KR100526957B1 - 말토오스결합단백질 융합단백질을 정제하기 위한 친화성크로마토그래피 담체 제조방법 - Google Patents
말토오스결합단백질 융합단백질을 정제하기 위한 친화성크로마토그래피 담체 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 정제하기 위해 사용하는 기존의 친화성 크로마토그래피 담체보다 말토오스결합단백질(MBP)에 대하여 친화성과 포획량이 우수하고, 리간드 고정화에 용이하며, 가격이 저렴한 장점을 지닌 담체에 관한 것으로, 표면 코팅 셀룰로오스 젤에 에폭시를 가질 수 있는 활성제를 첨가하여 활성화 시킨 후에, 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드인 글루코오스 환형 중합체인 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 또는 글루코오스 중합체인 트레할로오스(trehalose)를 고정함으로써 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 한 단계만으로 정제할 수 있는 친화성 크로마토그래피 담체를 제공한다. 본 발명 담체는 친화성 크로마토그래피용 충진제와 스핀키트, 미니컬럼 등의 응용에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 정제하기 위해 사용하는 기존의 친화성 크로마토그래피 담체보다 말토오스결합단백질(MBP)에 대하여 친화성과 포획량이 우수하고, 리간드 고정화에 용이하며, 가격이 저렴한 장점을 지닌 담체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 젤에 에폭시를 가질 수 있는 활성제를 첨가하여 활성화 시킨 후에, 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드인 글루코오스 환형 중합체인 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 또는 글루코오스 중합체인 트레할로오스(trehalose)를 고정화하여 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 한 단계로 정제할 수 있는 친화성 크로마토그래피 담체에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술을 바탕으로 한 근대의 생명공학은 인간에게 유용한 여러 이종단백질을 미생물로 하여금 대량생산하도록 하여 산업, 식품, 의약분야의 유용단백질을 값싸고 풍부하게 공급할 수 있는 기초를 마련하였다. 특히, 대장균의 경우 유전학적, 생리학적 기반 연구가 잘되어 있을 뿐만 아니라 유전자 조작기술, 배양기술 등이 매우 발달되어 있으며, 많은 클로닝 벡터와 돌연변이 균주를 이용할 수 있다는 점에서 이종 단백질 생산을 위한 재조합 숙주균으로 가장 많이 이용되고 있다.
현재 진보된 재조합 단백질 생산 기술에도 불구하고 단백질 연구가 유전자 연구보다 매우 느린 이유는 활성형 단백질의 발현 및 분리정제가 초고속으로 수행될 수 없기 때문이다. 즉 단백질 자체가 생합성 후의 변형이 매우 다양하여 일률적인 추출, 분리, 정제 방법이 적용되기 어려웠기 때문이다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 특정 리간드에 친화성을 갖는 매개체를 보유한 융합 협력자를 이용하여 재조합 단백질을 발현하면 재조합 단백질의 용해도를 크게 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 친화성을 이용하여 쉽게 정제할 수 있으므로 초고속 단백질 생산이 가능할 수 있다. 이러한 단백질 정제 방법은 면역친화성을 이용한 방법과 마찬가지로 융합단백질과 리간드 사이에 높은 결합 특이성을 가지므로 한단계 정제만으로 95% 이상의 고순도 정제가 가능하여 다양한 재조합 단백질 생산 및 정제에 활용할 수 있다.
현재까지 개발된 친화성 태그로는 기질과의 선택적 친화성을 이용한 글루타치온 에스-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase; GST) 등의 효소 태그, IgG와의 친화성을 이용한 프로틴 A, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein ; MBP)등의 단백질 태그, 금속친화성을 이용한 폴리히스티딘(polyhistidine) 태그, 소수성 결합을 이용한 폴리페닐알라닌(polyphenylalanine) 태그, 이온교환수지를 이용할 수 있는 폴리알라닌(polyalanine) 태그 등이 있다.
그러나, 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질의 분리정제를 위해 종래 사용되던 아가로스 겔에 아밀로오스, 말토헵타오스 등을 고정화하여 만든 크로마토그래피 담체는 낮은 단백질 포획량과 리간드의 낮은 용해도로 인한 고정화의 불편성과 높은 가격 등의 문제점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 단백질 포획량이 높고 고정화가 용이한 말토오스결합단백질 융합단백질 분리용 담체를 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과 젤에 에폭시를 가질 수 있는 활성제를 첨가하여 활성화 시킨 후, 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드인 글루코오스 환형 중합체인 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 또는 글루코오스 중합체인 트레할로오스(trehalose)를 고정함으로써 단백질에 대한 친화성과 포획량이 우수하고, 합성과정에서 중합체의 용해도가 높고, 가격이 저렴하여 말토오스결합단백질 융합단백질을 효율적으로 정제할 수 있는 담체를 개발하고 본 발명을 완성한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 친화성과 포획량이 우수하고 가격이 저렴한 말토오스결합단백질 융합단백질을 정제할 수 있는 담체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 담체를 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질의 분리 ·정제를 위한 친화성 크로마토그래피용 충진제, 스핀키트, 미니컬럼 등으로 이용함을 특징으로 하는 말토오스결합단백질(MBP) 융합 단백질 분리정제를 위한 담체의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 말토오스결합단백질 융합단백질을 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피 담체에 있어서, 상기 담체는 베타-사이클로텍스트린 또는 트레할로오스를 함유하고 있는 셀룰로오스 젤인 것을 특징으로 하는 말토오스결합단백질 융합단백질을 정제하기 위한 담체를 제공한다.
또한, 본 발명은 젤에 에폭시 작용기를 가지는 활성화제를 첨가하여 젤을 활성화시키는 단계; 말토오스 결합 단백질과 선택적으로 결합하는 리간드인 베타-사이클로덱스트린과 트레할로오스를 고정화하는 단계; 반응하지 않는 에폭시 작용기를 에폭시기 저지제로 저지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 말토오스결합단백질 융합단백질 정제용 담체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 정제하기 위해 사용하는 기존의 친화성 크로마토그래피 담체보다 말토오스결합단백질(MBP)에 대하여 친화성과 포획량이 우수하고, 리간드 고정화에 용이하며, 가격이 저렴한 장점을 지닌 담체를 제조하는 방법이다. 특히, 본 발명은 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드인 글루코오스 환형 중합체인 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 또는 글루코오스 중합체인 트레할로오스(trehalose)의 하드록시기가 활성화된 표면코팅 셀룰로오스 젤의 에폭시기와 염기성 용액 하에서 반응하여 고정화는 것과 리간드와 반응하지 않는 에폭시기를 저지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 젤은 크로마토그래피에 있어 담체로 사용되는 물질이면 어느 것을 사용하여도 무방하며, 바람직스럽게 셀룰로오스, 아가로스, 덱스트란, 키틴, 키토산, 키토산의 유도체, 합성고분자의 단량체 및 세라믹 물질로 중 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 좋다.
본원 발명의 반응에서 요구되는 알칼리 물질은 물에 용해되어진 용액 형태로 사용된다. 이론적으로는, 용액 상에서 알칼리 특성을 나타내는 어떠한 물질도 이 반응에서 사용될 수 있다. 수산화나트륨과 같은 알칼리 금속 산화물들이 주로 알칼리 물질로 사용된다. 사차암모늄 물질, 알칼리 금속/알칼리 토류 금속 탄산염과 알칼리 토류 산화물과 같은 물질 또한 사용된다.
한편, 셀룰로오스 젤 구형입자에 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드를 도입한다. 이러한 리간드의 구조는 2~10개의 알파 포도당(글루코오스)이 알파 1,4 또는 알파 1,1구조로 연결된 중합체 즉, 올리고삭카라이드(oligosaccharide), 환상 올리고삭카라이드(cyclic oligosaccharide) 등이 있다.
알파 1,4 구조 올리고삭카라이드(oligosaccharide)로는 말토트리오스(maltotriose),말토테트라오스(maltotetraose),말토펜타오스(maltopentaose), 말토헥사오스(maltohexaose), 말토헵타오스(maltoheptaose)등이 있고, 알파 1,1 구조 중합체로는 트레할로오스(trehalose) 등이 있다.
알파 1,4 구조 환상 올리고삭카라이드(cyclic oligosaccharide)로는 알파 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 감마 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 등이 있다.
셀룰로오스 젤 구형입자에 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드를 고정화하는 과정에서 중합체의 농도는 최종 말토오스결합단백질(MBP) 융합 단백질의 포획량을 결정짓기 때문에 중요하다. 고정화하는 과정 중에, 중합체의 낮은 농도는 높은 농도를 지니는 그것과 비교하면 낮은 말토오스결합단백질(MBP) 포획량을 야기한다. 중합체의 농도는 1~30퍼센트(무게비)정도가 가능하며, 4~15퍼센트의 범위에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있다.
한편, 셀룰로오스 젤 구형입자에 말토오스결합단백질(MBP)와 선택적으로 결합하는 리간드를 고정화하는 과정은 알칼리 용액상에서 이루어지므로 알칼리 용액의 농도와 반응온도, 시간 등에 대해 말토오스결합단백질(MBP) 융합 단백질의 포획량이 의존한다고 할 수 있다.
알칼리 용액의 농도는 0.02~20퍼센트(무게비)정도가 가능하며, 0.2~2퍼센트의 범위에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있다. 또한, 가능한 반응온도는 상온에서 90℃ 정도이고, 30~50℃의 범위에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있다. 또한, 가능한 반응시간은 6~48시간 정도이고, 18~30시간의 범위에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있다.
셀룰로오스 젤 구형입자에 말토오스결합단백질(MBP)와 선택적으로 결합하는 리간드를 고정화하는 과정을 종결한 후, 반응하지 않는 에폭시기를 저지하는 단계를 해야만 한다. 왜냐하면, 단백질의 분리정제 과정에서 젤이 에폭시기의 활성을 가진 상태로 존재하면, 말토오스결합단백질(MBP) 융합 단백질뿐만 아니라 그 이외의 단백질과 결합할 수 있고, 결합 후에는 젤과 단백질을 분리하기가 불가능하기 때문이다.
상기의 에폭시기 저지제로 쓰이는 유기물은 에탄올아민 등이 있다. 에탄올아민은 물에 용해되어진 용액 형태로 사용된다. 에탄올아민 용액의 농도는 1~20퍼센트(무게비) 정도이고, 6~10퍼센트의 범위에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있다.
상기와 같이 본 발명에 의해 얻어진 젤은 기계적 강도, 친수성이 우수하고, 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질에 대하여 친화성과 포획량이 뛰어나며, 가격이 저렴하다는 장점이 있다.
또한, 말토오스결합단백질(MBP) 융합 단백질을 분리, 정제하는데 이용되는 친화성 크로마토그래피 등의 충진제, 스핀키트, 미니컬럼 용도로 매우 효과적이다. 이하, 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하겠지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업자에 의하여 기술적인 수치와 균등물의 변경에까지 미치는 것은 물론이다.
실시예 1 : 표면 코팅된 셀룰로오스 젤의 활성화
팽윤된 상태의 표면 코팅된 셀룰로오스 젤 1L를 감압장치로 반 건조하였다. 3상 패들형 날개의 교반기(3L)에 반 건조된 젤을 덜어내었다. 4N 수산화나트륨 용액 145ml에 소디움 보로하이드라이드 970mg을 용해하였다. 이 용액을 반 건조된 젤이 있는 반응기에 넣고, 교반기 설치를 완성하였다. 대류순환기를 이용하여 반응기의 온도를 20℃로 유지하였다. 250rpm으로 교반하면서, 활성화제인 에피클로로하이드린 25ml을 첨가하였다. 30분 후, 4N 수산화나트륨용액 57ml과 에피클로로하이드린 29ml을 첨가하였다. 그리고, 15분마다 에피클로로하이드린을 29m을 첨가하였다. 이것을 3회 반복하였다. 13~15시간 반응 후, 반응액을 용기에 옮겨 담고 증류수로 5회 이상 세척하였다. 세척된 젤은 4℃ 환경에서 보관하였다.
실시예 2 : 활성화제의 종류에 따른 젤의 단백질 포획량 양상
| 활성화제의 종류 | 젤 생성상태 |
| 에피클로로하이드린 | ++++ |
| 1,2-3,4 디 에폭시 부탄 | ++ |
| 비스-에폭시 프로필-에테르 | ++ |
| 에틸렌 글리콜-비스-에폭시 프로필 에테르 | ++ |
| 1,4-부탄 디올-비스-에폭시 프로필 에테르 | +++ |
상기 표 1에서 알 수 있듯이, 활성화제로 에피클로로하이드린을 사용했을 경우, 젤의 단백질 포획량이 가장 양호한 것으로 나타났다. 따라서 에피클로로하이드린을 사용할 경우에 젤의 활성화의 밀도가 가장 클 것이라 예상할 수 있었다.
실시예 3 : 표면 코팅된 셀룰로오스 젤에 말토오스결합단백질(MBP)와 선택적으로 결합하는 리간드의 고정화
실시예 2에서 합성되어진 젤 1L를 감압장치로 반건조하였다. 덮개가 있는 3L 용기에 반 건조된 젤을 덜어내었다. 0.1N 수산화나트륨 1L에 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 750mg을 용해하였다. 이 용액을 덮개가 있는 3L 용기에 넣고, 덮개로 밀봉하였다. 그리고 이것을 40℃, 120rpm으로 유지되는 교반기에 설치하고, 24시간 반응한 후, 반응액을 용기에 옮겨 담고 증류수로 5회 이상 세척하였다. 리간드가 고정화된 젤 1L를 감압장치로 반건조하였다. 덮개가 있는 3L 용기에 반 건조된 젤을 덜어내었다. 에탄올아민 60g을 증류수 1L에 용해하였다. 이것을 덮개가 있는 3L 용기에 넣고, 덮개로 밀봉하였다. 그리고 이것을 37℃, 120rpm으로 유지되는 교반기에 설치하고, 4시간 반응한 후, 반응액을 용기에 옮겨 담고 증류수로 5회 이상 세척하였다. 세척된 젤은 4℃ 환경에서 보관하였다.
실시예 4 : 리간드의 종류에 따른 젤의 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질 포획량 양상
| 리간드의 종류 | 젤 생성상태 |
| 말토트리오스(maltotriose) | ++ |
| 말토테트라오스(maltotetraose) | ++ |
| 말토펜타오스(maltopentaose) | ++ |
| 말토헥사오스(maltohexaose) | ++ |
| 말토헵타오스(heptaose) | ++ |
| 트레할로오스(trehalose) | ++++ |
| 알파 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) | ++++ |
| 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) | ++++ |
| 감마 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) | ++++ |
상기 표 2 에서 알 수 있듯이, 대부분의 중합체가 양호한 단백질 포획량을 나타냈다. 그 중에서 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)과 트레할로오스가 가장 경제적인 리간드이었다.
실시예 5 : 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질 정제를 위한 젤의 응용
실시예 3와 같은 방법으로 제조한 젤을 이용하여 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질의 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 실험을 실행하였다. 실험에 실시한 단백질은 말토오스결합단백질(MBP)을 모델 단백질로 사용하였다.
말토오스결합단백질(MBP)를 발현시키는 유전자를 삽입한 대장균을 LB 배지 10ml에 접종한 후 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 배양액을 250ml의 LB 배지에 2ml 접종한 후 OD600이 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. OD600이 0.6에 도달하면 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하였다. 37℃에서 5시간 더 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다.
회수한 균체를 초음파를 이용하여 파쇄한 후 원심분리로 상등액만 모아서 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질 정제를 위한 젤을 이용하여 정제를 실시하였다.
실험에 사용한 컬럼은 2.2 cm ID ×30 cm H의 규격이었으며, 이 컬럼에 30ml의 미소구를 팩킹하였다. 컬럼에 완충용액 A (20mM Tris, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol, pH 7.4)를 4 ml/min의 속도로 흘려주어 젤을 평형화시켰다. 자외선 검출기(UV@280nm)를 이용하여 자외선이 평형을 이루었을 때 상기와 같은 방법으로 준비한 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 포함한 세포파쇄액 50ml을 컬럼에 흘려주었다. 완충용액 A를 이용하여 자외선검출기의 신호가 0점에 도달할 때까지 컬럼을 씻어주었다. UV신호가 0점에 도달한 후 완충용액 B (완충용액 A + 10mM 말토오스)를 흘려주어 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 젤로부터 완전히 분리하였다. 도 2는 MBP 융합 단백질을 분획하는 크로마토그램이고, 도 3에 실험결과의 전기영동 사진을 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있듯이 세포 파쇄액에 존재하는 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질이 정제됨을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 결과 제조된 젤은 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질만을 효과적으로 분리할 수 있고, 단백질 외의 불순물로부터 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질의 분리 및 정제에 응용될 수 있다.
본 발명의 MBP 융합 단백질의 분리정제를 위한 젤은 기계적 강도, 친수성이 우수하고, 말토오스결합단백질(MBP)에 대하여 친화성과 포획량이 뛰어나며, 말토오스결합단백질(MBP)과 선택적으로 결합하는 리간드의 용해도와 가격이 기존에 사용되는 아밀로오스보다 우수하고 저렴하다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 말토오스결합단백질(MBP) 융합 단백질을 분리, 정제하는데 이용되는 친화성 크로마토그래피 등의 충진제로서 매우 효과적이며, 스핀키트, 미니컬럼 용도로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 펩티드에 대하여 친화성이 우수하고 고분자간의 강한 고유결합으로 인하여 비교적 강도가 강하고 합성고분자와는 달리 자연환경을 오염시키지 않는다고 하는 뛰어난 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 3 의 방법에 의해 제조한 말토오스결합단백질(MBP) 융합단백질을 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피 담체의 광학현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 5 의 방법에 의해 제조한 친화성 셀룰로오스 미소구를 이용하여 MBP을 분획하는 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5 의 방법의 실험결과 전기영동 사진이다.
Claims (5)
- 말토오스결합단백질 융합단백질을 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피 담체에 있어서,상기 담체는 베타-사이클로텍스트린 또는 트레할로오스의 하드록시기와 셀루로오스 젤 표면상에 노출된 에폭시기간의 결합에 의해 상기 젤에 고정된 베타-사이클로덱스트린 또는 트레할로오스를 함유하고, 반응하지 않는 에폭시기는 에탄올아민에 의해 저지되어 있는 것을 특징으로 하는 말토오스결합단백질 융합단백질 정제용 담체.
- 셀룰로오스 젤을 에폭시기를 가지는 활성화제인 에피클로로하이드린으로 처리하여 젤 표면에 에폭시기를 노출시키는 단계;말토오스결합단백질과 선택적으로 결합하는 리간드인 베타-사이클로덱스트린 또는 트레할로오스의 하드록시기와 상기 에폭시기를 반응시켜 리간드를 상기 젤에 고정시키는 단계;반응하지 않는 에폭시기를 에폭시기 저지제인 에탄올아민으로 저지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 말토오스결합단백질 융합단백질 정제용 담체의 제조방법.
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2003
- 2003-06-02 KR KR10-2003-0035363A patent/KR100526957B1/ko active IP Right Grant
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