与来自大豆的β-淀粉酶的比较

在30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)中添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶或Biozyme M5(大豆β-淀粉酶，天野酶公司制)、以及作为脱支酶的kleistase PLF(大和化成公司制)3.3μl/g-DS，来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶是在pH5.8下于62℃反应42小时，大豆酶是在pH5.5下于62℃反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GEL CK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于图8和表11。

[表11]

由此可见，来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶以1.0U/g-DS的添加量生成80.48％的麦芽糖，与大豆酶以1.0U/g-DS的添加量为78.51％的麦芽糖生成量相比，明显优异。

6-6.与α淀粉酶的组合(1)

调制30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)(pH5.8)，添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶0.5U/g-DS、作为脱支酶的kleistase PLF(大和化成公司制)3.3μl/g-DS，在62℃下反应42小时。在该反应液中添加α-淀粉酶剂kleistase L1(来自细菌，大和化成公司制)0.198、0.264、0.330μl/g-DS，进而反应6小时和24小时。用高效液相色谱用柱MCIGEL CK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于表12。

[表12]

由此可见，通过添加α-淀粉酶，从而可以提高麦芽糖收率而且减少G5以上的高分子寡糖。由此可期待改善反应后的过滤性。

6-7.与α-淀粉酶的组合(2)

调制30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)(pH5.8)，添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶0.6U/g-DS、作为脱支酶的kleistase PLF(大和化成公司制)3.3μl/g-DS、以及作为α-淀粉酶制剂的kleistase L1(来自细菌，大和化成公司制)0.02μl/g-DS，在62℃下反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GEL CK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于表13。

[表13]

α-淀粉酶	G1	G2	G3	G4	G5≤
						无添加	0.16％	62.52％	11.48％	6.62％	19.22％
kleistase L1	0.25％	65.96％	16.00％	9.06％	8.73％

6-8.与α-淀粉酶的组合(3)

调制30％糊精溶液(Nisshi公司制，NSD100)(pH5.8)，添加来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶0.6U/g-DS以及作为α-淀粉酶制剂的BiozymeL(来自曲霉菌，天野酶公司制)0.10μl/g-DS，在62℃下反应42小时。用高效液相色谱用柱MCI GEL CK04S(三菱化成工业公司制)分析反应后的糖组成，将结果示于表14。

[表14]

α-淀粉酶	G1	G2	G3	G4	G5≤
						无添加	0.17％	27.34％	5.83％	5.49％	61.17％
Biozyme L	0.21％	33.09％	14.95％	11.72％	40.03％

7.β-淀粉酶对制备面包的影响

在面包生面团中添加β-淀粉酶来制备面包。将山形面包用基本材料(强力粉260g；砂糖13g；食盐5.2g；起酥油10.4g；L-抗坏血酸0.013g；冷水192g；干酵母3.1g)、或者在该材料中添加β-淀粉酶80U而成的材料提供到自动家用面包机SD-BT50(松下公司制)。

烘烤后，将面包在26℃下放冷1小时，接着将其装入乙烯袋中以防止水分蒸发，接着在26℃下保存。保存1或5天后，将面包切成2cm厚的片，将面包的中央部切成直径为47mm的圆柱状。面包的硬度是测定使用FUDOH RHEO METER NRM-2002J(Rheotech公司制)以压缩速度2mm/分钟压缩1.5cm时的最大荷重。将结果示于表15。

[表15]

对于未添加酶区和添加酶区，将各自保存1天的面包的硬度设为100％时，比较保存5天的面包的硬度。其结果，添加酶区是151％，与未添加区(207％)相比，面包的硬化得到抑制，柔软度得到维持。

8.β-淀粉酶对饼的抗老化的影响

在上新粉200g中添加水165g后，提供给KitchenAid混合器KSM5(KitchenAid公司制)，用平面搅拌器均匀化后，用强火蒸15分钟，得到饼生面团。将得到的饼生面团再次提供给KitchenAid混合器，用面团钩(Dough Hook)揉捏。生面团温度冷却到55℃后，添加β-淀粉酶120U，以均匀分散的方式揉捏3分钟而得到饼。以不进入空气的方式将得到的饼塞进培养皿中，分别在4℃、15℃、25℃下静置3天。每天，将饼挖出直径为28mm的圆柱状，使用FUDOH流变仪NRM-2002J(Rheotech公司制)，测定以直径为15mm的柱塞按照压缩速度2mm/分钟压缩5mm时的应力。将结果示于图9。可知添加酶区与未添加区相比，没有应力变化，即饼的硬化得到抑制。该硬化抑制效果即使为低温保存也有效。

9.β-淀粉酶对米饭的影响

将米75g水洗后，添加水150mL，又在该材料中添加β-淀粉酶30U，将该材料在室温下静置2小时后，用通常方法做饭，得到米饭。将得到的米饭在4℃下保存7天。用BAP法测定保存前后的糊化度。将结果示于表16。

[表16]

对于利用BAP法的糊化度，添加酶区是刚蒸饭后为96.2％、7天后为62.9％。与此相对，未添加区是刚蒸饭后为95.3％、7天后为59.7％。在添加酶区中糊化度的下降得到抑制，即淀粉的老化得到抑制。

产业上的可利用性

本发明的β-淀粉酶显示与来自大豆的β-淀粉酶匹敌的耐热性，适于期望在高温下的反应的用途。如果使用本发明的β-淀粉酶，则可以在杂菌污染可能小的高温下实施酶反应。因而，本发明的β-淀粉酶对于麦芽糖糖浆的制备等淀粉的糖化、或者面包类或面包生面团的改良、饼或糕饼的抗老化、米饭的抗老化等的食品加工等用途特别有用。

该发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。在不脱离所要求保护的范围的记载的情况下，本领域技术人员能容易想到的范围内的各种变型方式也包括在该发明中。

本说明书中所示的论文、公开专利公报、以及专利公报等内容通过援引其全部内容而引用于此。

另外的序列表文本

序列号4、5、8、9：人工序列的说明：引物

Claims

1.一种米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，使来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶作用于含有以葡萄糖的α-1,4键为主链的多糖或寡糖的食品，

其中，所述以葡萄糖的α-1,4键为主链的多糖或寡糖为淀粉、糖原、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖，

所述来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶由序列号7所示的氨基酸序列构成。

2.如权利要求1所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，所述淀粉为直链淀粉或支链淀粉。

3.如权利要求1或2所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，β-淀粉酶是进一步具备下述酶化学性质的β-淀粉酶，

(1)作用：作用于多糖类和寡糖类的α-1,4糖苷键，游离出麦芽糖；

(2)底物特异性：良好地作用于淀粉、糖原、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖，而不作用于普鲁兰多糖、葡聚糖、环糊精、麦芽三糖；

(3)最适温度：约55℃；

(4)最适pH：约8.0；

(5)温度稳定性：在pH5.0、10分钟的条件下，在55℃以下稳定；

(6)pH稳定性：在30℃、3小时的条件下，在pH 4～9下稳定；

(7)分子量：利用SDS-PAGE，约60000。

4.如权利要求3所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，所述淀粉为直链淀粉或支链淀粉。

5.如权利要求1或2所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，不仅使所述β-淀粉酶作用，也使其它酶作用，

所述其它酶是选自脂肪酶、磷脂酶、葡糖氧化酶、木聚糖酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶、脱支酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶及麦芽糖α-淀粉酶中的一种以上的酶。

6.如权利要求1或2所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，不仅使所述β-淀粉酶作用，也使其它酶作用，

所述其它酶是选自脂肪酶、磷脂酶、葡糖氧化酶、木聚糖酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶及麦芽糖α-淀粉酶中的一种以上的酶。

7.如权利要求3所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，不仅使所述β-淀粉酶作用，也使其它酶作用，

8.如权利要求3所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，不仅使所述β-淀粉酶作用，也使其它酶作用，

9.如权利要求4所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，不仅使所述β-淀粉酶作用，也使其它酶作用，

10.如权利要求4所述的米饭乃至米饭加工品的改性方法，其特征在于，不仅使所述β-淀粉酶作用，也使其它酶作用，

11.一种米饭乃至米饭加工品，是利用权利要求1～10中任一项所述的改性方法改性而得的。

12.一种酶组合物，是将权利要求1～4中任一项所定义的β-淀粉酶和权利要求5～10中任一项所定义的其它酶配合而成的。