KR101658198B1

KR101658198B1 - 말토오스 결합 단백질을 융합시킨 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제를 이용한 지소화성 전분 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101658198B1
Application number: KR1020140192995A
Authority: KR
Inventors: 박종태; 김정은; 유민지; 정다한
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2016-09-20
Also published as: KR20160080579A

Abstract

본 발명은 말토오스 결합 단백질 코딩 유전자와 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 유래된 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환된 대장균으로부터 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소를 분리 및 정제하는 단계; 및 상기 정제된 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소와 전분을 반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 지소화성 전분을 이용하여 제조된 식품을 제공한다.

Description

말토오스 결합 단백질을 융합시킨 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제를 이용한 지소화성 전분 제조방법 및 이의 용도{Synthesis of slowly digestible starch by maltose-binding-protein fused 4,6-alpha-glucanotransferase and the uses thereof}

본 발명은 말토오스 결합 단백질을 융합시킨 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제를 이용한 지소화성 전분 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 말토오스 결합 단백질 코딩 유전자와 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 유래된 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환된 대장균으로부터 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소를 분리 및 정제하는 단계; 및 상기 정제된 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소와 전분을 반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 지소화성 전분을 이용하여 제조된 식품에 관한 것이다.

전분은 곡류, 서류 등의 식물체에 들어있는 저장 다당류로 인간의 주요 탄수화물 공급원이다. 전분은 노화 정도, 전분 중합도, 아밀로오스와 아밀로펙틴의 비율 등의 요인들에 의해 사람의 소장 내 분해도가 결정되는데, 빠르게 소화되는 전분(rapidly digestible starch, RDS), 지소화성 전분(slowly digestible starch, SDS), 난소화성 전분(resistant starch, RS)으로 나누어질 수 있다. 지소화성 전분은 소장에서 완전히 소화되지만 소화 속도가 느린 전분이고, 난소화성 전분은 소장에서 소화되지 않고 대장에서 미생물에 의해 발효되는 전분이다. 지소화성 전분과 난소화성 전분의 생리학적 이점에 대해서는 많은 연구가 이루어져 왔는데, 지소화성 전분은 식후 혈당 수치를 천천히 증가시키는 건강증진 효과를 발휘하고, 난소화성 전분은 대장암, 고혈당, 고콜레스테롤 혈증을 예방하고, 지방의 축적을 저해하는 효과를 발휘한다.

한편, 혈당 수치를 빠르게 증가시키는 식품은 인슐린이 과량 분비되고 반복되면 췌장의 과부하로 인슐린이 분비되어도 그 역할을 제대로 하지 못하는 '인슐린 저항성'을 유발하는데, 혈당 수치를 천천히 증가시키는 지소화성 전분은 비만이나 당뇨병 환자들의 식이에 효과적으로 이용될 수 있다. 전분의 지소화성, 난소화성 함량을 높이기 위해서는 통상 물리적 처리, 화학적 처리 및 효소적 처리를 단독 또는 병행하여 사용한다. 이 중 효소적 처리는 환경친화적이며, 소비자들에게 안전하고 건강지향적인 처리이다. 또한 특이적인 반응만을 수행하기 때문에 우리가 원하는 반응만을 유도할 수도 있고, 수율이 높으며 반응의 부산물이 적고, 처리 후 사용을 위한 정제가 용이하다는 장점이 있다. 따라서, 효소적 반응을 이용하여 전분의 지소화도를 높일 수 있는 기술 개발이 요구된다 할 것인데 종래에 이와 같은 기술의 개발은 미미하였다.

한편, 한국등록특허 제1216058호에서는 '지소화성 및 난소화성이 증진된 전분의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1400966호에서는 '수열처리에 의해 물마로부터 지소화성 전분을 제조하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 말토오스 결합 단백질을 융합시킨 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제를 이용한 지소화성 전분 제조방법 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 락토바실러스 루테리에서 유래된 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질을 말토오스 결합 단백질(MBP, maltose binding protein)과 같은 융합 파트너 단백질을 도입하여 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제의 발현 및 분리정제 효율을 높이고, 정제 과정에서 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제의 효소 안정성을 더욱 향상시키는 것을 확인하였으며, 대장균에서 대량발현하고, 분리정제하여 옥수수 전분에 처리한 결과, 지소화성 전분이 제조되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

말토오스 결합 단백질 코딩 유전자와 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 유래된 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

상기 제조된 재조합 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계;

상기 형질전환된 대장균으로부터 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소를 분리 및 정제하는 단계; 및

상기 정제된 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소와 전분을 반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 지소화성 전분을 이용하여 제조된 식품을 제공한다.

본 발명에서는 락토바실러스 루테리에서 유래된 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질을 말토오스 결합 단백질(MBP, maltose binding protein)과 같은 융합 파트너 단백질을 도입하여 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제의 발현 및 분리정제 효율을 높이고, 정제 과정에서 4,6-알파-글루카노트랜스퍼라제의 효소 안정성을 더욱 향상시키는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소를 처리하여 제조된 지소화성 전분은 당류의 체내 소화가 매우 느리게 진행되어 식후의 혈당 수치 증가가 천천히 완만하게 이루어지도록 하여 당뇨병 환자의 혈당이 급격하게 높아지는 고혈당 증상을 방지함과 동시에, 당을 천천히 그러나 지속적으로 적절하게 공급해 주어 당뇨병 환자에게 치명적인 저혈당 또한 방지해 줄 수 있으므로, 본 발명은 식품 업계에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 4,6αGT 단백질 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. (M은 단백질 크기 마커이며, 1은 가용성 분획, 2는 불용성 분획)
도 2는 본 발명의 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein) 융합의 4,6αGT 단백질 발현 및 정제도를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. (M은 단백질 크기 마커이며, 1은 불용성 분획, 2는 가용성 분획, 3은 친화성 크로마토그래피의 비결합 분획, 4는 세척 분획, 5는 용출 분획)
도 3은 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT 단백질의 기질 특이성을 TLC(thin layer chromatography)로 분석한 결과를 나타낸다. (STD는 G1~G7 혼합물, isoG2는 이소말토스, isoG3는 이소말토트리오즈, pan은 파노스, Nige는 니게로스, CD STD는 α-, β-, γ-사이클로덱스트린 혼합물이며 이들을 표준물질로 사용하였다. G1은 글루코스, G2는 말토스, G3는 말토트리오스, G4는 말토테트라오스, G5는 말토펜타오스, G6는 말토헥사오스, G7은 말토햅타오스, α-CD는 α-사이클로덱스트린, β-CD는 β-사이클로덱스트린, γ-CD는 γ-사이클로덱스트린이며 이들을 기질로 하여 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT와 반응시킨 반응물이다. AL는 아밀로스, AP는 아밀로펙틴, S.S는 가용성 전분, MD는 말토덱스트린이며, 이들은 4,6αGT와의 반응 전 기질을 (-)로, 반응물을 (+)로 표기하였다.)
도 4는 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT와 말토덱스트린(maltodextrin)을 반응시킨 후 반응물을 HPAEC(high-performance anion-exchange chromatography)로 분석한 결과이다.(적색선; G1-G7 기준, 오렌지색선; 말토덱스트린 대조구, 황색선 및 녹색선; 반응 산물)
도 5는 옥수수 전분에 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT를 처리하여 생성된 변형 전분을 대상으로 ¹H-NMR 분석을 수행한 결과이다. (A; 옥수수 전분, B; 변형 전분)
도 6은 옥수수 전분에 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT를 처리하여 생성된 변형 전분과 일반 옥수수 전분을 HPA(human pancreatic α-amylase)를 이용해 소화속도를 측정하여 비교한 결과이다.
도 7은 옥수수 전분에 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT를 처리하여 생성된 변형 전분과 일반 옥수수 전분을 PPA(porcine pancreatic α-amylase)를 이용해 소화속도를 측정하여 비교한 결과이다.
도 8은 옥수수 전분에 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT를 처리하여 생성된 변형 전분과 일반 옥수수 전분을 AMG(amyloglucosidase)를 이용해 소화속도를 측정하여 비교한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

상기 제조된 재조합 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계;

일반적으로, 알파-글루카노트랜스퍼라제는 공여분자의 비환원성 말단으로부터 수여분자의 비환원성 말단에 글루코오스 단위로 전이하는 효소로서 전분 중 아밀로오스와 아밀로펙틴의 긴 가지들을 가수분해하고, 동시에 가수분해된 저분자의 글루칸을 α-1,4, α-1,6 결합으로 당전이하여 아밀로펙틴 가지들을 재구성시키는 효소이다.

본 발명의 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제는 (1→4)-α-D-글루코-올리고사카라이드를 연속의 (α1→6) 글루코시드 결합을 가지는 선형의 α-글루칸으로 변형시켜 (1→4)-α-D-글루코-올리고사카라이드를 생성한다. 상기 효소는 (1→4)-α-D-글루코-올리고사카라이드의 비환원성 글루코오스 성분을 절단하고, 이 글루코오스 성분을 다른 (α1→4)-글루칸 체인의 비환원성 말단에 (α1→6) 결합으로 붙인다. 이러한 효소 반응을 반복하여 연속의 (α1→6) 결합을 가지는 α-글루칸을 생성한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 말토오스 결합 단백질 및 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 전분은 찹쌀 전분, 멥쌀 전분, 찰옥수수 전분, 옥수수 전분, 찰감자 전분 또는 감자 전분일 수 있고, 바람직하게는 옥수수 전분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 반응 온도는 37℃이고, 반응의 pH는 4.7인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식품은 본 발명에서 제조된 지소화성 전분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 지소화성 전분을 이용하여 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품을 제조할 수 있다. 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품은 영양 기능 외에도 생리활성 성분을 포함하여 생체조절 기능을 제공하는 식품을 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

대장균에서 신규 효소인 4,6α GT (4,6-α- glucanotransferase ) 단백질의 발현

락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 유래된 4,6αGT(4,6-α-glucanotransferase) 코딩 유전자를 대장균(Escherichia coli) 발현용 pET29 벡터의 제한효소 Nde Ⅰ및 Xho Ⅰ자리에 서브클로닝(sub-cloning)하였다. 대장균을 숙주로 하여 LB 배지를 사용하여 37℃에서 O.D.값이 0.6~0.8일 때까지 배양한 후 IPTG를 0.1mM로 넣고, 30℃에서 6시간 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하여 파쇄한 후 원심분리하여 상층액(가용성 분획)만 얻어 단백질을 추출하였다.

MBP ( maltose binding protein )를 이용한 발현 및 정제 개선

4,6αGT 단백질 크기는 101kD이며, 발현 결과 대부분 불용성 분획(insoluble fraction)에 발현이 되어 가용성 분획(soluble fraction)에 발현이 증가되도록 하기 위한 개선이 필요하였다. 이를 위해, MBP(maltose binding protein)를 발현하는 malE 유전자를 이용하여 가용성 분획에 발현되도록 하고, 아밀로스 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 정제법을 사용해 정제도를 개선하였다. MBP를 발현하는 malE 유전자를 가진 pMAL_TEV_XhoⅠ 벡터에서 Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소 자리에 락토바실러스 루테리에서 유래한 4,6αGT 유전자를 서브클로닝하였다. 대장균을 숙주로 하여 LB 배지를 사용하여 37℃에서 O.D.값이 0.6~0.8까지 배양한 후 IPTG를 0.1mM로 넣고, 30℃에서 6시간 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하여 파쇄한 후 원심분리하여 상층액만 얻어 MBP와 융합된 단백질을 추출하였다. 정제는 아밀로즈 레진(amylose resin)을 사용하여 만든 컬럼을 사용하여, MBP와 아밀로즈 간의 친화성을 이용하여 정제하였다. 아밀로즈 레진 1 ml을 컬럼에 넣고 50 mM Tris (pH 7.5) 버퍼 5 ml을 로딩해 안정화를 시켜준 후 샘플 5 ml을 로딩하고, 다시 50 mM Tris (pH 7.5) 버퍼를 5 ml 로딩해 세척해 주고, 50 mM Tris에 10 mM 말토스가 들어있는 용출용 버퍼를 5 ml 로딩해 아밀로즈 레진에 붙어있는 융합 단백질을 용출시켰다. 단백질의 크기는 142kD이며, 가용성 분획에 발현되었고, 이를 아밀로스 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과 순도가 증가하였다(도 1 및 도 2).

실시예 1. 분리 정제한 말토오스 결합 단백질 융합 4,6α GT (4,6-α- glucanotransferase ) 단백질의 기질 특이성 분석

말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT의 기질 특이성을 보기 위해 다양한 기질을 사용하여 반응시키고, 반응물을 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)로 분석하였다(도 3). 이소폼(α-1,6 결합)을 가지는 이소말토스(isomaltose), 이소말토트리오즈(isomaltotriose), 파노스(panose), 니게로스(nigerose)와 α-1,4 결합만으로 이루어진 선형 표준물질들을 사용하여 분석한 결과, 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT는 이소폼 표준물질들과 일치하면서, 선형(linear) 표준물질과 일치하지 않는 점(spot)들을 나타내었고, 이를 통해 다양한 이소말토덱스트린(isomaltodextrin)이 생성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 사용할 수 있는 가장 작은 기질은 말토스(maltose)임이 확인되었다.

실시예 2. 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6α GT 를 이용한 HPAEC 분석 결과

말토덱스트린(maltodextrin)을 정제된 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT와 반응시킨 후 반응물을 HPAEC(high-performance anion-exchange chromatography)로 분석하였다(도 4). 대조구인 말토덱스트린은 α-1,4 결합만 가지는 것으로 대조구에선 나타나지 않는 피크들이 반응 산물에서는 나타나는 것으로 보아 α-1,6 결합을 가지는 다양한 이소말토덱스트린이 생성됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 옥수수 전분을 기질로 본 발명의 말토오스 결합 단백질 융합 4,6α GT 를 이용한 지소화성 전분 생산

1 mg/ml 옥수수 전분을 기질로 하여 반응 최적 조건인 pH 4.7, 37℃에서 정제된 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT와 반응시켰다. 합성된 변형 전분을 에탄올로 침전시켜 얻은 펠렛을 건조한 후 증류수에 녹여 다음 실험을 진행하였다.

생성된 변형 전분을 충남대학교 공동실험실습관에 ¹H-NMR 분석을 수행한 결과이다(도 5). α-1,6 결합을 나타내는 5.0 ppm을 1로 기준을 잡고 α-1,4 결합을 나타내는 5.4 ppm의 농도를 계산한 결과 아래 표에 나타낸 것처럼, 본 발명의 4,6αGT 효소를 이용해 생성된 변형 전분의 α-1,6 결합의 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

	Ratio of α-1,4 to α-1,6-linkages
옥수수 전분	9.62
변형 전분	6.27

이를 통해 생성된 변형 전분이 지소화성 전분임을 확인하기 위해 소화속도 비교 실험을 진행하였다. 말토오스 결합 단백질 융합 4,6αGT로 생성한 전분과 일반 옥수수 전분을 HPA(human pancreatic α-amylase), PPA(porcine pancreatic α-amylase), AMG(amyloglucosidase)를 이용해 소화속도를 측정하여 비교하였다(도 6, 도 7 및 도 8). 각 효소들은 α-1,4 결합만을 분해할 수 있고, 앞의 ¹H-NMR 분석 결과 변형 전분은 효소반응 후 α-1,6 결합이 증가하므로 소화효소에 의한 소화속도가 감소함은 합성된 변형 전분이 목표하는 지소화성 전분임을 의미한다. 그래프의 기울기가 시간별 효소에 의해 환원당들이 생성되는 속도를 의미하는데 이는 각 소화효소에 의한 기질들의 소화속도를 의미하며, 일반 옥수수 전분에 비해 생성된 변형전분의 분해 속도가 2배 정도 감소하여 생성된 전분이 지소화성 전분임이 확인되었다.

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Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr 355 360 365 <210> 2 <211> 904 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <400> 2 Met Gly Ile Asp Gly Lys Asn Tyr His Phe Ala Ser Asn Gly Gln Leu 1 5 10 15 Leu Gly Asn Leu Tyr Gly Lys Ile Val Asp Gly Lys Phe Asn Ile Tyr 20 25 30 Asp Ser Leu Ser Asn Lys Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Gly Asp Trp 35 40 45 Glu Asn Met Ala Tyr Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ile Asn Asn Thr Asp 50 55 60 Gly Tyr Leu Ser Tyr Ser Gly Trp Tyr Arg Pro Tyr Gly Thr Ser Gln 65 70 75 80 Asp Gly Lys Thr Trp Tyr Lys Thr Thr Ala Ser Asp Trp Arg Pro Leu 85 90 95 Leu Met Tyr Thr Trp Pro Ser Lys Asp Val Glu Ala Lys Phe Ile Lys 100 105 110 Tyr Phe Val Asp Asn Gly Tyr Thr Asn Thr Asp Tyr Gly Leu Thr Lys 115 120 125 Asp Asn Val Thr Asn Leu Ser Gln Asp Thr Asp Thr Gln Thr Leu Asn 130 135 140 Lys Tyr Ala Arg Asn Leu Arg Phe Val Ile Glu Lys Ser Ile Ala Ala 145 150 155 160 Asn Lys Ser Thr Gly Pro Leu Ala Asn Asp Ile Asn Lys Phe Met Leu 165 170 175 Thr Ile Pro Glu Leu Ser Ala Lys Ser Glu Leu Pro Val Glu Tyr Ser 180 185 190 Asn Gly Tyr Val Pro Asp Val Ser Gly Ser Ile Asp Asn Asn Gln Leu 195 200 205 Ile Phe Ile Asn Asn Asn Ser Asp Asn Gln Ala Lys Gly Asn Thr Ser 210 215 220 Tyr Ala Asp Ser Asn Tyr Arg Leu Met Asn Arg Thr Ile Asn Asn Gln 225 230 235 240 Thr Asn Asn Asp Asn Ser Asp Gln Ser Pro Glu Leu Leu Val Gly Asn 245 250 255 Asp Ile Asp Asn Ser Asn Pro Ala Val Gln Ala Glu Asn Phe Asn Trp 260 265 270 Glu Tyr Phe Leu Leu Asn Tyr Gly Lys Leu Met Lys Tyr Asn Ala Asp 275 280 285 Gly Asn Phe Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Ala Asp Asn Ile Asp Ala 290 295 300 Asp Val Leu Asp Gln Leu Gly Gln Leu Val Asn Asp Met Tyr His Thr 305 310 315 320 Lys Gly Asn Gln Glu Asn Ala Asn Asn His Leu Val Tyr Asn Glu Gly 325 330 335 Tyr His Ser Gly Ala Ala Arg Met Leu Asn Asp Lys Gly Asn Pro Glu 340 345 350 Leu Phe Met Asp Ala Gly Tyr Phe Tyr Thr Leu Glu Asn Val Leu Gly 355 360 365 Gln Ala Glu Asn Lys Arg Asp Asn Val Asn Asn Leu Ile Thr Asn Ser 370 375 380 Val Val Asn Arg Ala Asn Asp Ile Thr Glu Asn Thr Ala Thr Pro Asn 385 390 395 400 Trp Ser Phe Val Thr Asn His Asp Gln Arg Lys Asn Val Ile Asn Gln 405 410 415 Ile Ile Ile Asp Asn His Pro Asn Ile Pro Asp Ile Met Ala Asn Ser 420 425 430 Tyr Lys Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Ala Trp Asp Glu Phe Tyr Ala Asp 435 440 445 Gln Ala Lys Ala Asp Lys Lys Tyr Ala Gln Tyr Asn Leu Pro Ala Gln 450 455 460 Tyr Ala Leu Leu Leu Ser Asn Lys Asp Thr Val Pro Gln Val Tyr Tyr 465 470 475 480 Gly Asp Leu Tyr Lys Glu Thr Asp Gln Tyr Met Lys Thr Lys Ser Met 485 490 495 Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Leu Met Lys Ala Arg Gly Glu Phe Val 500 505 510 Asn Gly Gly Gln Thr Met Thr Lys Val Asn Asp Asn Leu Ile Thr Ser 515 520 525 Val Arg Tyr Gly Lys Gly Val Val Asp Val Ser Ser Asn Gly Thr Asp 530 535 540 Pro Leu Ser Arg Thr Thr Gly Met Ala Val Ile Val Gly Asn Asn Pro 545 550 555 560 Ser Met Ser Glu Gln Val Val Ala Ile Asn Met Gly Leu Ala His Ala 565 570 575 Asn Glu Gln Tyr Arg Asn Leu Ile Asp Ser Thr Ala Asp Gly Leu Thr 580 585 590 Tyr Asn Ser Asn Gly Ser Val Asn Pro Ser Val Leu Thr Thr Asp Ser 595 600 605 Lys Gly Ile Leu Arg Val Thr Val Lys Gly Tyr Ser Asn Pro Tyr Val 610 615 620 Ser Gly Tyr Leu Ser Val Trp Val Pro Leu Ile Asn Gly Thr Gln Asn 625 630 635 640 Ala Arg Thr Ser Ala Gln Glu Val Arg Asn Val Pro Gly Lys Val Phe 645 650 655 Thr Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser His Met Ile Tyr Glu Asp Phe Ser 660 665 670 Leu Phe Gln Pro Glu Pro Thr Thr Val Asn Glu His Ala Tyr Asn Val 675 680 685 Ile Lys Asp Asn Val Ala Leu Phe Asn Gln Leu Gly Ile Thr Asp Phe 690 695 700 Trp Met Ala Pro Ser Tyr Thr Pro Phe Asn Thr Ser Arg Tyr Asn Glu 705 710 715 720 Gly Tyr Ala Met Thr Asp Arg Tyr Asn Leu Gly Thr Ala Asp Asn Pro 725 730 735 Thr Lys Tyr Gly Asn Gly Glu Glu Leu Ser Asn Ala Ile Ala Ala Leu 740 745 750 His Gln Ala Gly Leu Lys Val Gln Glu Asp Leu Val Met Asn Gln Met 755 760 765 Ile Gly Phe Ser Thr Gln Glu Ala Val Thr Val Thr Arg Val Asp Arg 770 775 780 Asp Ala Lys Gln Leu Ser Val Asp Gly Gln Thr Phe Ala Asp Gln Ile 785 790 795 800 Tyr Phe Gly Tyr Thr Arg Gly Gly Gly Gln Gly Gln Gln Asp Tyr Gly 805 810 815 Gly Lys Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Gln Lys Tyr Pro Asp Leu Phe Thr 820 825 830 Thr Lys Ala Ala Ser Thr Gly Val Ala Pro Asp Pro Asn Thr Arg Ile 835 840 845 Thr Glu Trp Ser Ala Lys Tyr Glu Asn Gly Thr Ser Leu Gln Asn Val 850 855 860 Gly Ile Gly Leu Ala Val Lys Met Pro Asn Gly Tyr Tyr Ala Tyr Leu 865 870 875 880 Asn Asp Gly Asn Asn Lys Ala Phe Ala Thr Thr Leu Pro Asp Ala Ile 885 890 895 Ser Ser Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn 900

Claims

말토오스 결합 단백질 코딩 유전자와 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 유래된 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
상기 제조된 재조합 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계;
상기 형질전환된 대장균으로부터 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소를 분리 및 정제하는 단계; 및
상기 정제된 말토오스 결합 단백질 융합 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제 효소와 전분을 반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 말토오스 결합 단백질 및 4,6-α-글루카노트랜스퍼라제(4,6αGT, 4,6-α-glucanotransferase) 단백질은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 전분은 찹쌀 전분, 멥쌀 전분, 찰옥수수 전분, 옥수수 전분, 찰감자 전분 또는 감자 전분인 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 반응 온도는 37℃이고, 반응의 pH는 4.7인 것을 특징으로 하는 지소화성 전분의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 지소화성 전분을 이용하여 제조된 식품.