JPH01202283A - 糖転移酵素ａの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、バシルス属菌による新規な糖転移酵素Ａの製
造方法に関するものである。

（従来技術） 糖を転移する酵素には、転移酵素（トランスフェラーゼ
）によるものと、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）の逆反
応によるものがある。　また、転移酵素は移転する残基
の種類により７種に分けられる。このうち、糖転移に係
る酵素は、オリゴ糖または多糖を供与体として、その糖
残基を、他の単糖、オリゴ糖、各種アルコールなど、適
当な受容体に転移する酵素であり、この中に、グルコー
ス残基、キシロース残基、ガラクトース残基など、種々
の糖を、それぞれ転移する酵素があるヶまた、転移がお
こる結合の種類によっても分けられる。

糖転移酵素を工業的に応用している例として、サイクロ
デキストリン・グルカノトランスフェラーゼによる、サ
イクロデキストリンの生産、同酵素を用いたカップリン
グ・シュガーの生産や、グルコシル・ステビオシトの生
産などがある。また加水分解酵素の逆反応を利用してい
るものとして、プルラナーゼを利用した分岐サイクロデ
キストリンの生産、グルコアミラーゼを用いたイソマル
トースの生産などがある。

本発明者は、ある種の糖転移酵素が、グルコアミラーゼ
による澱粉分解において、グルコースの増収に顕著な効
果のあることを認めた。

グルコースは、現在、澱粉をα−アミラーゼで液化し、
次いで、グルコアミラーゼで糖化することにより製造さ
れている。

グルコアミラーゼは、澱粉のα−１，４−グルコシド結
合とα−１，６−グルコシド結合の両結合を加水分解す
ることができるので、希薄な澱粉溶液の場合は、これを
ほぼ完全にグルコースまで分解することができる。しか
し、工業的規模では、３０〜３５％の高濃度の澱粉のも
とて糖化が行われるため、グルコアミラーゼ自体のもつ
、逆合成作用などにより、生成したグルコースの重合化
がおこり、このため、グルコースの収量は、通常、９３
〜９５％程度である。そして、残りはマルトース、イソ
マルトース、パノース、その他のより高分子のオリゴ糖
として残存する。従って、これら残存するオリゴ糖を分
解してグルコースを増収することは、ブドウ糖製造にお
ける長年の念願であった。

（発明が解決しようとする問題点） グルコアミラーゼによる、澱粉糖化において、α−１，
６−グルコシド結合分解能をもつプルラナーゼを存在さ
せて澱粉を糖化すると、糖化反応が促進され、かつ、グ
ルコースが０．５〜２％増収することができることが知
られている（特公昭５４−２９５７０．５７−３９．５
７−１７４０８９他）。また、ある種のα−アミラーゼ
によってもグルコースを増収することができる（特公昭
６ｌ−１９４９８）。

プルラナーゼはプルランのほか、アミロペクチン、また
はその派生物中のα−１，６−グルコシド結合を分解す
る酵素であり、プルランからは最終的にマルトトリオー
スを生成する。しかし、プルラナーゼは適合成もするこ
とが知られており、例えば、マルトトリオースから六糖
（Ｇ６）などを生成する。このため、プルラナーゼを、
グルコアミラーゼによる澱粉糖化に併用した場合、グル
コースの増収が認められる反面、プルラナーゼの持つ逆
合成作用により、グルコアミラーゼによって分解され難
いオリゴ糖も生成するという問題があった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、グルコアミラーゼを用いて、澱粉を糖化す
るに際し、グルコースの増収に有効な新規酵素の探索を
行ってきた結果、土壌中より分離し、バシルス属と同定
した細菌の生産する酵素がを認めた。この酵素は、可溶
性澱粉に作用させると、マルトースを主成分とする糖化
物を生成するが、マルトース以上のマルトオリゴ糖に作
用させると、より小さい分子量のマルトオリゴ糖と、よ
り大きい分子量の、種々のマルトオリゴ糖を生成する。

すなわち、分解と糖転移を同時に行う、新規な糖転移酵
素であることを認めた。例えば、本酵素を、マルトトリ
オース（Ｇ３）に作用させたときは、グリコジル基がα
−１，４−グルコシド結合で結合した、マルトース（Ｇ
２）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオー
ス（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）など、一連の
マルトオリゴ糖を生成する。第１図は、本酵素を１％の
マルトトリオースに作用させて得られる生成糖のうち、
マルトヘプタオース（Ｇ７）までの組成量を示す液体ク
ロマトグラムであるが、更に、高分子量のマルトオリゴ
糖も生成された。よく似た作用をする酵素として、４−
α−Ｄ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４，１
，２５）が知られているが、この酵素れた。本発明はこ
の知見に基づいてなされたものである。

（構　成） 本発明は、糖転移酵素Ａを生産するバシルス属閑を培養
し、培養物から糖転移酵素Ａを採取することを特徴とす
る糖転移酵素Ａの製造方法に関するものである。

以下に、本発明の方法を更に具体的に説明する。

本発明の糖転移酵素Ａは以下に記載する酵素的性質を持
っている。

ｌ）作用 可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチンなどに作用さ
せると、主としてマルトースを生成するが、この他、マ
ルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオ
ース、マルトヘキサオースなど、一連のマルトオリゴ糖
を生成する。しかし、グルコースの生成は少ない。また
、マルトトリオース以上のマルトオリゴ糖に作用させて
も、マル　。

グルコースの生成は少すい。

第１図に、本酵素を１％のマルトトリオースに作用させ
た場合の生成糖のうち、マルトヘプタオースまでの糖組
成を示したが、これよりも更に分子量の大きいオリゴ糖
も生成される。また、マルトテトラオース以上のマルト
オリゴ糖に作用させたときもよく似た組成の分解物を生
成する。すなわち、本酵素は分解と同時に転移作用によ
り、基質分子から、分子量のより小さいマルトオリゴ糖
と、分子量のより大きいマルトオリゴ糖を生成するとい
う、いわゆる基質分子の再配分を行う糖転移酵素の一種
である。よく似た作用をす゛る酵素として、４−α−Ｄ
−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４，１，２５
）が知られているが、この酵素の場合、マルトトリオー
スを基質としたとき、グルコースが生成する（活性測定
法として利用されている（赤堀四部他編、酵素ハンドブ
ック、第２７２ページ、朝食書店））。しかし、本発明
の酵素の場合、第１図から明らかなように、グルする。

このことは、本酵素による転移がグルコシル単位で多く
おこっていることを示している。また、本酵素は、弱い
ながら、マルトースに対しても作用して、マルトースよ
りも分子■の大きい種々のマルトオリゴ糖を生成する。

また、本酵素を、マルトペンタオース（Ｇ５）に作用さ
せたとき、反応の比較的初期から、マルトテトラオース
（Ｇ４）、次いで、マルトトリオース（Ｇ３）、マルト
ース（Ｇ２）と、転移物として、マルトヘキサオース（
Ｇ６）、次いで、マルトヘプタオース（Ｇ７）、マルト
オクタオース（Ｇ８）などが生成することから、グルコ
シル基の他に、マルトシル基やマルトトリオシル基単位
でも転移すると考えられる。また、高分子の可溶性澱粉
に作用して、主としてマルトースを生成することや、プ
ルランなどにも作用して還元力を増加することなどから
、水も受容体になると考えられる。

これに対し、パシルス・ズブチルスの生産するルトシル
か６÷）シトペンタオシル単位で転移すると報告されて
いる（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４３．４７３２（１９６８））
。

２）作用ｐＨおよび最適作用ｐＨ ｐＨ約３〜約９の広い範囲で作用し、最適作用ｐＨは５
付近に認められたく第３図、１％可溶性澱粉、０．１Ｍ
酢酸緩衝液または燐酸緩衝液、１ｘｌＱ−”Ｍ塩化カル
シウムの下で、５０℃で、１時間反応）。

３）作用温度範囲および最適作用温度 約８０°Ｃの温度まで作用し、最適作用温度は約６０°
Ｃに認められた（第４図、１％可溶性澱粉、２．５Ｘ１
０−”Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）の下で、３０分間反応）
。

４）熱安定性 酵素水溶液を５０．５５．６０℃で、それぞれ１０分間
加熱処理してのち、残存活性を測定した。

その結果、それぞれ、約Ｏ％、約３０％、約８０％失活
した。５０°Ｃでは、３０分間加熱しても殆−ゼは熱に
不安定で、５０℃、１５分の加熱で、約５０％失活する
と報告されている［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４３．４７３２（１
９６ｇ）ｌ。

５）ｐＨ安定性 ｐＨ約４．５〜約７で安定であった（５ｘ１０−”Ｍ酢
酸緩衝液またはトリス緩衝液の下で、室温で３時間放置
後、残存活性を測定）。

６）安定化剤および賦活剤 カルシウムおよび鉄イオンの存在は酵素を安定化スる。

またカルシウム　イオンは酵素活性を増加する。前記バ
シルス・ズブチリスの酵素ではこのような性質は認めら
れていない（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４３．４７３２（１９６ｇ
）　ｌ。

７）阻害剤 ｌＸｌ０−’Ｍの銅、水銀、銀イオンにより強く阻害さ
れる。

８）分子量 セファデックスＧ−２００を用いたゲルろ過法されてい
る（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２４３．４７３２（１９６８））　　。

９）精製方法 本酵素は、培養上澄に硫酸アンモニウムを７０％飽和に
なるように加え、生成する沈澱区分を遠心分離により集
め、透析、濃縮後、セファデックスＧ−２００カラムク
ロマトグラフイー、同カラムによる再クロマトグラフィ
ーにより、均一まで生成することができる。

１０）力価測定法 ｌＸｌ０−’Ｍ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０）に溶解した２％可溶性澱粉（またはプ
ルラン）溶液０．　５　ｍｌに、適量の酵素を加え、蒸
溜水で全ｆｆ１１ｍ１とし、６０℃で反応させる。この
条件で、１分間に１μＭのグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量をＩＡ単位（プルランを基質とすると
きｌＰ小単位とした。精製酵素の場合、Ｐ単位／Ａ単位
は、約１／４である。

（発明の効果） 第１表は、３０％濃度のデキストリンを、ｐＨ４，５、
ｃａｅｏ″Ｃで、市販アスペルギルス・ニガーのグルコ
アミラーゼを用いて、７２時間糖化したときの、グルコ
ース収量に対する、本発明の酵素および市販バシルス属
プルラナーゼの効果を示している。

第１表 糖成分　　対照　プルラナーゼ　本発明酵素Ｇ　１　　
９５．２　（％’）　　９７．２（％）　　　　９７．
１（％）Ｇ２　　　１．７　　　１．７　　　　　２．
２Ｇ３　　痕跡　　　０．３　　　　　０．２Ｇ４−　
　３．０　　　０．８　　　　　０．５表から明らかな
ように、グルコアミラーゼ単独では、９５．２％のグル
コースしか得られなかったが、本発明の酵素を存在させ
たときは、９７゜１％の収量でグルコースが得られた。

この収量は、プルラナーゼを用いた場合の収ｆｆ１（９
７’、２％）とほぼ同じあった。しかし、本発明の酵素
の場合、場合よりも少ないという特徴がみられた。

糖化液中に高分子量のオリゴ糖が存在すると、糖液の濾
過性が悪くなり、また濁りを生ずる原因になるので、高
分子のオリゴ糖はできるだけ少ないことが望ましい。従
って、本発明の酵素はグルコースの増収という効果のほ
かに、分子量の大きいオリゴ糖の少ない糖液が得られる
という利点がある。

第２図はグルコアミラーゼ単独および本発明の酵素を併
用したときの液化澱粉糖化の時間経過を示しているが、
図から明らかなように、本酵素が存在すると糖化が促進
されるという効果も認められた。このことは、グルコア
ミラーゼを節減できることを意味している。

グルコアミラーゼによる澱粉糖化に本発明の酵素が果た
す役割は、次ぎのように理解することができる。すなわ
ち、グルコアミラーゼの基質に対する親和性（反応性）
は、グルコースの重合度に性が大きい。グルコアミラー
ゼによる澱粉糖化の後期には、グルコアミラーゼによっ
て分解し難い種々の重合度のオリゴ糖が生成するが、本
発明の酵素は、分解と転移作用を通じて、グルコアミラ
ーゼの分解し易い基質を供給することにより、分解率が
向上し、グルコースが増収できるものと考えられる。し
たがって、このような転移作用を持つ酵素は、本発明で
例示した酵素と同様に、グルコースの増収を達成するこ
とができる。しかし、このような転移作用のない、例え
ば、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）やアスペルギ
ルスｅオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａ
ｅ）などのα−アミラーゼを用いても、グルコースの増
収効果は認められなかった。

一方、プルラナーゼによる糖化反応の促進は、グルコア
ミラーゼの弱い分岐結合（α−１，６−グルコシド結合
）切断能を補うことにあ、ると考え粉糖化物の糖組成は
、当然、異なると考えられる。

本発明の酵素を生産する例示菌として、土壌中よす分離
したバシルス・メガテリウＡ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｃ
４ａＬｃｒｉｕｍ　）を挙げる。本菌株は下記の酵素的
性質を持っている。

■）形態：　桿菌、運動性あり ２）芽胞：　胞子嚢；非膨出、胞子；楕円形、位置；中
立〜亜端立 ３）ダラム染色：　＋ ４）カタラーゼ：　＋ ５）ｖ−ｐ反応二　− ｐＨ５，０ ６）嫌気下での生育二　− ７）澱粉分解：　＋ ８）ゼラチン液化：　＋ ９）卵黄反応二　− １０）グルコースより酸生産：　＋ １’　１　）グルコースよりガス生産二　−１４）クエ
ン酸塩の利用：　十 １５）５％ＮａＣ１存在下テノ生育：　＋１６）硝酸塩
還元：　− 以上の菌学的性質について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎ
ｕａｌｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙの８版（ＴｈｅＷｉｌｌｉａｍ　＆　Ｗ
ｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、、１９７４）を参照し、本菌をバ
シルス、メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔ
ｅｒｉｕｍ）と同定した。本菌は工業技術院微生物工業
技術研究所ににＦＥＲＭ　ＢＰ−１６７２として寄託さ
れている。

本菌株を用いて、本発明の酵素を生産するには、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカ
ーのような有機窒素源、尿素、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝
酸カリウムのような無機窒素化合物、そして、炭素源と
しては、可溶性澱粉、デキストリン、砂糖、マルトース
、グルコースなどが使用される。この他、少量のリン酸
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などを添加した培生
産されるので、培養後、濾過または遠心分離により除菌
し、上澄液を濃縮するか、または、硫酸ナトリウム、硫
酸アンモニウムなどで塩析沈澱させるか、または、メタ
ノール、エタノール、プロパツール、イソプロパツール
、アセトンのような有機溶剤を加えて、酵素を沈澱させ
回収する。

本菌株は、本発明の酵素以外に、マルトース生成アミラ
ーゼを生産する。この酵素は、グルコースの増収作用は
持たず、本発明の酵素の活性測定においては妨害となる
ので、培養液または粗酵素の場合、プルランを基質とし
て用いると、本発明の酵素を正確に測定することができ
る。

本発明の酵素をグルコアミラーゼと併用して、澱粉を糖
化する反応は、通常、液化澱粉濃度３０〜３５（Ｙ／Ｖ
）％、ｐＨ４〜５、温度５５〜６０°Ｃで、２〜４日間
行われる。

次に、実施例により本発明の詳細な説明する。

０．３％、Ｍｇ５Ｏｔ・７Ｈ２００，１％からなる培地
（ｐＨ５）３００ｍｌを２リツトル容三角フラスコに入
れ、常法により、殺菌後、バシルスメガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＦＥＲＭ　ＨＰ
−１６７２接種し、３０°Ｃで、４日間振盪培養した。

培養後、遠心分離した上澄液について、酵素の生成量を
測定した結果は、培地ｍ１当たり１．５Ｐ単位であった
。

該培養上澄に、硫酸アンモニウムを７０％飽和になるよ
うに加え、生成した沈澱を遠心分離により集め蒸溜水に
溶解し、蒸溜水に対し透析したものを、以下の糖化実験
に使用した。

実施例２ 基質として市販デキストリン（日本資料（株）製、ＮＳ
Ｄ　　ＤＥ約１３）、グルコアミラーゼは日本フィン・
シュガー（株）から市販されているアスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）起シトプ
ルリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｕ
ｌｉｔｉｃｕｓ）起源のものを使用した。反応液の組成
を、第２表に示す。

第　　２　　表 試　基質　糖化酵素　プルラナーゼ　本酵素料　（ｇ）
（％対置形）　（単位／ｇ）（単位／ｇ）１３．３０．
１　　　　０　　　　　　０２　３．３　　０．１　　
　　０．２５　　　　　０：（３，３Ｇ、１　　　　０
　　　　　０．２５それぞれ、全ｉｌｌ　Ｏｍ　Ｉとし
、ｐＨ４，５，６０℃で６５よび７２時間糖化したく本
酵素使用の試料３においては、ＣａＣ１ｔをｌ　Ｘ　１
０−”Ｍ量添加した）。糖化液の糖組成は高速液体クロ
マトグラフ法により定量した。得られた結果を第３表に
示す。

糖化時間（時）　　　　６５　　　　　　７２試　　　
料　　　　　　１２３１２３ Ｇ＋（％）　　　　９５．１９６．７９６．６　９５．
２９７．２９７．ＩＯ２（％）　　　　１．７　１．８
　２．１　１．７　１．７　２．２０３（％）　　　痕
跡　０．４　０．３　　痕跡０．３０．２’０４以上（
％）　　３．２　１．Ｌ　　Ｌ、０　３．０　　Ｇ、８
　０．５表から明らかなように、本酵素を使用した場合
、無添加の場合に比ベグルコースの収量が約２％増加し
た。そして、この増加はプルラナーゼを用いた場合とほ
ぼ同じであった。本酵素を用いた場合、プルラナーゼ使
用の場合に比べ、三糖類は少し多いが、三糖類以上のも
のは少なかった。

実施例３ トウモロコシ澱粉を細菌α−アミラーゼで液化した液化
澱粉（ＤＥ約１３）を固形分として３ｇ。

グルコアミラーゼを固形分光たり０，１％、およびこれ
に実施例１で調製した酵素０．７５単位、ＣａＣ１＊　
Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ添加したもの、それぞれ、全量１０
＋＊１とし、ｐＨ４，５，６０℃で反応させた。

在するとき、存在しない場合に比べ、糖化反応が促進さ
れた。また、グルコースも高い収量で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、転移酵素Ａを１％マルトトリオースに作用さ
せたときの生成物の糖組成を示している。 第２図は、グルコアミラーゼによる液化澱粉糖化におい
て、転移酵素Ａの影響を示している。 第３図は、転移酵素Ａの最適作用ｐＨを示している。 第４図は、転移酵素Ａの最適作用温度を示している。 特許出願人　工業技術院長　　　飯塚　幸三溶出時間（
分） 反応時間（時）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 糖転移酵素Ａを生産するバシルス属菌を培養し、培養物
   から糖転移酵素Ａを採取することを特徴とする糖転移酵
   素Ａの製造法。