JP3148505B2 - 非還元末端６‐アジド化マルトペンタオースの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は非還元末端６‐アジド化
マルトペンタオースの新規な製造方法に関するものであ
る。さらに詳しくいえば、本発明は、それ自体α‐アミ
ラーゼ活性測定用基質となるが、特に、α‐アミラーゼ
活性測定用基質として極めて有用な還元末端グルコース
の１位に配糖体として芳香族発色性基を導入した非還元
末端６‐アジド化マルトペンタオシド誘導体の中間体と
して用いられる非還元末端６‐アジド化マルトペンタオ
ースを効率よく製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】非還元末端修飾オリゴサッカライドの製
造方法としては、修飾シクロデキストリンにアクセプタ
ーの存在下シクロマルトデキストリングルカノトランス
フェラーゼを作用させたのち、グルコアミラーゼ又はα
‐グルコシダーゼを作用させる方法が知られているが
（特開昭６３−１７０３９３号公報）、この方法は、再
利用できない副生物の割合が比較的多くなるのを避けら
れないため、使用原料に基づく収率を高くすることがで
きず、工業的方法としては、必ずしも満足しうるもので
はなかった。

【０００３】また、本発明者らは、先に６‐アジド化シ
クロデキストリンにシクロデキストリナーゼを作用させ
たのち、エキソ型糖化酵素類を作用させることにより非
還元末端６‐アジド化マルトペルースを製造する方法を
提案した（特開平５−２６２７８４号公報）。しかしな
がら、この方法もシクロデキストリナーゼによりシクロ
デキストリンを開裂する場合の開裂部位により事実上、
目的物の構造をとり得ない副生物の生成を抑制すること
ができず、収率的にはまだ満足しうるものとはいえな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特に、α‐
アミラーゼ活性測定用基質として極めて有用な還元末端
グルコースの１位に配糖体として芳香族発色性基を導入
した非還元末端６‐アジド化マルトペンタオシド誘導体
の中間体として用いられる非還元末端６‐アジド化マル
トペンタオースを効率よく大量に製造する方法を提供す
ることを目的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために種々研究を重ねた結果、加水分解酵素
である特定の理化的性質を有するシクロデキストリナー
ゼがシクロデキストリンの開裂と糖鎖の加水分解活性の
みならず、グルコースの強い転移活性をも有しているこ
と、６‐アジド化シクロデキストリンにグルコースの存
在下で該シクロデキストリナーゼを作用させて得た各種
６‐アジド化マルトオリゴ糖に、マルトースの存在下で
糖の転移酵素であるシクロデキストリングルカノトラン
スフェラーゼを作用させると、マルトースが６‐アジド
化グルコース残基から還元末端方向の２番目と３番目の
グルコース残基の間に選択的に転移して、反応液におけ
る目的物質の非還元末端６‐アジド化マルトペンタオー
ス及びこれを分子内の還元末端側に有するマルトオリゴ
糖の含有率が高められること、そして後者の酵素作用の
後又は前にエキソ型糖化酵素類を作用させて非還元末端
側のグルコース残基を加水分解させて除去することによ
り、非還元末端６‐アジド化マルトペンタオースを効率
よく容易に製造しうることを見出し、これらの知見に基
づいて本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、一般式

【化４】 （式中のｎは５又は６である）で表わされる６‐アジド
化シクロデキストリンに、グルコースの存在下、（イ）
シクロデキストリンを開裂し、シクロデキストリンのグ
ルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成させる
作用及び（ロ）シクロデキストリンに対する水解速度又
は親和性が多糖類あるいはシクロデキストリンと同じ重
合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有するシ
クロデキストリナーゼを作用させて、一般式

【化５】 （式中のｎは前記と同じ意味をもち、ｍはｎが５のとき
３〜６の整数、ｎが６のとき３〜７の整数である）で表
わされる６‐アジド化マルトオリゴ糖を生成させ、次い
で、マルトースの存在下でシクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ及びエキソ型糖化酵素類を任意の順
序で作用させることを特徴とする、式

【化６】 で表わされる非還元末端６‐アジド化マルトペンタオー
スの製造方法を提供するものである。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明における出発物質である前記一般式（Ｉ）で表わさ
れる６‐アジド化シクロデキストリンはいかなる方法で
製造してもよいが、例えば市販のα‐又はβ‐シクロデ
キストリン（グルコース重合度はそれぞれ６、７であ
る）、好ましくは、安価なことからβ‐シクロデキスト
リンから公知の方法により製造することができる。

【０００８】この製造方法の好適な実施態様について説
明すると、まず、シクロデキストリンをピリジンなどの
溶媒に溶解し、このシクロデキストリンに対し、２〜７
倍モル量のトシルクロリドを添加し、通常１５〜３０℃
の範囲の温度で４〜６時間程度反応させて６位ヒドロキ
シル基のうちの１個のみをトシル化し、必要に応じ常法
に従い精製して、６‐Ｏ‐トシルシクロデキストリンを
得る。次いで、これを極性溶媒中で６‐Ｏ‐トシルシク
ロデキストリンに対し、２〜５０倍モル量のアジ化ナト
リウムを添加し、通常７０〜９０℃の範囲の温度で３〜
１０時間程度反応させてトシルオキシ基をアジド基に置
換する。この際に用いる極性溶媒としては、例えば水、
アセトン、１，４‐ジオキサン、アセトニトリル、ジメ
チルホルムアミドなどが挙げられ、これらは単独で又は
２種以上を混合して用いてもよい。そして必要に応じ、
常法、例えばテトラクロロエタン包接体を水溶液からろ
別する方法、トルエン包接体のろ別法などに従い精製し
て６‐アジド化シクロデキストリンを得ることができる
［「カルボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒ．Ｒｅｓ．）」第１８巻、第２９〜３７ページ（１９
７１年）参照］。

【０００９】このようにして、前記一般式（Ｉ）で表わ
される出発物質としての６‐アジド化α‐シクロデキス
トリン（ｎ＝５）又は６‐アジド化β‐シクロデキスト
リン（ｎ＝６）を容易に製造することができるが、後続
の工程における酵素反応速度を考慮すると、原料として
は６‐アジド化β‐シクロデキストリンが好ましい。

【００１０】図１は、出発物質として６‐アジド化β‐
シクロデキストリンを用いた場合を例として本発明の製
造方法における目的物質の生成過程を示す説明図であ
る。

【００１１】なお、図１において、Ｇ及びＧ^N3は、それ
ぞれグルコース残基、６位のヒドロキシル基がアジド基
で置換されたグルコース残基、ＣＤａｓｅ及びＣＧＴａ
ｓｅは、それぞれ後記のシクロデキストリナーゼ、シク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼを意味す
る。

【００１２】次に、前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐
アジド化シクロデキストリンに作用させるシクロデキス
トリナーゼについては、（イ）シクロデキストリンを開
裂し、シクロデキストリンのグルコース重合度に由来す
るマルトオリゴ糖を生成させる作用を有し、かつ（ロ）
シクロデキストリンに対する水解速度又は親和性が、多
糖類あるいはシクロデキストリンと同じ重合度の直鎖オ
リゴ糖よりも大きい基質特異性を有するものであればど
のようなものでもよく、特に制限されず、またその起源
についても特に制限はない。

【００１３】このような酵素の中で好適なものとして
は、次の理化学的性質を有する公知のシクロデキストリ
ナーゼを挙げることができる。なお、このシクロデキス
トリナーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎａｓｅ、以下Ｃ
Ｄａｓｅという）は加水分解酵素であって、シクロマル
トデキストリナーゼ（ｃｙｃｌｏｍａｌｔｏｄｅｘｔｒ
ｉｎａｓｅ）とも呼称され、ＥＣ ３．２．１．５４に
属するものである［「Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」第３９巻、第７１４〜７１９ペ
ージ（１９９３年）参照］。

【００１４】理化学的性質 （イ）作用：シクロデキストリンを開裂し、シクロデキ
ストリンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖
を生成させる作用を有する。

【００１５】（ロ）基質特異性：シクロデキストリンに
対する水解速度又は親和性が、多糖類あるいはシクロデ
キストリンと同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基
質特異性を有する。

【００１６】（ハ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：β‐シ
クロデキストリンを基質とした場合、ｐＨ８．０近傍に
至適ｐＨを有し、かつ安定ｐＨ範囲が５．５〜９．５で
ある。 （ニ）作用適温：４０℃近傍に作用適温を有する。 （ホ）失活性：５０℃以上の温度で１５分間の処理によ
り、ほぼ失活する性質を有する。

【００１７】（へ）阻害及び活性化：Ｈｇ²⁺、Ｃｕ²⁺、
Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺及びＦｅ²⁺により９０％以上阻害され、
Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺により１０〜３０％活性化される性質
を有する。

【００１８】（ト）分子量：ゲルろ過法による分子量が
１４４，０００で、ＳＤＳ ＰＡＧＥ法による分子量が
７２，０００である。すなわち、この酵素は分子量７
２，０００のサブユニットから成る二量体である。

【００１９】なお、この酵素の力価は、２％（ｗ／ｖ）
濃度のβ‐シクロデキストリン溶液５００μｌ及び適当
量の酵素を含有する１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）５００μｌを混和し、温度４０℃で適当時間
反応させたのち、１０分間煮沸することにより反応を停
止し、高速液体クロマトグラフィーによって、生成した
マルトヘプタオースを定量することにより求めた。ま
た、酵素量が少量の場合には、グルコースを標準とした
ソモギーネルソン法により還元力を測定することにより
求めた。

【００２０】この酵素の酵素単位については、１分間に
１マイクロモルのマルトヘプタオースを生成する酵素量
を１単位とした。このような性質を有する酵素は、例え
ばバチルス属に属し、この酵素を産生する微生物、例え
ばバチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈ
ａｅｒｉｃｕｓ）Ｅ−２４４菌株［工業技術院微生物工
業技術研究所（現 工業技術院生命工学工業技術研究
所）に微工研条寄第２４５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２４５
８）として寄託されている］などを培地に培養し、この
培養物より採取することにより得られる。

【００２１】なお、前記酵素の理化学的性質や、その産
生菌バチルス・スフェリカスＥ−２４４菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２４５８）の菌学的性質及びそれを用いて酵素
を製造する方法は公知である（特開平３−１５３８４号
公報及び特開平３−８６７０１号公報）。

【００２２】前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐アジド
化シクロデキストリンに、グルコースの存在下、前記Ｃ
Ｄａｓｅを作用させると、酵素の糖転移活性により環状
糖鎖の不特定の位置に１回のみグルコースの転移がおこ
り、前記一般式（ＩＩ）で表わされる、種々の位置に６
位アジド化グルコース残基を有する６位アジド化マルト
オリゴ糖の混合物を主成分とする反応液が得られる。こ
の反応において、グルコースを存在させることによっ
て、不存在のときに比べて、理論値として目的化合物と
なりうる物質の生成が約３０％増加する。なお、グルコ
ースの代わりにマルトースを用いた場合には、この糖転
移反応はほとんどみられない。

【００２３】この酵素反応における６‐アジド化シクロ
デキストリン（出発物質）の濃度は、特に制限されない
が、ＣＤａｓｅの基質に対するＫｍ値以上の濃度になる
ように調整することが好ましい。共存させるグルコース
量についても特に制限はなく、通常６‐アジド化シクロ
デキストリンの３〜２０倍モル量の範囲から選ばれる。
また、酵素量については特に制限はないが、反応時間内
に生成物量が最大となるように、適宜必要量を添加すれ
ばよく、通常出発物質１ｇに対して０．５〜１０単位の
範囲で選ばれる。

【００２４】酵素反応条件については、ＣＤａｓｅの作
用ｐＨ及び作用温度の範囲であればよく、特に制限はな
いが、通常ｐＨ６．５〜９．０、温度３５〜４５℃の条
件で反応が行われ、反応時間は３０分〜４８時間が適当
である。さらに、この反応において、必要に応じて１，
４‐ジオキサン、アセトン、ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）な
どの水溶性有機溶媒を添加してもよい。

【００２５】また、ＣＤａｓｅによる酵素反応の終了後
には、例えば塩酸、酢酸などを用いた酸処理、７５〜１
００℃で３０〜１８０分間の熱処理などによる酵素の失
活処理を行うのが好ましい。

【００２６】このようにして、前記一般式（ＩＩ）で表
わされる各種６‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物を主
成分とする反応液が得られるが、この反応液としては、
例えば出発物質が６‐アジド化β‐シクロデキストリン
（ｎ＝６）の場合には、６^p‐アジド化マルトオクタオ
ース（ｐ＝２〜８の整数）の混合物を主成分とするもの
が得られ、また６‐アジド化α‐シクロデキストリン
（ｎ＝５）の場合には、同様に６^q‐アジド化マルトヘ
プタオース（ｑ＝２〜７の整数）の混合物を主成分とす
るものが得られる。

【００２７】なお、例えば６⁸‐、６⁷‐などの記号は、
マルトオリゴ糖を構成するグルコースの還元末端側から
８番目、７番目のグルコース残基の６位の水酸基が置換
されていることを示す。

【００２８】次に、このようにして得られた前記一般式
（ＩＩ）で表わされる各種６‐アジド化マルトオリゴ糖
の混合物を主成分とする反応液に、マルトースの存在下
でシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ及び
エキソ型糖化酵素類を任意の順序で作用させることによ
り、すなわちマルトースの存在下でシクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼを作用させたのち、エキソ
型糖化酵素類を作用させるか、あるいはエキソ型糖化酵
素類を作用させたのち、マルトースの存在下でシクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて、
目的物質の前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる非還元末
端６‐アジド化マルトペンタオースを得る。

【００２９】すなわち、前記一般式（ＩＩ）で表わされ
る各種６‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物を主成分と
する反応液に、マルトースの存在下でシクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼを作用させることによ
り、マルトースが６‐アジド化グルコース残基から還元
末端方向の２番目と３番目のグルコース残基の間に選択
的に転移し、６‐アジド化グルコース残基から還元末端
方向にグルコース残基が４個重合した構造を有するマル
トオリゴ糖を主成分とする、一般式

【化７】 （式中のｎ及びｍは前記と同じ意味をもつ）で表わされ
る各種６‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物を含有する
反応液が得られる。

【００３０】マルトース存在下でのこの酵素反応は、前
記図１に示されるように、反応液における、非還元末端
６‐アジド化マルトペンタオース及び分子内の還元末端
側に６⁵‐アジド化マルトペンタオース部を有する６‐
アジド化マルトオリゴ糖の含有率を高める意義を有して
いる。すなわち、酵素反応前の反応液における６‐アジ
ド化マルトペンタオース及び分子内の還元末端側に６⁵
‐アジド化マルトペンタオース部を有する６‐アジド化
マルトオリゴ糖の理論的含有率は、出発物質が前記一般
式（Ｉ）で表わされる６‐アジド化α‐シクロデキスト
リン（ｎ＝５）のときは１／７、６‐アジド化‐β‐シ
クロデキストリン（ｎ＝６）のときは、１／６である
が、酵素反応により、反応液におけるそれらの理論的含
有率を、それぞれ５／７、４／６にと５倍又は４倍にも
高めることができ、その結果、次工程でのエキソ型糖化
酵素類を作用させることによって、目的物質の非還元末
端６‐アジド化マルトペンタオースを高収率で得ること
ができる。

【００３１】なお、前工程の酵素反応により得られた反
応液をそのまま本工程の酵素反応に供してもよいが、本
工程では反応液に含有されるグルコース及び各種無置換
マルトオリゴ糖の糖転移が副反応として起こるので、反
応収率を向上させるためにあらかじめこれらを、例えば
オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）、活性炭カラムク
ロマトグラフィーなどにより除去してから行うのが好ま
しい。

【００３２】また、前記図１に示されるように、前工程
で得られた反応液の６³、６²‐アジド化マルトオクタオ
ース又は６³、６²‐アジド化マルトヘプタオースには、
本工程での糖転移は生起せず、そのまま反応液に存在す
るので、あらかじめこれらの６‐アジド化マルトオリゴ
糖を適宜の精製法、例えば活性炭カラムクロマトグラフ
ィー、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーなどにより除去
してもよい。

【００３３】本発明において用いられるシクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔ
ｒｉｎ ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下
ＣＧＴａｓｅという）は公知の転移酵素であって、シク
ロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ｃ
ｙｃｌｏｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｕｌｕｃａｎｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とも呼称され、ＥＣ ２．
４．１．１９に属するものである。ＣＧＴａｓｅの由来
には特に制限はなく、例えばバチルス属［例えばバチル
ス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎ
ｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）など］由来のもの、クレブシェ
ラ属［例えばクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）など］由来のものな
どが用いられる。

【００３４】このＣＧＴａｓｅを作用させる際の反応条
件は、通常の酵素反応と同様の条件が用いられ、特に制
限されないが、ｐＨは５．５〜８．０、温度は３５〜５
０℃、反応時間は０．５〜４８時間程度が好ましい。Ｃ
ＧＴａｓｅの使用量も通常の酵素反応の場合に用いられ
る範囲内で特に制限はないが、前記一般式（ＩＩ）で表
わされる各種６‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物の合
計重量１ｇに対し、５０〜１０００単位の範囲で選ぶの
がよい。また、共存させるマルトース量についても特に
制限はなく、前工程で得られた各種６‐アジド化マルト
オリゴ糖の混合物の３〜２０倍モル量の範囲から選ばれ
る。

【００３５】この反応において、必要に応じて１，４‐
ジオキサン、アセトン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、イソプロパ
ノールなどの水溶性有機溶媒を添加してもよい。また反
応系内に副生してくるグルコースを除去する目的で、マ
ルトースやマルトオリゴ糖とは反応せず、グルコースの
みと反応する酵素類、例えばグルコースオキシダーゼ、
グルコースデヒドロゲナーゼなどを添加することもでき
る。

【００３６】また、ＣＧＴａｓｅによる酵素反応の終了
後には、例えば塩酸、酢酸などを用いる酸処理、７５〜
１００℃で３０〜１８０分間の熱処理などによる酵素の
失活処理を行う。

【００３７】このようにして前記一般式（ＩＶ）で表わ
される各種６‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物を主成
分とする反応液が得られるが、この反応液としては、例
えば出発物質が６‐アジド化β‐シクロデキストリン
（ｎ＝６）の場合には、６⁵‐アジド化マルトノナオー
ス〜６⁵‐アジド化マルトペンタース（グルコースの重
合度が９、８、７、６及び５のもの）、また、６‐アジ
ド化α‐シクロデキストリン（ｎ＝５）の場合には、６
⁵‐アジド化マルトオクタオース〜６⁵‐アジド化マルト
ペンタース（グルコースの重合度が８、７、６及び５の
もの）の混合物を主成分とするものが挙げられる。

【００３８】そして、この反応液中には副成分として前
記した未反応の６³、６²‐アジド化マルトオクタオース
又は６³、６²‐アジド化マルトヘプタオースの他に、Ｃ
ＧＴａｓｅの作用により共存させたマルトースから生じ
たグルコース、マルトトリオース、マルトテトラオース
などがさらに糖転移して生じた６⁴‐アジド化マルトオ
クタオース〜６⁴‐アジド化マルトテトラオース（グル
コースの重合度が８、７、６、５及び４のもの）、６⁶
‐アジド化マルトデカノース〜６⁶‐アジド化マルトヘ
キサオース（グルコースの重合度が１０、９、８、７及
び６のもの）、６ ⁷‐アジド化マルトウンデカノース〜
６⁷‐アジド化マルトヘプタオース（グルコースの重合
度が１１、１０、９、８及び７のもの）などが含まれ
る。

【００３９】なお、出発物質である６‐アジド化シクロ
デキストリンに対して、本発明方法のようにグルコース
の存在下でのＣＤａｓｅによる酵素反応を行うことな
く、直接マルトースの存在下でのＣＧＴａｓｅによる酵
素反応を行っても６⁵‐アジド化マルトペンタオース及
び分子内の還元末端側に６⁵‐アジド化マルトペンタオ
ース部を有する６‐アジドマルトオリゴ糖を含有する反
応液は得られるが、この場合には、反応収率が極めて低
く、本発明の目的を達成することができない。この原因
としては、ＣＧＴａｓｅがマルトースの転移反応以外
に、切断反応や再配列反応を起こしやすいことなどが考
えられる。

【００４０】次に、このようにして得られた反応液にエ
キソ型糖化酵素類を作用させて、６‐アジド化グルコー
ス残基が非還元末端となるように、非還元末端側に存在
する無置換グルコース残基を加水分解させると前記一般
式（ＩＩＩ）で表わされる非還元末端６‐アジド化マル
トペンタオース（６⁵‐アジド化マルトペンタオース）
を主成分とするものが得られる。なお、一般式（ＩＩ
Ｉ）における〜ＯＨは、ＯＨ基がα‐アノマー、β‐ア
ノマー又は両者の混合物であることを示している。

【００４１】また、この反応液には副成分としては６²
‐アジド化マルトース、６³‐アジド化マルトトリオー
ス、６⁴‐アジド化マルトテトラオース、６⁶‐アジド化
マルトヘキサオース、６⁷‐アジド化マルトヘプタオー
スなどが含有される。

【００４２】この際に用いられるエキソ型糖化酵素類と
しては、例えば公知のグルコアミラーゼ、α‐グルコシ
ダーゼなどが挙げられるが、これらは単独で用いてもよ
いし、組み合わせて用いてもよい。また、その由来につ
いては特に制限されないが、グルコアミラーゼはリゾプ
ス属由来のもの、α‐グルコシダーゼは酵母由来のもの
などがその例として挙げられる。

【００４３】エキソ型糖化酵素類を作用させる場合の反
応条件としては、用いる酵素の作用ｐＨ及び作用温度範
囲で適宜選べばよいが、通常ｐＨ４．０〜８．０、温度
３５〜５０℃において、０．５〜４８時間程度反応が行
われる。

【００４４】さらに、エキソ型糖化酵素類の使用量につ
いては通常の酵素反応に使用される範囲内で特に制限は
ないが、通常、前記一般式（ＩＶ）で表わされる各種６
‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物の合計重量１ｇに対
し５０〜１０００単位の範囲で選ばれる。また、この酵
素反応は前記ＣＤａｓｅやＣＧＴａｓｅの場合と同様に
酸処理や熱処理などにより停止させることができる。

【００４５】次に、前記一般式（ＩＩ）で表わされる各
種６‐アジド化マルトオリゴ糖を主成分とする反応液に
エキソ型糖化酵素類を作用させたのち、ＣＧＴａｓｅを
作用させる場合について説明する。

【００４６】すなわち、この場合においては、エキソ型
糖化酵素類を作用させることにより、非還元末端側のグ
ルコース残基が加水分解されて除去され、出発物質が６
‐アジド化β‐シクロデキストリンの場合には、非還元
末端６‐アジド化マルトオクタオース〜非還元末端６‐
アジド化マルトース（グルコースの重合度が８、７、
６、５、４、３及び２のもの）が、また、出発物質が６
‐アジド化α‐シクロデキストリンの場合には、非還元
末端６‐アジド化マルトヘプタオース〜非還元末端６‐
アジド化マルトース（グルコースの重合度が７、６、
５、４、３及び２のもの）の混合物を主成分とする反応
液が得られる。

【００４７】この際のエキソ型糖化酵素類による反応条
件としては、用いる酵素の作用ｐＨ及び作用温度範囲で
適宜選べばよいが、通常ｐＨ４．０〜８．０、温度３５
〜５０℃において、０．５〜４８時間程度反応が行われ
る。さらに、エキソ型糖化酵素類の使用量については特
に制限はないが、通常、前記一般式（ＩＩ）で表わされ
る各種６‐アジド化マルトオリゴ糖の混合物の合計重量
１ｇに対し５０〜１０００単位の範囲で選ばれる。

【００４８】次いで、この酵素反応を前記と同様にして
酸処理や熱処理などにより停止させたのち、前記のよう
にしてマルトースの存在下でＣＧＴａｓｅを作用させる
ことにより、前記一般式（ＩＶ）で表わされる６‐アジ
ド化マルトオリゴ糖における非還元末端側のグルコース
残基のないものが得られる。この際マルトースの存在下
でＣＧＴａｓｅを作用させる反応条件などについては、
前記と同様のものが採用される。

【００４９】本発明において特に好適な態様としては、
例えば前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐アジド化シク
ロデキストリンに、グルコースの存在下でＣＤａｓｅを
作用させて、生成物が最大になった時点で、酸処理や熱
処理などにより、一旦反応を停止させたのち、例えば反
応液をＯＤＳカラムクロマトグラフィーなどに付してグ
ルコース及び各種無置換マルトオリゴ糖を除去し、次い
でこれにマルトースの存在下でＣＧＴａｓｅを作用さ
せ、生成物が最大になった時点で、酸処理や熱処理など
によりＣＧＴａｓｅを失活させる。次いで適正なｐＨに
液性を調整したのち、エキソ型糖化酵素類を作用させ、
生成物が最大になった時点で、酸処理や熱処理などによ
り反応を停止させる方法が挙げられる。

【００５０】次に、このようにして得られた非還元末端
６‐アジド化マルトオリゴ糖含有反応液から、所望の前
記一般式（ＩＩＩ）で表わされる非還元末端６‐アジド
化マルトペンタオースを分離精製するが、この分離精製
方法については特に制限はなく、従来オリゴ糖の分離精
製に慣用されている方法を用いることができる。例えば
活性炭カラムクロマトグラフィー、ＯＤＳカラムクロマ
トグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、
薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画採取する方法
などを採用することができる。

【００５１】こうして得られた前記一般式（ＩＩＩ）で
表わされる非還元末端６‐アジド化マルトペンタオース
は、これ自体α‐アミラーゼ活性測定用基質としても使
用できるが、特に、α‐アミラーゼ活性測定用基質とし
て極めて好適に用いることのできる、例えば該化合物の
還元末端グルコースの１位に配糖体として芳香族発色性
基を導入した、一般式

【化８】 （式中のＸは芳香族発色性基である）で表わされる非還
元末端６‐アジド化マルトペンタオシド誘導体などの中
間体として有用である。

【００５２】なお、前記一般式（Ｖ）で表わされる非還
元末端６‐アジド化マルトペンタオシド誘導体におい
て、Ｘの芳香族発色性基としては、分光学的に検出でき
ればどのようなものでもよく、また、該誘導体はα‐ア
ノマー（α‐配糖体）又はβ‐アノマー（β‐配糖体）
のいずれであってもよい。

【００５３】このような前記一般式（Ｖ）で表わされる
化合物としては、例えば２‐クロロ‐４‐ニトロフェニ
ル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐β‐マルトペンタオ
シド、２‐フルオロ‐４‐ニトロフェニル＝６⁵‐アジ
ド‐６⁵‐デオキシ‐α‐マルトペンタオシド、４‐ニ
トロフェニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐β‐マル
トペンタオシド、フェノールインド‐３′‐クロロフェ
ニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐β‐マルトペンタ
オシド、レザズリニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐
β‐マルトペンタオシド、４‐アミノフェニル＝６⁵‐
アジド‐６⁵‐デオキシ‐β‐マルトペンタオシド、４
‐メチルウンベリフェロニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオ
キシ‐α‐マルトペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニト
ロフェニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐α‐マルト
ペンタオシド、ルシフェリニル＝６ ⁵‐アジド‐６⁵‐デ
オキシ‐β‐マルトペンタオシドなどが挙げられる。

【００５４】なお、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる
非還元末端６‐アジド化マルトペンタオース自体をα‐
アミラーゼ活性測定用基質として使用する場合のα‐ア
ミラーゼ活性測定用試薬、α‐アミラーゼ活性の測定方
法、さらには、前記一般式（Ｖ）で表わされる非還元末
端６‐アジド化マルトペンタオシド誘導体についての製
法、誘導体をα‐アミラーゼ活性測定用基質として使用
する場合のα‐アミラーゼ活性測定用試薬、α‐アミラ
ーゼ活性の測定方法は、既に知られている（例えば特開
平５−２６２７８４号公報）。

【００５５】

【発明の効果】本発明方法によれば、前記一般式（ＩＩ
Ｉ）で表わされる非還元末端６‐アジド化マルトペンタ
オースを、安価なシクロデキストリンを出発物質として
用い、短い反応工程でかつ簡便な操作により従来になく
効率よく大量に製造することができる。

【００５６】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。なお、各例中の比旋光度は２５℃においてナト
リウムのＤ線で測定した値である。

【００５７】実施例１ ６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルトペンタオース（非還
元末端６‐アジド化マルトペンタオース）の製造 （１）６‐アジド‐６‐デオキシ‐β‐シクロデキスト
リン（６‐アジド化β‐シクロデキストリン）の製造 （ａ）６‐Ｏ‐トシル‐β‐シクロデキストリンの製造 市販のβ‐シクロデキストリン［塩水港精糖（株）製］
１００ｇ（８８．２ｍｍｏｌ）をピリジン２００ｍｌに
溶解し、３０分間隔でトシルクロリド２２ｇ、２２ｇ、
２３ｇ（合計６７ｇ、３５０ｍｍｏｌ）を加え、最後の
トシルクロリドを加えてから室温下で１．５時間、かき
まぜながら反応させた。次いでこの反応液に水１０ｍｌ
を加えたのち、減圧下で溶媒を留去し、得られた濃縮液
に水１００ｍｌを加え、再度減圧下で溶媒を留去した。
得られた残渣に水１０００ｍｌを加えてかきまぜたの
ち、結晶種を少量加えて室温下に放置し、結晶化を行っ
た。この結晶をグラスフィルターでろ別し、水２００ｍ
ｌ、３００ｍｌ及びメチルエチルケトン３００ｍｌで洗
浄したのち、乾燥して６‐Ｏ‐トシル‐β‐シクロデキ
ストリンを３７．２ｇ（２８．９ｍｍｏｌ、収率３２．
８％）得た。

【００５８】 融点（℃）：１７２．０〜１７４．０（分解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ‐¹）：３４００，２９３
０，１６４２，１６３２，１６００，１４２４，１３６
０，１３００，１１７８，１１５６，１０７８，１０２
８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ：（ＤＭ
ＳＯ‐ｄ₆ ）２．４４（３Ｈ，ｓ），３．１５〜４．４
５（ｍ），４．７６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ），４．８５（５
Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）

【００５９】高速液体クロマトグラフィー［東ソー
（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．
６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセト
ニトリル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／
ｍｉｎ］：ｔ_R＝５．５ｍｉｎ

【００６０】（ｂ）６‐アジド‐６‐デオキシ‐β‐シ
クロデキストリンの製造 （ａ）で得られた６‐Ｏ‐トシル‐β‐シクロデキスト
リン３５ｇ（２７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１００ｍｌに溶解
し、アジ化ナトリウム５．３ｇ（８１ｍｍｏｌ）を加
え、９５℃で１．５時間反応させた。次いで反応液を減
圧下で濃縮乾固し、得られた残渣に水３０ｍｌを加えて
溶解し、結晶種を少量加えて５℃に冷却放置し、結晶化
を行った。この結晶をグラスフィルターでろ別し、冷水
５ｍｌ及び冷エタノール５０ｍｌで洗浄したのち、乾燥
して６‐アジド‐６‐デオキシ‐β‐シクロデキストリ
ン２７ｇ（２３ｍｍｏｌ、収率８６％）を得た。

【００６１】 融点（℃）：２１５．０〜２１８．０（分解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３９０，２９２０，
２１２０，１６４２，１４１４，１３７０，１３４０，
１３０４，１１５６，１０８０，１０３０ 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５
０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝
３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R
＝６．６ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５１０，１，４‐ジオキサ
ン／Ｈ₂Ｏ＝１：１（ｖ／ｖ）；＋１４５°

【００６２】 元素分析値：Ｃ₄₂Ｈ₆₉Ｎ₃Ｏ₃₄として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４３．４９ ６．００ ３．６２ 実測値（％） ４３．２８ ６．１１ ３．５３

【００６３】（２）ＣＤａｓｅの調製 １％（ｗ／ｖ）β‐シクロデキストリン、１％（ｗ／
ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び０．１
％（ｗ／ｖ）イーストエキスから成る液体培地（水道水
使用、ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラ
スコに入れ、１２０℃で２０分間、殺菌処理を行った。
これに、バチルス・スフェリカスＥ‐２４４（ＦＥＲＭ
ＢＰ‐２４５８）の保存スラントより１白金耳接種
し、３０℃で１日間振とう培養した。この培養液５０ｍ
ｌを、前記と同様の培地組成と殺菌条件により調製した
２０００ｍｌの培地を含有する３０００ｍｌ容ミニジャ
ーに接種して３０℃、１ｖｖｍ、３５０ｒｐｍの条件で
２日間通気かくはん培養を行い、培養終了後、この培養
液から８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離処理により
菌体を分離し、２％（ｗ／ｖ）トリトンＸ‐１００を含
有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌ
に菌体を懸濁して２５℃で１日間かきまぜた。該懸濁液
から１２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離処理により
菌体残渣を除去したのち、上澄液を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して１６時間透析した。得られた
透析物を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理して
不溶物を除去し、上澄を粗酵素液（１）とした。

【００６４】次いで、この粗酵素液（１）約５００ｍｌ
（総活性２００単位、タンパク量２０８３ｍｇ、比活性
０．１、ｐＨ７．０）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロース充填カラム
（φ３４×１７０ｍｍ）に供し、酵素を吸着させたの
ち、０〜１．５ＭＮａＣｌのグラジェント勾配により溶
出を行った。このようにして得られた活性フラクション
を集めて粗酵素液（２）１０５ｍｌ（総活性１４５単
位、比活性０．５８、収率７２．５％）を得た。続い
て、この粗酵素液（２）２０ｍｌ（総活性３１単位、タ
ンパク量２９ｍｇ）を１Ｍ硫酸ナトリウム含有１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したエーテル５
ＰＷ充填カラム（φ２１．５×１５０ｍｍ）に供し、酵
素を吸着させたのち、１Ｍ〜０硫酸ナトリウムのグラジ
ェント勾配により溶出を行った。このようにして得られ
た活性フラクションを集めて粗酵素液（３）５０ｍｌ
（総活性７２単位、比活性２．９３、収率３６％）を得
た。

【００６５】（３）６^p‐アジド化マルトオクタオース
（ｐ＝２〜８の整数）の製造 （１）で得た６‐アジド‐６‐デオキシ‐β‐シクロデ
キストリン５．０ｇ（４．３１ｍｍｏｌ）を、あらかじ
め４０℃に加温しておいた１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝７．５）２００ｍｌ中にかきまぜながら投入して完全
に溶解した。そこへ前記（２）で得たＣＤａｓｅの粗酵
素液（３）２３単位及びグルコース１０．０ｇ（５５．
５ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で７時間かきまぜながら反
応を行った。反応終了後、反応液を９０℃で１５分間か
きまぜながら加熱した。続いて反応液を室温まで冷却
し、スタンダードスーパーセル（セライト社製）でろ過
を行ったのち、水洗し、ろ液と洗液を合わせてＯＤＳカ
ラムクロマトグラフィーに供して精製し、アセトニトリ
ル‐水混液（容量比０％→５％グラジェント）で溶出
し、濃縮乾固して６^p‐アジド化マルトオクタオース
（ｐ＝２〜８の整数）２．６ｇ（１．９４ｍｍｏｌ、４
５．０％）を得た。

【００６６】高速液体クロマトグラフィー［東ソー
（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．
６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセト
ニトリル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／
ｍｉｎ］：ｔ_R＝１２．４ｍｉｎ

【００６７】（４）６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルト
ペンタオースの製造 （３）で得た６^p‐アジド化マルトオクタオース６００
ｍｇ（０．４４８ｍｍｏｌ）を、５ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ＝６．０）３０ｍｌ中にかきまぜながら溶解
し、そこへＣＧＴａｓｅ３００単位相当のコンチザイム
［天野製薬（株）製酵素液］及びマルトース１．８ｇ
（５．２６ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で４．５時間かき
まぜながら反応を行った。反応終了後、反応液を９０℃
で１５分間かきまぜながら加熱した。続いて反応液を室
温まで冷却し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）
でろ過を行ったのち、グルコアミラーゼ［東洋紡績
（株）製］１５００単位を加え、４０℃で１２時間かき
まぜながら反応を行った。反応終了後、反応液を９０℃
で１５分間かきまぜながら加熱した。続いて反応液を室
温まで冷却し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）
でろ過を行い、得られたろ液をＯＤＳカラムクロマトグ
ラフィーに供して精製し、アセトニトリル‐水混液（容
量比０％→５％グラジェント）で溶出し、１．５％アセ
トニトリルの溶出画分を凍結乾燥して６⁵‐アジド‐６⁵
‐デオキシ‐マルトペンタオース２２０ｍｇ（０．２５
８ｍｍｏｌ、５７．６％）を得た。

【００６８】融点（℃）：１７６．０〜１７９．０ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４００，２９２０，
２１１０，１６２８，１４０６，１３６０，１２７８，
１２４０，１１４４，１０７６，１０２２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ｄ
₂Ｏ）：２．８０〜４．００（ｍ），４．６４（０．５
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．２３（０．５Ｈ，ｄ，
Ｊ＝３．５Ｈｚ），５．３５（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈ
ｚ） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５
０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝
３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R
＝６．９ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５４４，Ｈ₂Ｏ）；＋１６
９° 元素分析値：Ｃ₃₀Ｈ₅₁Ｎ₃Ｏ₂₅として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．２１ ６．０２ ４．９２ 実測値（％） ４２．０３ ６．１３ ４．６９

【００６９】実施例２ ６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルトペンタオースの製造
（ＣＧＴａｓｅ作用前にエキソ型糖化酵素類を作用させ
る方法） （１）非還元末端６^s‐アジド化マルトオリゴ糖（ｓ＝
２〜８の整数）の製造 実施例１の（１）と同様にして得た６‐アジド‐６‐デ
オキシ‐β‐シクロデキストリン５．０ｇ（４．３１ｍ
ｍｏｌ）を、あらかじめ４０℃に加温しておいた１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）２００ｍｌ中にかきま
ぜながら投入し、完全に溶解した。これに実施例１の
（２）と同様にして得たＣＤａｓｅ２３単位及びグルコ
ース１０．０ｇ（５５．５ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で
７時間かきまぜながら反応を行った。反応終了後、反応
液を９０℃で１５分間かきまぜながら加熱した。次いで
反応液を室温まで冷却し、メンブランフィルター（０．
４５μｍ）でろ過を行ったのち、１Ｎ塩酸を加えて反応
液をｐＨ＝６．０に調整した。これにグルコアミラーゼ
［東洋紡績（株）製］１５００単位を加え、４０℃で１
２時間かきまぜながら反応を行った。反応終了後、反応
液を９０℃で１５分間かきまぜながら加熱した。得られ
た反応液を室温まで冷却し、メンブランフィルター
（０．４５μｍ）でろ過を行い、ろ液をＯＤＳカラムク
ロマトグラフィーに供して精製し、アセトニトリル‐水
混液（容量比０％→５％グラジェント）で溶出し、濃縮
乾固して非還元末端６^s‐アジド化マルトオリゴ糖（ｓ
＝２〜８の整数）の混合物約３ｇを得た。

【００７０】（２）６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルト
ペンタオースの製造 （１）で得た６^s‐アジド化マルトオリゴ糖（ｓ＝２〜
８の整数）の混合物の１／５量（約６００ｍｇ）を出発
原料に用いた以外は実施例１（４）と同様の操作を行
い、６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルトペンタオース１
８４ｍｇ（０．２１６ｍｍｏｌ、２工程通算収率２５．
１％）を得た。このものの理化学的性質は実施例１の
（４）で得たものと完全に一致した。

【００７１】実施例３ ６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルトペンタオースの製造 （１）６‐アジド‐６‐デオキシ‐α‐シクロデキスト
リンの製造 （ａ）６‐Ｏ‐トシル‐α‐シクロデキストリンの製造 市販のα‐シクロデキストリン［塩水港精糖（株）製］
１００ｇ（１０３ｍｍｏｌ）を出発原料に用いた以外は
実施例１（１）（ａ）と同様の操作を行い、６‐Ｏ‐ト
シル‐α‐シクロデキストリンを３４．２ｇ（３０．４
ｍｍｏｌ、収率３０％）を得た。

【００７２】 融点（℃）：１６０．０〜１６２．０（分解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４５０，２９３０，
１６４４，１６３２，１６００，１４２２，１３５８，
１３００，１１７６，１１５４，１０７８，１０３０

【００７３】核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐ
ｐｍ：（ＤＭＳＯ‐ｄ₆ ）２．４３（３Ｈ，ｓ），３．
２０〜４．４４（ｍ），４．７６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ），
４．８４（５Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝８．８Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ）

【００７４】高速液体クロマトグラフィー［東ソー
（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．
６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセト
ニトリル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／
ｍｉｎ］：ｔ_R＝４．８ｍｉｎ

【００７５】（ｂ）６‐アジド‐６‐デオキシ‐α‐シ
クロデキストリンの製造 （ａ）で得られた６‐Ｏ‐トシル‐α‐シクロデキスト
リン３４．２ｇ（３０．４ｍｍｏｌ）を出発原料に用い
た以外は実施例１（１）（ｂ）と同様の操作を行い、６
‐アジド‐６‐デオキシ‐α‐シクロデキストリン２
７．８ｇ（２７．８ｍｍｏｌ、収率９２％）を得た。

【００７６】 融点（℃）：２１６．０〜２１７．０（分解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３９０，２９３０，
２１２０，１６４４，１４１６，１３６８，１３４２，
１３０４，１１５８，１０８２，１０３２ 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５
０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝
３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R
＝５．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．４００，Ｈ₂Ｏ）；＋１２
９° 元素分析値：Ｃ₃₆Ｈ₆₅Ｎ₃Ｏ₂₉として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４３．３３ ５．９６ ４．２１ 実測値（％） ４３．１３ ５．８８ ４．１２

【００７７】（２）６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルト
ペンタオースの製造 （１）で得た６‐アジド‐６‐デオキシ‐α‐シクロデ
キストリン５．０ｇ（５．０２ｍｍｏｌ）を出発原料に
用いた以外は実施例１（３）及び（４）と同様の操作を
行い、６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐マルトペンタオー
ス１．０４ｇ（１．２２ｍｍｏｌ、２工程通算収率２４
％）を得た。このものの理化学的性質は、実施例１の
（４）で得たものと完全に一致した。

【００７８】比較例 本発明方法と公知の方法との収率の比較を行った。その
結果を比較例として以下に示す。 （１）本発明方法 実施例（１）と同様にして得た６‐アジド‐６‐デオキ
シ‐β‐シクロデキストリン５．０ｇ（４．３１ｍｍｏ
ｌ）を出発物質とし、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー
の代わりに活性炭処理（活性炭に吸着されない未反応の
グルコースの除去）を行った以外は実施例１（３）と同
様に操作し、次いで実施例１（４）と同様にして６⁵‐
アジド‐６⁵‐デオキシマルトペンタオース１．４１ｇ
（１．６５ｍｍｏｌ）を得た。このときの収率は３８％
であった。

【００７９】（２）公知の方法１［６‐アジド‐６‐デ
オキシ‐β‐シクロデキストリンにＣＤａｓｅを作用さ
せたのち、エキソ型糖化酵素類を作用させる方法（特開
平５−２６２７８４号公報）］ 実施例（１）と同様にして得た６‐アジド‐６‐デオキ
シ‐β‐シクロデキストリン５ｇ（４．３１ｍｍｏｌ）
を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．８）１．０リット
ルに溶解し、実施例１（２）と同様にして得たＣＤａｓ
ｅ４９０単位を加え、４０℃で２時間かきまぜながら反
応させた。次いでＯＤＳカラムクロマトグラフィーによ
る精製を行わなかった以外は実施例１（３）と同様の操
作を行って濃縮乾固物［６^r‐アジド化マルトヘプタオ
ース（ｒ＝１〜７の整数）を含有］を得、続いてこれを
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５０ｍｌに溶解
し、グルコアミラーゼ［東洋紡績（株）製］２５００単
位を加え、４０℃で４０時間かきまぜながら反応させ
た。反応終了後、反応液を９０℃で１５分間かきまぜな
がら加熱し、これを室温まで冷却後、メンブランフィル
ター（０．４５μｍ）でろ過を行い、得られたろ液をＯ
ＤＳカラムクロマトグラフィーに供して精製し、アセト
ニトリル‐水混液（容量比０％→５％グラジェント）で
溶出し、１．５％アセトニトリルの溶出画分を凍結乾燥
して６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルトペンタオース
０．４８ｇ（０．５６３ｍｍｏｌ）を得た。このときの
２工程通算収率は１３％であった。

【００８０】（３）公知の方法２［６‐アジド‐６‐デ
オキシ‐β‐シクロデキストリンに、マルトースの存在
下でＣＧＴａｓｅを作用させたのち、エキソ型糖化酵素
類を作用させる方法（特開昭６３−１７０３９３号公
報）］ 実施例（１）と同様にして得た６‐アジド‐６‐デオキ
シ‐β‐シクロデキストリン５１９ｍｇ（０．４４８ｍ
ｍｏｌ）を出発物質とした以外は実施例１（４）と同様
の操作を行い、６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシマルトペン
タオース１０７ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）を得た。こ
のときの収率は２８％であった。前記（１）〜（３）の
収率の比較から、本発明方法が顕著に優れていることが
分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 出発物質として６‐アジド‐６‐デオキシ‐
β‐シクロデキストリンを用いた本発明製造方法の説明
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−262784（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−170393（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のｎは５又は６である）で表わされる６‐アジド
   化シクロデキストリンに、グルコースの存在下、（イ）
   シクロデキストリンを開裂し、シクロデキストリンのグ
   ルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成させる
   作用及び（ロ）シクロデキストリンに対する水解速度又
   は親和性が多糖類あるいはシクロデキストリンと同じ重
   合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有するシ
   クロデキストリナーゼを作用させて、一般式 【化２】 （式中のｎは前記と同じ意味をもち、ｍはｎが５のとき
   ３〜６の整数、ｎが６のとき３〜７の整数である）で表
   わされる６‐アジド化マルトオリゴ糖を生成させ、次い
   で、マルトースの存在下でシクロデキストリングルカノ
   トランスフェラーゼ及びエキソ型糖化酵素類を任意の順
   序で作用させることを特徴とする、式 【化３】 で表わされる非還元末端６‐アジド化マルトペンタオー
   スの製造方法。
2. 【請求項２】 ６‐アジド化シクロデキストリンが、α
   ‐シクロデキストリン又はβ‐シクロデキストリンから
   得られたものである請求項１記載の製造方法。