CN103369973B

CN103369973B - 麦芽三糖基转移酶的新用途

Info

Publication number: CN103369973B
Application number: CN201280007591.4A
Authority: CN
Inventors: 冈田正通; 山口庄太郎
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2011-02-04
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2032-01-31
Also published as: EP2671456A1; JP2016214255A; EP3494993A1; JP6386211B2; CN105950686A; EP3494993B1; DK2671456T3; JPWO2012105532A1; EP2671456B1; JP6706636B2; JP2018061517A; KR20140020849A; DK3494993T3; WO2012105532A1; JP6280962B2; CN103369973A; EP2671456A4; US20140023748A1; JP2019115361A

Abstract

本发明的课题是提供一种麦芽三糖基转移酶的新用途。本发明提供一种饼类或面条类的制造方法，其特征在于，使用添加有麦芽三糖基转移酶的坯料，实施使坯料内的淀粉糊化的加热处理工序。此外，提供一种难消化性糖的制造方法，其特征在于，实施使麦芽三糖基转移酶作用于糖的工序。

Description

麦芽三糖基转移酶的新用途

技术领域

本发明涉及麦芽三糖基转移酶（マルトトリオシル転移酵素）的新用途。更详细而言，涉及使用了麦芽三糖基转移酶的饼类的制备方法、面条类的制备方法、难消化性糖的制备方法以及糖苷的制备方法。本申请主张基于在2011年2月4日提出申请的日本专利申请第2011－023281号的优先权和基于在2011年7月26日提出申请的日本专利申请第2011－162973号的优先权，通过参照将这些专利申请的全部内容援引于此。

背景技术

作为在产业上被利用的糖基转移酶，已知有α-葡萄糖苷酶（在制备异麦芽低聚糖或制备黑曲霉低聚糖中使用）、β-呋喃果糖苷酶（在制备低聚果糖或制备乳果糖中使用）、β-半乳糖苷酶（在制备低聚半乳糖中使用）、α-葡萄糖基转移酶（在制备帕拉金糖中使用）、环糊精葡萄糖基转移酶（在制备环糊精或制备偶联糖中使用）、分支酶（在制备高度支化环糊精中使用）等。α-葡萄糖苷酶、分支酶作用于含有α-1,4键的多糖·低聚糖，催化糖基转移反应。α-葡萄糖苷酶催化单糖的糖基转移反应，分支酶催化4糖以上的低聚糖或多糖的糖基转移反应。

酶的应用领域之一包括制造含有淀粉的加工食品。淀粉的老化成为带来保存性下降等的严重的问题。其大部分原因起因于淀粉中所含直链淀粉分子的老化，即直链淀粉分子的集聚而由此引起的不溶化（非专利文献1）。因此，进行了通过使淀粉低分子化而抑制老化的研究，可在一定程度上抑制老化。然而，由于低分子化，产生了失去淀粉本来具有的性质这样的问题。进而，在这些方法中，分解导致还原力增加，从而当与蛋白质、氨基酸等混合加热时，由于与这些物质进行反应而导致淀粉着色，因此其用途受到限制（专利文献1）。因此，正在进行不使这些淀粉低分子化地抑制老化的研究。

鉴于上述情况，本申请申请人，在在先专利申请中报道了催化麦芽三糖单元的糖基转移反应的新型糖基转移酶（以下称为“麦芽三糖转移酶”或“本酶”）及其制备方法，并且示出其用途的例子（专利文献2）

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2001－294601号公报

专利文献2:国际公开第2011/001722号小册子

专利文献3:日本特开昭54-49354号公报

专利文献4:日本特开2008－194024号公报

专利文献5:日本特开平9－107900号公报

专利文献6:国际公开第2008/136331号小册子

非专利文献

非专利文献1:冈田等，淀粉科学，30（2），p.223-230（1983）

发明内容

本发明的课题在于提供本申请发明人等发现的麦芽三糖转移酶的新用途。

在本发明人等为了解决上述课题而进行的大量研究中，着眼于饼类的制造加工和难消化性糖的制造。实验结果表明，本酶的耐热性比预想的要高，只要在蒸煮饼坯之前添加酶时就会产生充分的作用，能够有效抑制饼的老化。这一事实意味着可以省略在蒸煮饼坯之后添加酶的工序（伴随用于在酶添加之前将饼坯冷却至某种程度的温度管理工序），如果使用本酶，可以通过更为简便的制造工序制造出高老化抑制效果的饼类。此外，在面条类的制造方法中，与饼类制造方法同样地，使用添加了本酶的坯料（生地）（即面条坯），并实施使坯料内的淀粉糊化的加热处理工序，从而能够取得与饼类制造方法相同的效果。另一方面，本发明人等的研究结果表明，特别是从在工业规模上能够制造的角度出发，本酶在难消化糖的制造中也是有用的。

尽管饼类具有独特的食感（粘粘的感觉），但是，伴随着淀粉的老化，随着时间的推移这种食感就会损失。对这种饼类品质劣化的问题，进行了多种多样的研究。其中，利用酶（β-淀粉酶（例如专利文献3）、转葡糖苷酶（例如专利文献4）等）的情况很多。对于利用酶的情形，考虑到酶的作用性或失活的问题，通常在蒸煮后的饼坯的温度下降到某种程度的阶段添加酶（例如专利文献5）。但是，这样的制造方法需要（根据情况，也需要在添加酶之后使其发生反应的工序）在蒸煮后将饼坯进行冷却的工序（需要温度管理）。因此比较复杂。在本申请人的在先专利申请（专利文献2）中也公开了作为本酶的用途的一个例子，使用了上新粉的饼的制造工序，但是，其中在坯料变为约65℃的阶段添加酶，伴随着同样的问题。与此相对，由于在本次研究开发出的新制造方法中，使用添加了酶的状态的饼坯进行蒸煮等热处理工序，因此其不需要现有的制造方法中的如上所述的蒸煮后进行的各个工序。因此，大幅度提高了作业性。另外，本发明的制造方法中，也能够使用预先添加了酶的原料（预混粉），并能够谋求实现进一步提高作业性。

另一方面，对于难消化性糖，其有用性也受到广泛关注，开发了多种制造技术。例如，专利文献4公开了应用α-葡糖基转移酶制造难消化性糖的方法。在该制造方法中，由于所用酶的特性，酶发生反应时的温度低（40℃）。在这样较低温度下进行反应，微生物污染的风险高，不适用于工业规模生产。与此相对，在本次的研究开发出的新型的制造方法中，由于使用了耐热性优异的酶，这使得在高温条件下的反应成为可能，并降低了微生物污染的风险。因此，适用于工业规模的难消化性糖的生产。

着眼于难消化性糖而进行的进一步研究的结果表明，本酶能有效地增加啤酒或啤酒类饮料中难消化性糖的含量。另外表明，本酶对于杂低聚糖的制造以及糖苷的制造也是极其有效的。进而，如果使用本酶，则在面条类制造中，能够取得与制造饼类的情形同样的效果。

以下所示的本发明，如上面说明的那样，由于克服了现有技术的问题，因此其有用性高。

（1）一种饼类或面条类的制造方法，其特征在于，使用添加有麦芽三糖基转移酶的坯料，实施使坯料内的淀粉糊化的加热处理工序。

（2）如1所述的制造方法，其中，所述坯料是将预先混合有所述麦芽三糖基转移酶的原料粉混炼而得到的，或者是在将原料粉混炼时添加所述麦芽三糖基转移酶而得到的。

（3）如1或2所述的制造方法，其中，所述坯料的主原料为上新粉。

（4）如1～3中任一项所述的制造方法，其中，所述坯料包含pH调节剂。

（5）如1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述加热处理工序通过蒸煮进行。

（6）一种难消化性糖的制造方法，其特征在于，实施使麦芽三糖基转移酶作用于糖的工序。

（7）如6所述的制造方法，其中，将选自环糊精葡萄糖基转移酶、α-淀粉酶（仅限于具有糖基转移功能的酶）、普鲁兰酶以及异淀粉酶中的一种以上的酶与所述麦芽三糖基转移酶合用进行所述的工序。

（8）如6或7所述的制造方法，其在，所述糖为糊精。

（9）如6～8中任一项所述的制造方法，其中，所述工序中反应温度为50℃～70℃。

（10）如6所述的难消化性糖的制造方法，其中，在受体底物的存在下进行所述工序，生成作为所述难消化性糖的杂低聚糖。

（11）如10所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述糖为选自麦芽低聚糖、糊精以及淀粉中的一种以上的糖。

（12）如11所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述麦芽低聚糖为麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。

（13）如10～12中任一项所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述受体底物为单糖和/或糖醇。

（14）如10～12中任一项所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述受体底物为选自D-木糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、L-山梨糖、D-甘露糖、D-山梨糖醇、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、L-阿拉伯糖、D-核糖以及L-鼠李糖中的一种以上的糖或糖醇。

（15）如6所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述糖为啤酒或啤酒样饮料中使用的糖原料经过糖化而生成的糖。

（16）如15所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述糖原料为选自麦芽、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、高粱、马铃薯、大豆、豌豆、鹰嘴豆以及玉米淀粉中的一种以上的原料。

（17）如1～16中任一项所述的制造方法，其中，麦芽三糖基转移酶具有以下的酶化学性质，该酶为作用于具有α-1,4糖苷键的多糖类和低聚糖类且具有将麦芽三糖单元转移到糖类的活性的酶，将麦芽四糖作为底物使其作用时，在底物浓度为0.67％（w/v）～70％（w/v）的整个范围中，麦芽七糖的生成速度和麦芽三糖的生成速度之比为9:1～10:0。

（18）如1～17中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶为来源于微生物的酶。

（19）如1～17中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶为来源于地芽胞杆菌属微生物的酶。

（20）如19所述的制造方法，其中，所述地芽胞杆菌属微生物为地芽胞杆菌APC9669（保藏号为NITEBP-770）。

（21）如1～20中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶具有以下的酶化学性质，

（1）作用:作用于具有α-1,4糖苷键作为键合方式的多糖类和低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类；

（2）底物特异性:作用于可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖，而不作用于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽糖；

（3）分子量:约83000（SDS-PAGE）。

（22）如1～20中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶由序列号3的氨基酸序列、与序列号3的氨基酸序列具有70%以上同源性且具有麦芽三糖基转移酶活性的氨基酸序列、或显示麦芽三糖基转移酶活性的序列号3的氨基酸序列的片段组成。

（23）用6～16中任一项所述的制造方法制备得到的含有难消化性糖的组合物。

（24）如23所述的组合物，其为医药组合物、准药品组合物或食品组合物。

（25）如24所述的组合物，其中，所述食品组合物为啤酒或啤酒样饮料。

（26）一种糖苷的制造方法，其特征在于，在受体底物的存在下，实施使麦芽三糖基转移酶作用于供体底物的工序。

（27）如26所述的糖苷的制造方法，其中，所述受体底物为曲酸、抗坏血酸、氢醌或甘油。

（28）如26或27所述的糖苷的制造方法，其中，所述供体底物为可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。

（29）如26～28中任一项所述的糖苷的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶为17～22中任一项所定义的麦芽三糖基转移酶。

附图说明

图1是示出来源于地芽胞杆菌（GeobacillusSP.）APC9669的麦芽三糖基转移酶的最适温度的图表。

图2是示出来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的最适pH的图表。

图3是示出来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的温度稳定性的图表。

图4是示出来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的pH稳定性的图表。

图5是示出麦芽三糖基转移酶的SDS-PAGE结果的图。泳道1:分子量标记，泳道2:麦芽三糖基转移酶。

具体实施方式

（术语）

在本发明中，所谓“编码蛋白质的DNA”是指在使其表达时得到该蛋白质的DNA，即，是指具有与该蛋白质的氨基酸序列对应的碱基序列的DNA。因此也考虑密码子的简并。

在本说明书中，术语“分离”可与“纯化”交换使用。在用于本发明的酶（麦芽三糖基转移酶）时，“分离”是指当本发明的酶是来源于天然材料的情况下，在该天然材料中实质上不含该酶以外的成分（尤其是实质不含杂蛋白质）的状态。具体而言，例如在本发明的分离的酶中，以重量换算，杂蛋白质的含量大约小于整体的20％，优选大约小于10％，更优选大约小于5％，进一步优选大约小于1％。另一方面，当本发明的酶是通过基因工程学方法制得的情况下，术语“分离”是指，实质不含来源于所使用的宿主细胞的其它成分、培养液等的状态。具体而言，例如本发明的分离的酶中，以重量换算，杂成分的含量大约小于整体的20％，优选大约小于10％，更优选大约小于5％，进一步优选大约小于1％。应予说明，只要不是明显表示与其不同的意思，在本说明书中简单地记载“麦芽三糖基转移酶”的情况下，其是指“分离状态的麦芽三糖基转移酶”。对用于代替麦芽三糖基转移酶的术语“本酶”也同样。

麦芽三糖基转移酶的用途1:饼类或面条类的制造方法

本发明的第一方面，提供作为麦芽三糖基转移酶的用途的饼类或面条类的制造方法。本发明中，优选使用本申请申请人的在先专利申请（具体参见专利文献2）公开的麦芽三糖基转移酶（本酶）。如在先专利申请公开的那样，麦芽三糖基转移酶由地芽胞杆菌（GeobacillusSP.）APC9669产生，并确定了该酶的化学性质。下面例举确定的酶化学性质。

（1）作用

本酶是麦芽三糖基转移酶，作用于具有α-1,4糖苷键作为键合方式的多糖类及低聚糖类，使麦芽三糖单元转移至糖类。

（2）底物特异性

本酶对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖良好地进行作用。与此相对，对α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽糖不进行作用。

（3）分子量

本酶的分子量约为83000（根据SDS-PAGE）。

（4）最适温度

本酶的最适温度为约50℃。本酶在约45℃～约55℃显示高活性。最适温度是利用后述的麦芽三糖基转移酶活性测定方法（10mmol/LMES缓冲液（pH6.5）中）进行测定而算出的值。

（5）最适pH

本酶的最适pH为约7.5。本酶在pH为约6.5～约8.0显示高活性。最适pH例如是基于在通用缓冲液中测定的结果进行判断的。

（6）温度稳定性

本酶在65℃以下的条件下显示稳定的活性。即使在10mmol/LMES缓冲液（pH6.5）中、65℃的条件下进行30分钟处理后，本酶也维持90％以上的活性。

（7）pH稳定性

本酶在pH5.0～10.0这样宽的pH域中显示稳定的活性。即，只要供于处理的酶溶液的pH在该范围内，则在40℃、30分钟的处理后也维持85％以上的活性。

（8）等电点

本酶的等电点为约4.5（根据含两性电解质的电泳法得到）。

如在先申请所示，可知地芽胞杆菌（GeobacillusSP.）APC9669所产生的麦芽三糖基转移酶，在将麦芽四糖作为底物使其进行作用时，在底物浓度为0.67％（w/v）～70％（w/v）的整个范围中，作为糖基转移产物的麦芽七糖的生成速度和作为分解产物的麦芽三糖的生成速度之比为9:1～10:0。换言之，在广泛的底物浓度范围中糖基转移反应的速度压倒性地大，若将麦芽七糖生成速度和麦芽三糖生成速度的总计设为100％，则前者成为90％以上。应予说明，以产物的摩尔比为基准，对速度进行比较。

本酶优选为来源于地芽胞杆菌APC9669（Geobacillussp.APC9669）的麦芽三糖基转移酶。在此的“来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶”是指地芽胞杆菌APC9669（可以是野生株也可以是突变体）所生产的麦芽三糖基转移酶、或利用地芽胞杆菌APC9669（可以是野生株也可以是突变体）的麦芽三糖基转移酶基因而通过基因工程学方法得到的麦芽三糖基转移酶。因此，利用将从地芽胞杆菌APC9669取得的麦芽三糖基转移酶基因（或将该基因进行改变而得的基因）导入而得的宿主微生物所生产的重组体也符合“来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶”。

为了方便说明，将作为本酶来源的地芽胞杆菌APC9669称为本酶的生产菌。APC9669株保藏于如下所述的规定的保藏机构，可容易地取得。

保藏机构:独立行政法人制品评价技术基础机构（NITE）专利微生物保藏中心（〒292-0818，日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8）

保藏日（受理日）:2009年6月2日

保藏号:NITEBP-770

将上述地芽胞杆菌APC9669培养后，通过由培养液和/或菌体回收本酶，能够得到本酶。作为培养方法，可为液体培养、固体培养中的任一种，但优选利用液体培养。以液体培养为例对其培养条件进行说明。

作为培养基，只要是所用微生物能生长的培养基就可任意使用。例如，可使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进而添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉分离物等氮源，进而添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所用微生物的生长，可以向培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调整到约3～10、优选为约7～8左右，培养温度通常为约10～80℃、优选为约30～65℃左右，在有氧条件下培养1～7天、优选2～4天左右。作为培养方法，例如可利用振荡培养方法，利用发酵罐的有氧深层培养方法。

在以上条件下进行培养后，从培养液或菌体回收本酶。从培养液回收时，例如可通过将培养上清进行过滤、离心处理等而去除不溶物，然后通过适当组合利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等来进行分离、纯化，从而得到本酶。

另一方面，从菌体内回收时，例如可将菌体通过加压处理、超声波处理等进行破碎后，与上述同样地进行分离、纯化，从而得到本酶。应予说明，也可以利用过滤、离心处理等预先从培养液回收菌体，然后进行上述一系列工序（菌体的破碎、分离、纯化）。

应予说明，对表达的确认、对表达产物的确认，使用针对麦芽三糖基转移酶的抗体进行是简便的，但也可以通过测定麦芽三糖基转移酶活性而进行表达的确认。

本发明的麦芽三糖基转移酶在一个方式中包含序列号3的氨基酸序列。该氨基酸序列是从序列号2的氨基酸序列中去除信号肽部分而成的。应予说明，序列号2的氨基酸序列是对从地芽胞杆菌APC9669克隆而得的基因的碱基序列（序列号1）进行推定而得的氨基酸序列。在此，通常存在对某蛋白质的氨基酸序列的一部分实施改变时，改变后的蛋白质具有与改变前的蛋白质同等功能的情况。即，存在氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有给与实质性影响，蛋白质的功能在改变前后得以维持的情况。因此，本发明也想到使用由与序列号3所示的氨基酸序列等效的氨基酸序列构成的、具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质（以下也称为“等效蛋白质”）。在此的“等效氨基酸序列”是指与序列号3所示氨基酸序列一部分不同但该不同对蛋白质的功能（在此为麦芽三糖基转移酶活性）没有给与实质性影响的氨基酸序列。“具有麦芽三糖基转移酶活性”是指作用于具有α-1,4糖苷键作为键合方式的多糖类及低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类的活性，其活性程度只要是能够发挥作为麦芽三糖基转移酶的功能就没有受到特别限定。但优选与由序列号3所示氨基酸序列构成的蛋白质相同程度或比其还高。

“氨基酸序列的一部分不同”典型地是指利用构成氨基酸序列的1个～数个（上限例如为3个、5个、7个、10个）氨基酸的缺失、取代、或1个～数个（上限例如为3个、5个、7个、10个）的氨基酸的添加、插入、或它们的组合而使氨基酸序列产生突变（变化）的情况。在此的氨基酸序列的不同只要是保持麦芽三糖基转移酶的活性就被允许（活性多少可以有变动）。只要满足此条件，氨基酸序列不同的位置就没有特别限定，此外还可以在多个位置上产生不同。在此的“多个”例如是指相当于约小于总氨基酸的30％的数目，优选为相当于约小于20％的数目，更优选为相当于约小于10％的数目，进一步优选为相当于约小于5％的数目，最优选为相当于约小于1％的数目。即，等效蛋白质与序列号3的氨基酸序列例如具有约70％以上、优选约80%以上、更优选约90%以上、进一步优选约95%以上、最优选约99%以上的同源性。

优选通过在对麦芽三糖基转移酶活性不是必需的氨基酸残基中进行保守性氨基酸取代而获得等效蛋白。在此的“保守性氨基酸取代”是指将某氨基酸残基取代为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链被分为碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）这几种类别。保守性氨基酸取代优选为同一类别内的氨基酸残基间的取代。

“等效蛋白质”可以具有附加的性质。作为该性质，例如可举出与由序列号3所示氨基酸序列构成的蛋白质相比稳定性优异的性质、只有在低温和/或高温时才发挥不同功能的性质、最适pH不同的性质等。

在此，两个氨基酸序列的同源性（％）例如可通过如下顺序来确定。首先，以可进行最适比较的方式将两个序列进行排列（例如，可以向第一序列导入空位而使与第二序列的对位达到最适化）。当第一序列的特定位置的分子（氨基酸残基）与第二序列中对应位置的分子相同时可以说该位置的分子相同。序列同源性是该两个序列中共同的相同位置的数目的函数（即，同源性（％）＝相同位置的数目/位置的总数×100），优选将在对位的最适化中所需要的空位的数目及尺寸也纳入考虑。两个序列的比较及同源性的确定可使用数学算法来实现。作为在序列比较中可利用的数学算法的具体例，有Karlin及Altschul（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68中记载的、在Karlin和Altschul（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。这种算法已被编入Altschul等在（1990）J.Mol.Biol.215:403-10中记载的NBLAST程序及XBLAST程序（版本2.0）。例如，如果在XBLAST程序中以score=50、wordlength=3进行BLAST多肽检索，则可以得到同源性高的氨基酸序列。为了获得用于比较的空位对位，可以利用在Altschul等（1997）AminoAcidsResearch25（17）:3389-3402中记载的GappedBLAST。在利用BLAST及GappedBLAST时，可以使用对应程序（例如XBLAST及NBLAST）的默认参数。详细而言例如请参考NCBI的网页。作为可用于序列比较的其它数学算法的示例，有Myers及Miller（1988）ComputApplBiosci.4:11-17中记载的算法。这种算法例如已被编入可在GENESTREAM网络服务器（IGHMontpellier，法国）或ISREC服务器中利用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比较中使用ALIGN程序时，例如可使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12、空位罚分＝4。两个氨基酸序列的同源性可如下确定:用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，使空位加权＝12、10、8、6或4，使空位长加权＝2、3或4。

本酶可以是更大的蛋白质（例如融合蛋白质）的一部分。作为在融合蛋白质中所添加的序列，例如可举出多重组氨酸残基之类的对纯化有用的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可通过基因工程学方法容易地进行制备。例如，可用编码本酶的DNA（具体例为具有序列号1的碱基序列的DNA）将适当的宿主细胞（例如大肠杆菌）进行转化，回收在转化体内表达的蛋白质，从而进行制备。对回收的蛋白质可根据目的而进行适当制备。如果由此得到本酶作为重组蛋白质，则可进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入同一载体而使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能得到由连接有任意的肽乃至蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。此外，可以实施产生糖链和/或脂质的添加、或N末端或C末端加工之类的修饰。通过如上修饰可简化重组蛋白质的提取、纯化，或添加生物学功能等。

本发明的饼类制造方法中，使用添加有本酶的饼坯，实施使饼坯内的淀粉糊化的加热处理工序。即，与现有的在饼坯蒸煮或煮沸后添加酶的现有制造方法不同，本发明提供的制造方法是在添加了酶的状态下将饼坯蒸煮或煮沸等。具有该特征的本发明的制造方法，不需要在蒸煮或煮沸后冷却到规定的温度然后添加酶这样的伴随温度管理的复杂工序，这显著提高了作业性。此外，现有的方法中，由于必须在将饼坯冷却后添加酶，所以添加酶时饼坯的流动性降低，均匀添加酶变得困难，柔软性会出现不均匀的可能。为了保证柔软性的均匀性，需要将酶布满全部饼坯地进行充分的混合。按照本发明优选实施方式（具体请参见下文），即，使用预先添加有酶的的饼坯进行热处理工序，就不会产生这样的问题。应予说明，本发明的制造方法中，在酶添加后进行加热，所以含有本酶的状态的饼坯温度可以达到80℃以上。从其它角度来看，本酶至少一部分曝露于80℃以上的热中。基于这一点，本发明的制造方法与将饼坯冷却到60℃左右后再添加酶的现有方法（添加的酶没有曝露于80℃以上的高温）有着明显的区别。

与饼类的制造方法相同，本发明的面条类制造方法中，也使用添加有本酶的坯料（即面条坯），实施使坯料内的淀粉糊化的加热处理工序。通过该特征，其能够取得与饼类的制造方法的情形相同的效果。

“饼类”为饼、饼点心以及团子的总称。饼包括方形扁平饼、圆形饼、平圆形饼等多种形状的饼。“饼点心”的例子为求肥饼、羽二重饼、馅饼、滚馅饼、安倍川饼、草饼、柏饼、樱叶饼、白糖饼、柚饼子。同样，“团子”的例子为烤团子、草团子、白玉团子。

“饼坯”是指向将生的或经特别处理（浸泡、干燥、加热处理等）后的粳米或糯米进行粉碎或制粉而得的产品（上新粉、饼粉、白玉粉、团子粉、道明寺粉等）中添加水以及根据需要使用的其它材料，进行混合、混炼后的混合物。本发明的一个方式中，在饼坯中添加pH调节剂。饼坯在经过常规的加热处理后，通过轧制、成型等工序制造得到饼类制品。

“面条坯”是指向将生的或经特别处理（浸泡、干燥、加热处理等）后的糯米、小麦、粟米、稗子、黍子、荞麦、芋头、甘薯、马铃薯、高粱、玉米、绿豆、大豆等进行粉碎或制粉后的产品中添加水以及根据需要使用的其它材料，进行混合、混炼后的混合物。“面条坯”也可以是混合、混炼后成型的混合物。

使用添加有本酶的坯料（饼坯或面条坯）进行加热处理工序中，本酶的添加时间无特别限制。例如，加热处理工序前，将其它材料混炼时，可一同混合本酶。可见，无需另外设定添加酶的工序，在提高作业性的同时，能够实现将制造所用的时间缩短。另一方面，也可以预先将一种以上的其它材料与本酶进行混合（作为预混粉使用）。对于这种情形，由于将预先添加酶的原料（预混粉）用于混炼以及混炼后的加工处理等，这使得该制造方法的作业性变得优异。上述两个例子中，即为使用预先添加有本酶的坯料进行加热处理工序。另外，也可以将其它材料进行混炼得到坯料，在加热处理时（即，加热处理开始前、刚刚开始之后或者加热处理中）再添加本酶。

本酶的添加量，只要能够发挥意图的效果（防止老化）即可，无特别限制，例如每1g主原料为1U～20U。此处所说的主原料为提供坯料（饼坯或面条坯）的主要成分的原料或材料，例如制造白玉团子时主原料为上新粉（白玉粉）。

本发明中加热处理工序可以在与现有方法相同的条件下进行，采取蒸煮的情况下，例如可以用水蒸气蒸制5分钟～20分钟。当然，从坯料的成分、用量等考虑，可以对处理时间进行适当地调节，并不受限于此例。

应予说明，在制造所谓的打糕时，在蒸煮工序之前或者蒸煮工序过程中将麦芽三糖基转移酶添加到糯米的情形，同样期待防止老化的效果。

麦芽三糖基转移酶的用途2:难消化性糖的制造方法及其用途

本发明的第二方面，提供作为麦芽三糖基转移酶的用途的难消化性糖的制造方法。另外，提供通过该方法制造得到的难消化性糖的用途。本发明的难消化性糖的制造方法中，与上述的第一方面相同，优选使用本申请申请人的在先专利申请（具体参见专利文献2）公开的麦芽三糖基转移酶（本酶）。更为详细地，本发明的难消化性糖的制造方法中，实施使麦芽三糖基转移酶（优选为本酶）作用于成为底物的糖类的工序。

使酶作用的“糖类”为具有α-1,4糖苷键的多糖或低聚糖（例如直链淀粉、支链淀粉、各种低聚糖）。本发明中的“糖类”可使用两种以上的多糖或低聚糖的混合物。优选使用糊精（淀粉水解物）作为糖类。糊精一般通过使α-淀粉酶作用于淀粉或者通过酸分解淀粉而得到。作为原料的淀粉无特别限制，淀粉的例子可以例举为玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、甜木薯淀粉。也可以将两种以上的淀粉合用。根据现状，从供给方面和价格方面特别优选玉米淀粉。应予说明，现有多种市售的糊精（淀粉水解物），也可以使用这些淀粉。

本申请说明书中所谓的“难消化性糖”是指含有难消化性成分的糖类。难消化性成分的含量无特别限制。根据本发明的制造方法，制造难消化性成分浓度较高（50%～60%以上）的难消化性糖也是可能的。应予说明，本申请说明书中术语“难消化性糖”为包括术语“难消化性糊精”、术语“难消化性淀粉”以及术语“难消化性低聚糖”的术语。例如，关于使用糊精作为底物的制造方法，着眼于原料底物，可以称为“难消化性糊精”。

本酶的添加量，无特别限制，例如每1g糖类为1U～40U。

酶反应时的温度条件也无特别限制，为了充分发挥本酶的相应作用，将温度设定为30℃～70℃。另一方面，为了降低微生物污染的风险，优选更高的温度条件，例如，在50℃～70℃的温度条件下进行反应。

如实施例所示，将本酶与环糊精葡萄糖基转移酶和/或普鲁兰酶合用，能够增加难消化成分的产量。合用的这两个酶其本身不能生成难消化性成分，但是与本酶组合使用时，能够产生协同的效果，增加难消化性成分。基于该发现，本发明的一个实施方式为，将选自环糊精葡萄糖基转移酶、α-淀粉酶（仅限于具有糖基转移功能）、普鲁兰酶以及异淀粉酶中的一种以上的酶与本酶合用，作用于糊精。关于α-淀粉酶，只要其具有糖基转移能力，就能够预想到其能够发挥与环糊精葡萄糖基转移酶相同的作用效果，其作为能合用的酶的一种被例举。同理，由于异淀粉酶与普鲁兰酶之间具有作用共同性，所以其可以作为一种能合用的酶的被例举。作为环糊精葡萄糖基转移酶，例如可以使用TORUZYME3.0L（Novozymes制）、CONTIZYME（天野酶制）。也可以使用来源于嗜热脂肪地芽胞杆菌（Geobacillusstearothermophilus）的环糊精葡萄糖基转移酶。作为具有糖基转移能的α-淀粉酶，例如，可以使用源自于环状芽孢杆菌的淀粉酶（专利文献4）。作为普鲁兰酶可以使用KLEISTASEPL45（天野酶制）、普鲁兰酶“AMANO”3（天野酶制）。作为异淀粉酶，例如可以使用来自假单胞菌的异淀粉酶（Megazyme公司产）、GODO-FIA（合同酒精制）。应予说明，关于与本酶合用的上述各酶的用量，可以参考实施例所示的用量，通过预实验等进行设定。作为使用量的例子，对于环糊精葡萄糖基转移酶的情形，每1g底物例如为0.1mg～20mg；对于普鲁兰酶的情形，每1g底物例如为0.1mg～10mg。

本发明的制造方法也可适用于杂低聚糖的制造。制造杂低聚糖时，在受体底物的存在下，使麦芽三糖基转移酶（优选为本酶）作用于糖类。糖类无特别限制，可以例举使用麦芽低聚糖、环糊精以及淀粉。作为麦芽低聚糖可以例举使用麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖等。受体底物也无特别限制，可以例举使用单糖、糖醇等。作为单糖、糖醇的例子，可以使用D-木糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、L-山梨糖、D-甘露糖、D-山梨糖醇、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、L-阿拉伯糖、D-核糖以及L-鼠李糖等。本酶的添加量无特别限制，例如每1g底物为1U～400U。酶反应时的温度条件也无特别限制，为了充分发挥本酶的相应作用，将温度设定为30℃～70℃。

在一个实施方式中，本发明的制造方法可以作为啤酒或啤酒样饮料的制备工序的一部分来实施。典型地，在添加有麦芽三糖基转移酶的状态下进行啤酒或啤酒样饮料的熟化工序（即糖化工序）或者向通过熟化工序得到的糖化液中添加麦芽三糖基转移酶进行酶反应。这样，形成麦芽三糖基转移酶与啤酒或啤酒样饮料中使用的糖原料经糖化而生成的糖发生作用的状态。本发明所谓的啤酒或啤酒样饮料，不限于酒税法规定的啤酒，是指所谓的发泡酒、杂系酒等使用啤酒酵母发酵得到的全部酿造酒。低醇啤酒、无醇啤酒、第三类啤酒等也均属于“啤酒或啤酒样饮料”。作为糖原料可以例举使用麦芽、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、高粱、马铃薯、大豆、豌豆、鹰嘴豆、玉米淀粉等。根据需要，可以将两种以上的原料合用。根据这种实施方式的制造方法，最终得到难消化性糖（食用纤维）含量高的啤酒或啤酒样饮料。啤酒或啤酒样饮料制造工序中，可以将糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶等酶合用。这些酶以典型地降低糖类为目的来使用。这些酶，例如，在麦芽三糖基转移酶的酶反应时一并添加。

本发明进一步提供通过本发明的制造方法制造得到的含有难消化性糖的组合物。本发明组合物的用途无特别限制，优选为医药、准药品或食品。即，本发明的优选实施方式为通过本发明的制造方法制造得到的含有难消化性糖的医药组合物、准药品组合物以及食品组合物。

本发明的医药组合物、准药品组合物的制剂化按照常规方法进行。制剂化时，可以含有制剂上允许添加的其它成分（例如载体、赋型剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等）。作为赋型剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、精氨酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

制剂化时的剂型无特别限制，例如，作为片剂、散剂、微粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂、外用剂以及栓剂等提供本发明的医药组合物或准药品组合物。

本发明的医药组合物中含有对达到期待的治疗效果或预防效果必要的量（即治疗有效量）的有效成分。同理，本发明的准药品组合物中含有对达到期待的治疗效果或预防效果必要的量的有效成分。本发明的医药组合物或准药品组合物中有效成分的含量一般地因剂型或形态不同而不同，为了达到期望的给药量，将有效成分量设定在例如约0.1重量%～约95重量%的范围内。

作为本发明“食品组合物”的例子可以例举常见食品（谷物类、蔬菜、肉、各种加工食品、点心类、牛奶、清凉饮料水、酒精饮料（例如啤酒或啤酒样饮料）等，营养补充剂（膳食补充剂、营养饮料等）、食品添加剂、宠物食品、宠物营养补充剂。对于营养补充剂或食品添加剂的情形，可以提供为粉末、颗粒末、片剂、贴剂、液体等形状。通过以食品组合物的形式提供，本发明的有效成分（难消化性糖）的日常摄取和连续摄取变得容易。本发明的食品组合物中，优选含有达到能够期待治疗或预防效果的量的有效成分。其添加量，可以考虑作为使用对象的人的症状、健康状况、年龄、性别、体重等而进行设定。

（麦芽三糖基转移酶的用途3:糖苷的制造方法）

本发明的第三方面，提供作为麦芽三糖基转移酶的用途的糖苷的制造方法。本发明的糖苷的制造方法中，与上述的第一方面相同，优选使用本申请申请人的在先专利申请（具体参见专利文献2）公开的麦芽三糖基转移酶（本酶）。更为详细地，本发明的糖苷的制造方法中，在受体底物的存在下实施使麦芽三糖基转移酶（优选为本酶）作用于供体底物的工序。

可以采用各种受体底物（参见后文的实施例），受体底物的具体例子可以例举为曲酸、抗坏血酸、氢醌、甘油、单甘油酯、双甘油酯。也可以将两种以上的受体底物合用。在所用的麦芽三糖基转移酶起作用的范围内供体底物也没有特别的限制。供体底物的具体例子可以例举为可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖。也可以将两种以上的供体底物合用。本酶的添加量，无特别限制，例如每1g供体底物为1U～100U。酶反应时的温度条件也无特别限制，为了充分发挥本酶的相应作用，将温度设定为30℃～70℃。

实施例

＜麦芽三糖基转移酶活性测定方法＞

麦芽三糖基转移酶的活性是如下测定的。即，向含1％麦芽四糖（林原生物化学研究所制）的10mmol/LMES缓冲液（pH6.5）2mL中添加酶溶液0.5mL，在40℃放置60分钟。放置后，在沸腾水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将所生成的葡萄糖利用GlucoseCII-TestWako（和光纯药制）进行定量。将在本条件下1分钟内在2.5mL反应液中生成1μmol葡萄糖的酶量设为1个单位。

＜麦芽三糖基转移酶活性确认方法＞

麦芽三糖基转移酶的活性是与上述＜麦芽三糖基转移酶活性测定方法＞一起如下进行确认的。即，向含10.3mmol/L麦芽四糖（林原生物化学研究所制）的5mmol/L乙酸缓冲液（pH6.0）985μL中添加1.0u/mL酶溶液15μL，在50℃放置1、2、3小时。放置后，在沸水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当脱盐，以HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“ProminenceUFLC”，色谱柱为三菱化学制“MCIGELCK04S”，洗脱液为水，流速为0.4mL/分钟，利用差示折射计检测，进行分析。将所得底物和产物的面积％换算成摩尔量，计算消耗速度和生成速度。在纯化的麦芽三糖基转移酶的情况下，例如，生成速度比为7糖:3糖＝约92:约8。

如在先申请（专利文献2）所示，成功地制得来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶。以下，引用了如专利文献2所示的该酶的制备方法和诸多性质。

1．来源于地芽胞杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的生产和纯化

使用表1所示组成的液体培养基，将地芽胞杆菌APC9669进行45℃、2天的振荡培养。将所得的培养上清液用UF膜（AIP-1013D，旭化成制）浓缩5倍后，以成为50％饱和浓度的方式添加硫酸铵。将沉淀部分再次溶解于含5mmol/L氯化钙的20mmol/LTris-盐酸缓冲液（pH8.0），接着以最终浓度成为0.5mol/L的方式添加硫酸铵。将所生成的沉淀用离心分离去除后，供于用含0.5mol/L硫酸铵和5mmol/L氯化钙的20mmol/LTris-盐酸缓冲液（pH8.0）进行了平衡化的HiLoad26/10PhenylSepharoseHP柱（GEHealthcare制），利用0.5mol/L～0mol/L的硫酸铵直线浓度梯度，使吸附的麦芽三糖基转移酶蛋白质洗脱。

[表1]

麦芽三糖基转移酶生产培养基

	(w/v)
		酵母提取物	1.5%
大豆蛋白胨	0.5%
		氯化钠	0.5%
可溶性淀粉	0.4%

将收集的麦芽三糖基转移酶活性部分用UF膜进行浓缩后，在含5mmol/L氯化钙的20mmol/LTris-盐酸缓冲液（pH8.0）中进行缓冲交换。将缓冲交换试样供于以含5mmol/L氯化钙的20mmol/LTris-盐酸缓冲液（pH8.0）进行了平衡化的HiLoad26/10QSepharoseHP柱（GEHealthcare制），利用0mol/L～1mol/L的NaCl直线浓度梯度，使吸附的麦芽三糖基转移酶蛋白质进行洗脱。

进而，将收集的麦芽三糖基转移酶活性部分用UF膜进行浓缩后，在含0.15M的NaCl的50mM磷酸缓冲液（pH7.2）中进行缓冲交换后，供于以含0.15M的NaCl的50mM磷酸缓冲液（pH7.2）进行了平衡化的HiLoad26/60Superdex200pg柱（GEHealthcare制），以该缓冲液进行洗脱。收集麦芽三糖基转移酶活性部分，用超滤膜进行脱盐浓缩，得到了纯化酶样品。将所得的本纯化酶进行下述各性质的检测。

应予说明，将各阶段的纯化结果示于表2。最终阶段的相对活性与粗酶相比约为41倍。图5中示出将纯化工序中的各步骤的试样以10-20％的梯度凝胶进行SDS-PAGE（CBB染色）的结果。可知本纯化酶样品（泳道2）在SDS-PAGE中为单一的蛋白质。

[表2]

2.麦芽三糖基转移酶的诸性质

（1）最适反应温度

以上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法为基准，在反应温度30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃以及75℃进行反应。以与显示最高活性的温度对应的值为100%活性，用相对活性表示。最适温度为约50℃附近。（图1）

（2）最适反应pH

以上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法为基准，在各缓冲液（通用缓冲液pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0）中，在40℃、60分钟的反应条件下进行测定。以将显示最大活性值的pH的值设为100％而得的相对活性进行表示。最适反应pH为约7.5附近（图2）。

（3）温度稳定性

将6u/mL的酶液在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃的各温度下，在10mmol/LMES缓冲液（pH6.5）中进行30分钟热处理后，用上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法测定残余活性。以未用热进行处理的活性设为100％而得的残余活性进行表示。在65℃、30分钟的热处理中，具有90％以上的残余活性，在到达65℃为止稳定（图3）。

（4）pH稳定性

将6u/mL的酶液在各缓冲液（通用缓冲液pH3.0、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0）中，以40℃处理30分钟后，用上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法测定活性。在pH5.0～pH10.0的范围中具有85％以上的残余活性，在pH5.0～pH10.0的范围中稳定（图4）。

（5）利用SDS-PAGE的分子量测定

SDS-PAGE是按照Laemmli等的方法进行的。应予说明，所使用的分子量标记为电泳低分子量标定试剂盒（LowMolecularWeightCalibrationKitforElectrophoresis，GEHealthcare公司制），作为标准蛋白质，含有磷酸化酶b（97000Da）、白蛋白（66000Da）、卵清蛋白（45000Da）、碳酸酐酶（30000Da）、胰蛋白酶抑制剂（20100Da）、α-乳清蛋白（14400Da）。使用凝胶浓度为10-20％的梯度凝胶（和光纯药公司制），以20mA/凝胶进行约80分钟电泳，求出分子量，结果分子量为约83kDa（图5）。

（6）等电点

通过使用两性电解质的等电点聚焦（600V，4℃，通电48小时）进行测定，其结果本酶的等电点约为4.5。

（7）底物特异性

对针对各底物的麦芽三糖基转移酶活性进行了研究。

a）对麦芽低聚糖的底物特异性

对于麦芽低聚糖类，通过以下的方法进行了底物特异性的研究。向10mmol/L的各麦芽低聚糖中以成为0.002u/mL的方式添加酶，于50℃放置1、2、3小时。放置后，在沸水浴中加热5分钟后，在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当地进行脱盐，用HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“ProminenceUFLC”，柱为三菱化学制“MCIGELCK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分钟，用差示折射计检测而进行分析。将所得底物和产物的面积％换算成摩尔量，算出消耗速度和生成速度。对各麦芽低聚糖的反应速度进行如下计算。对麦芽四糖的速度为7糖生成速度与3糖生成速度之和。对麦芽五糖的速度为8糖生成速度与3糖生成速度之和。求出3糖生成速度与9糖生成速度之差的1/2，进而将该值与9糖生成速度之和设为对麦芽六糖的速度。

[表3]

底物	相对速度(%)
		麦芽糖	0
麦芽三糖	0
		麦芽四糖	83
麦芽五糖	100
		麦芽六糖	89

对于麦芽糖、麦芽三糖，未能确认到反应产物。对于麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖很好地进行作用。

b）对多糖类的底物特异性

对于环糊精、可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉，通过以下的方法研究底物特异性。向10mmol/L的各麦芽低聚糖中以成为0.002u/mL的方式添加酶，将0.1u/mL的酶在50℃放置0、1、2、3小时。放置后，在沸水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。向200μL该液中以成为1.0单位0.03mg的方式添加来源于根霉的葡糖淀粉酶（和光纯药），在50℃静置1晚。静置后，在沸水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当地进行脱盐，用HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“ProminenceUFLC”，柱为三菱化学制“MCIGELCK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分钟，用差示折射计检测而进行分析。将在酶（麦芽三糖基转移酶）处理区中，与无处理区相比确认到3糖以上的峰经时增加时，判定为有产物（＋），未能确认到增加时判定为无产物（－）。

[表4]

底物	有无产物
		α-环糊精	-
β-环糊精	-
		γ-环糊精	-
直链淀粉	+
		支链淀粉	+
可溶性淀粉	+

对于环糊精，未能确认到反应产物。对于可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉，确认到3糖以上的峰的经时增加。可知这些多糖类成为底物。由葡糖淀粉酶水解α-1,4键、α-1,6键可知在这些键合方式以外也生成糖基转移产物。

（8）底物浓度对酶反应产物的影响

关于底物浓度对酶反应产物的影响，以麦芽四糖为底物进行研究。向0.67、1.0、3.0、10、30、70％（w/v）的麦芽四糖中以进行3小时反应后的麦芽四糖残余量成为85％以上的方式添加酶，在50℃放置1、2、3小时。放置后，在沸水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当地脱盐，使用HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“ProminenceUFLC”，柱为三菱化学制“MCIGELCK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分，用差示折射计检测而进行分析。将所得底物和产物的面积％换算成摩尔量，算出生成速度。其结果，在所有的底物浓度条件下（0.67～70％（w/v）），糖基转移反应为90％以上。

[表5]

3.饼的制造

3-1.饼的制造

向上新粉250g和酶（麦芽三糖基转移酶、生物酶M5（源自大豆，天野酶制）或α-葡萄糖苷酶“AMANO”SD（天野酶制））中添加200g水后进行混合，以水蒸气蒸制15分钟。麦芽三糖基转移酶的添加量取8u或12u/g（底物）。另外，生物酶M5的添加量为1.2mg/g（底物）,α-葡萄糖苷酶“AMANO”SD的添加量为1.2mg/g（底物）。

接下来，将蒸制的材料取至搅拌机（KitchenAidKSM5（FMI公司制））搅拌后，装入塑料制培养皿中进行成型，放置冷却，在5℃保存。保存1天或2天后，将饼的中央部冲切成直径为25mm的圆柱状。饼的硬度是使用流变仪（COMPAC-100II（SUN科学制））测定在压缩速度为60mm/分钟下压缩50%时的最大负荷。对将各试验区域的保存2小时的饼的硬度设为100％时的饼的硬度进行比较。

在对照试验区（蒸煮后酶添加区），首先添加上新粉250g、水200g进行混合，以水蒸气蒸15分钟。接着，将蒸制的材料取至搅拌机（KitchenAidKSM5（FMI公司制））边搅拌，边在坯料约成为65℃时添加混合300mg生物酶M5（源自大豆，天野酶制），装入塑料制培养皿中进行成型，放置冷却，在5℃保存。

比较评价的结果表明，麦芽三糖基转移酶12u/g（底物）的酶添加区与对照试验区有相同的柔软性维持效果。而且没有饼的过多的粘性，维持了很好的物性。由此可见，可以说麦芽三糖基转移酶与现有的源自大豆的β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶（转葡糖苷酶）不同，在蒸煮之前添加或者与预混粉进行配合也是可以的。

[表6]

G3转移酶:麦芽三糖基转移酶

×:过硬无法测定

3-2.饼（添加pH调节剂）的制造

向上新粉250g和酶（麦芽三糖基转移酶、生物酶M5（源自大豆，天野酶制）或α-葡萄糖苷酶“AMANO”SD（天野酶制））中添加50mmol/L的醋酸缓冲液（pH5.3）200g后进行混合，以水蒸气蒸制15分钟。麦芽三糖基转移酶的添加量取8u或12u/g（底物）。另外，生物酶M5的添加量为1.2mg/g（底物）,α-葡萄糖苷酶“AMANO”SD的添加量为1.2mg/g（底物）。

在对照试验区（蒸煮后酶添加区），首先将50mmol/L的醋酸缓冲液（pH5.3）200g添加到250g上新粉进行混合，以水蒸气蒸15分钟。接着，将蒸制的材料取至搅拌机（KitchenAidKSM5（FMI公司制））边搅拌，边在坯料约成为约65℃时添加混合300mg生物酶M5（源自大豆，天野酶制），装入塑料制培养皿中进行成型，放置冷却，在5℃保存。

比较评价的结果表明，麦芽三糖基转移酶8和12u/g（底物）的酶添加区与对照试验区有相同的柔软性维持效果。另外还没有饼的过多的粘性，维持了很好的物性。由此可见，可以说麦芽三糖基转移酶与现有的源自大豆的β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶（转葡糖苷酶）不同，即使在使用pH调节剂的条件下，在蒸煮之前添加或者与预混粉进行配合也是可以的。

[表7]

G3转移酶:麦芽三糖基转移酶

×:过硬无法测定

4.难消化性糖的制造

（1）难消化性成分含量的测定方法

测定方法是通过下述的“难消化性成分的定量法”（淀粉科学，第37卷，第2期，第107页，平成2年）的改良方法进行测定的。首先，用50mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0）将试料1mL定容为15mL，添加30μLα-淀粉酶（和光纯药工业制，Termamyl120L的相当品），在95℃反应30分钟。冷却后，再将pH调节到4.5，添加30μL淀粉葡萄糖苷酶（sigma制），在95℃反应30分钟。通过在沸水浴中煮沸5分钟终止反应。将反应液定容为30mL，按照吡喃糖氧化酶法，通过下面的公式算出难消化性成分的含量。

难消化性成分的含量（%）=100-生成葡萄糖量（%）×0.9

（2）利用麦芽三糖基转移酶的难消化性糖的制备1

将麦芽三糖基转移酶添加到环糊精，制造难消化性糖。将麦芽三糖基转移酶和淀粉水解物（PINEDEX#100（松谷化学工业制），终浓度30%（w/v））添加到10mmol/LMES缓冲液（pH6.0），将液体量调整为20mL。为了考察与其它酶合用时的效果，还设置了合用添加环糊精葡萄糖基转移酶（TORUZYME3.0L（Novozymes制）和/或普鲁兰酶（KLEISTASEPL45（天野酶制））的试验区。

60℃反应66小时，通过在沸水浴中煮沸10分钟终止反应。将反应液冷却后，进行上述的“（1）难消化性成分含量的测定方法”。

[表8]

G3转移酶:麦芽三糖基转移酶

CGTase:环糊精葡萄糖基转移酶

根据表8可知，麦芽三糖基转移酶单独作用（添加20u/g（底物））时，产物的难消化性成分的含量为49.5％；麦芽三糖基转移酶（添加20u/g（底物））与环糊精葡萄糖基转移酶（添加10mg/g（底物））合用时，产物的难消化性成分的含量为57.9％；麦芽三糖基转移酶（添加20u/g（底物））、环糊精葡萄糖基转移酶（添加10mg/g（底物））以及普鲁兰酶（添加1mg/g（底物））3种酶合用时，产物的难消化性成分的含量为63.5％。

如上述所示，使用麦芽三糖基转移酶，即使高温下的反应也能够制造出难消化性糖。高温下的反应能够有效降低微生物污染的风险，特别是能够满足工业规模制造时的要求。另外，结果表明与环糊精葡萄糖基转移酶或普鲁兰酶合用时，难消化性成分的含量得到提高。特别是，麦芽三糖基转移酶、环糊精葡萄糖基转移酶以及普鲁兰酶3种酶合用时，与麦芽三糖基转移酶单独作用相比，难消化性糖的含量能够增加10%以上。

5.啤酒或啤酒样饮料中的食用纤维增量效果

使用自动糖化槽LB-8（LOCHNER制）进行糖化反应。向各个糖化槽中注入320g的1.2mmol/L的硫酸钙，一边搅拌，一边将温度升高至50℃，然后，添加麦芽8g、粉碎的大麦72g以及麦芽三糖基转移酶。麦芽三糖基转移酶的添加量为0、96u或480u。添加原料和酶后，50℃处理1小时。进一步地，将温度升高至65℃维持1小时。然后，再将温度升高至76℃维持10分钟。使用滤纸将得到糖化液过滤，得到滤液。使用酶-HPLC法测量滤液中水溶性食用纤维的含量。结果表明，在没有添加酶的区域，水溶性使用纤维的含量为1.7%（w/v）；在酶96u添加区，其含量为2.6%（w/v）；在480u添加区，其含量为3.2%（w/v）。由于在之后的发酵工序中，食用纤维没有被啤酒酵母同化，所以通过糖化工序中食用纤维量的增加，能够增加啤酒中食用纤维的含量。应予说明，通过添加麦芽三糖基转移酶，无论原料的麦芽的配合百分比，麦汁中食用纤维的含量均增加。

6.面条的制造

向100g米粉（新泻制粉制“PowderRiceD”）中充分混合含有300u麦芽三糖基转移酶的城市用水90mL（不添加酶的区域仅用城市用水）。在约66℃维持10分钟后，将充分混炼的面团在面条机（Imperia制“PastamachineImperiaSP-150”）中压延，进一步在同一面条机中将其制为宽7mm的面线。将面线在蒸制容器内蒸15分钟，即得面条试样。2分钟后以及5℃保存60分后，进行试吃，与未添加酶的面条进行比较，粘度出现提高，保存60分种后，其柔软性得到了维持。这样，发现了通过添加麦芽三糖基转移酶能够保持面条类风味品质的效果。

7.杂低聚糖的制造

将作为供体底物的麦芽四糖、作为受体底物的各种底物（D-木糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、L-山梨糖、D-甘露糖、D-山梨糖醇、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、L-阿拉伯糖、D-核糖或L-鼠李糖）溶解于10mmol/L的MES缓冲液（pH6.5）中使其终浓度分别为3.0%（w/v）、10.0%（w/v）。相对于1mL底物溶液，添加1u麦芽三糖基转移酶，在50℃的水槽中静置反应24小时。接下来煮沸10分钟，终止反应。将反应液进行HPLC分析。HPLC分析中，使用的柱为“CK04S”（三菱化学制），柱温为80℃，流动相为超纯水，流速0.4mL/分钟，检测器为差示折射计。计算出反应前受体底物量为100%时的产物量。如表9所示，通过使用麦芽三糖基转移酶，能够用多种受体底物制造多种的杂低聚糖。可以推测上述杂低聚糖具有与市售的功能性低聚糖相类似的抗龋齿作用、整肠作用等多种功能。应予说明，作为供体底物，除麦芽四糖以外，也可以使用环糊精、淀粉等。

[表9]

8.糖苷的制造1

将作为供体底物的直链淀粉EX-1、作为受体底物的各种底物（曲酸、抗坏血酸或氢醌）溶解于5mmol/L的MES缓冲液（pH6.0）中使其终浓度分别为2.5%（w/v）。相对于1mL底物溶液，添加1u麦芽三糖基转移酶，在50℃的水槽中静置反应24小时。接下来煮沸10分钟，终止反应。将反应液进行HPLC分析。HPLC分析中，使用的柱为TSKgelODS-100V3μm（4.6mm×7.5cm；TOSOH制），柱温为50℃，流速1.0mL/分钟，检测使用UV检测器。流动相使用A液为0.1%磷酸、B液为甲醇:超纯水=7:3，按照0分钟（B:0%）→4分钟（B:0%）→8分钟（B:100%）→10分钟（B:100%→B:0%）→15分钟（B:0%）的顺序进行洗脱。计算将反应前的受体底物摩尔量作为100%时的产物量。通过使用麦芽三糖基转移酶，能够制造出多种糖苷。通过利用麦芽三糖基转移酶而产生的糖苷化，能够制造出溶解性提高、物质稳定等功能或性质得到改善的糖苷。

[表10]

受体底物	产量(%)
		曲酸	6.1
抗坏血酸	1.9
		氢醌	1.5

9.糖苷的制造2

将作为供体底物的麦芽四糖、作为受体底物的甘油溶解于10mmol/L的MES缓冲液（pH6.5）中使其终浓度分别为3.0%（w/v）、10.0%（w/v）。相对于1mL底物溶液，添加1u麦芽三糖基转移酶，在50℃的水槽中静置反应24小时。接下来煮沸10分钟，终止反应。将反应液进行HPLC分析。HPLC分析中，柱为“CK04S”（三菱化学制），柱温为80℃，流动相为超纯水，流速0.4mL/分钟，检测器为差示折射计。计算出反应前受体底物量为100%时的产物量。通过使用麦芽三糖基转移酶，能够制造出相对于受体底物7.3%摩尔量的甘油糖苷。甘油糖苷为清酒醪、味淋、味噌等所含有的非还原型糖苷，据说其能给日本酒带来非常好的甜味和体验感。另外，该糖苷可作为甜度为砂糖的一半且具有低褐变、低美拉德反应性、热稳定性、非龋齿性、难消化性、低吸湿性、高保湿性等性质的甜味剂而应用于食品、饮料等。

产业上的可利用性

本发明提供一种使用了麦芽三糖基转移酶的饼类的制造方法。本发明的制造方法可用于多种饼的制造。另一方面，本发明也提供一种难消化性糖的制造方法。通过本发明的制造方法得到的难消化性糖被期待用于食品领域、医药品领域等。

本发明并不限定于上述发明实施方式和实施例的说明。本发明还包括在不脱离要求保护的范围而本领域人员容易想到的范围内的各种变型方式。

对于本说明书中记载的论文、公开专利公报和专利公报等内容，通过援引而引用其所有内容。

Claims

1.一种难消化性糖的制造方法，其特征在于，合用环糊精葡萄糖基转移酶、或者合用环糊精葡萄糖基转移酶和普鲁兰酶来实施使麦芽三糖基转移酶作用于糖的工序，所述糖为糊精。

2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述工序的反应温度为50℃～70℃。

3.一种难消化性糖的制造方法，其特征在于，在受体底物的存在下合用环糊精葡萄糖基转移酶、或者合用环糊精葡萄糖基转移酶和普鲁兰酶来实施使麦芽三糖基转移酶作用于糖的工序，生成作为所述难消化性糖的杂低聚糖。

4.如权利要求3所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述糖为选自麦芽低聚糖、糊精以及淀粉中一种以上的糖。

5.如权利要求4所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述麦芽低聚糖为麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。

6.如权利要求3～5中任一项所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述受体底物为单糖和/或糖醇。

7.如权利要求3～5中任一项所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述受体底物为选自D-木糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、L-山梨糖、D-甘露糖、D-山梨糖醇、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、L-阿拉伯糖、D-核糖以及L-鼠李糖中的一种以上的糖或糖醇。

8.一种难消化性糖的制造方法，其特征在于，合用环糊精葡萄糖基转移酶、或者合用环糊精葡萄糖基转移酶和普鲁兰酶来实施使麦芽三糖基转移酶作用于糖的工序，所述糖为啤酒或啤酒样饮料中使用的糖原料经过糖化而生成的糖。

9.如权利要求8所述的难消化性糖的制造方法，其中，所述糖原料为选自麦芽、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、高粱、马铃薯、大豆、豌豆、鹰嘴豆以及玉米淀粉中的一种以上的原料。

10.如权利要求1、3、8中任一项所述的制造方法，其中，麦芽三糖基转移酶具备以下的酶化学性质，

该酶为作用于具有α-1,4糖苷键的多糖类和低聚糖类且具有将麦芽三糖单元转移到糖类的活性的酶，将麦芽四糖作为底物使其作用时，在底物浓度为0.67％w/v～70％w/v的整个范围中，麦芽七糖的生成速度和麦芽三糖的生成速度之比为9:1～10:0。

11.如权利要求1、3、8中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶为来源于微生物的酶。

12.如权利要求1、3、8中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶为来源于地芽胞杆菌属微生物的酶。

13.如权利要求12所述的制造方法，所述地芽胞杆菌属微生物为地芽胞杆菌APC9669，保藏号为NITEBP-770。

14.如权利要求1、3、8中任一项所述的制造方法，其中，所述麦芽三糖基转移酶具备以下的酶化学性质，

(1)作用:作用于具有α-1,4糖苷键作为键合方式的多糖类和低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类；

(2)底物特异性:作用于可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖，而不作用于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽糖；

(3)分子量:约83000，以SDS-PAGE法测定。