CN105219756A - 一种l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用 - Google Patents

一种l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，为避免直接使用DHAP，大幅度降低了合成稀有糖的成本。其采用“一釜四酶法”的策略，利用来源于嗜热菌Thermotoga？maritima？MSB8的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶进行了D-阿洛酮糖、D-山梨糖、L-果糖和L-塔格糖等一系列稀有糖的合成，实验证明该醛缩酶具有很好热稳定性，并且在以D-甘油醛为受体时，能够以很高的选择性来合成具有重要应用价值的D-阿洛酮糖。

Description

一种L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用。
背景技术
稀有糖定义为自然界中存在但含量非常低的单糖及其衍生物。稀有糖一般具有类似于蔗糖的甜度，但几乎不产生或产生较少的热量。稀有糖在食品、医药、保健等领域应用前景广泛。以D-阿洛酮糖(D-psicose)为例进行说明，D-阿洛酮糖是自然界中含量非常低的六碳糖，是D-果糖C-3位点的差向异构体。D-阿洛酮糖很难被消化吸收，几乎不为生命活动提供能量，因此是一种非常有用的低卡路里的甜味剂。
在食品应用领域，D-阿洛酮糖具有甜度高、溶解性好、低卡路里和低血糖反应等优点，被认为是最理想的蔗糖替代品之一。在食品中添加D-阿洛酮糖，不仅能提高它的胶凝度，还可以与食品蛋白发生美拉德反应改善其风味。相对于D-果糖和D-葡萄糖，D-阿洛酮糖可以生成更多的抗氧化美拉德反应产物，维持食品更长时间的抗氧化水平。2011年，D-阿洛酮糖被FDA认证安全，可在食品和膳食领域作为添加剂使用。在医药健康领域，D-阿洛酮糖可以抑制脂肪肝酶和肠道α-糖苷酶，从而降低体内脂肪的积累和抑制血糖浓度的上升。在膳食中添加D-阿洛酮糖可以降低餐后血糖反应，提高胰岛素的敏感性和葡萄糖耐受性。另外，相对其他稀有糖，D-阿洛酮糖能更加有效地清除活性氧自由基。在小鼠试验中，发现D-阿洛酮糖可以通过抑制活性氧的产生来阻止双-(2-乙基己基)-邻苯二甲酸诱发的对睾丸的伤害。此外D-阿洛酮糖对6-羟基多巴胺诱导的细胞凋亡有神经保护的作用，同时还能抑制高浓度葡萄糖诱导下的单核细胞趋化蛋白MCP-1的表达。这就预示着D-阿洛酮糖具有治疗神经组织退化和动脉粥样硬化等相关疾病的潜在功能。当前主要是用D-塔格糖-3-差向异构酶家族酶类用来催化D-果糖的差向异构来生成D-阿洛酮糖。由于D-果糖和D-阿洛酮糖的相互转化是一个平衡的过程，以较高的收率大量生产D-阿洛酮糖依然面临着挑战。当前，大多数稀有糖的合成路线仍然有限，且常常以相对比较昂贵的化合物作为底物，导致稀有糖的合成成本依然很高。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有稀有糖合成中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶来源于嗜热菌ThermotogamaritimaMSB8，其基因序列表如SP9所示。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在大肠杆菌重组菌中进行表达和纯化。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述大肠杆菌重组菌的重组方法为，将如SEQIDNo1所示的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因片段连接到pET-43.1a载体上，并将该重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到大肠杆菌重组菌。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述表达和纯化，包括，培养大肠杆菌重组菌至OD600＝0.8-1.0，添加终浓度为0.1-1.0mMIPTG，在15-37℃，120～220rpm条件下诱导4～16h；用含有10-20mM咪唑的缓冲液洗脱杂蛋白，用含有300-500mM咪唑的缓冲液洗脱纯酶。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述合成，包括，向反应体系中加入底物DL-3-磷酸甘油、醛受体、磷酸甘油氧化酶、过氧化氢酶、L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，在氧气存在的环境下，25-35℃反应12-20h后，调节pH为4.0-5.0，加入酸性磷酸酶，35-39℃反应12-20h。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述醛受体为D-甘油醛、L-甘油醛或甘油醛的衍生物。
作为本发明所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用的一种优选方案，其中：所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶为带标签的融合蛋白或不带标签的蛋白。
本发明为避免直接使用磷酸二羟基丙酮(DHAP)，大幅度降低合成稀有糖的成本，采用“一釜四酶法”的策略，利用来源于嗜热菌ThermotogamaritimaMSB8的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶进行了D-阿洛酮糖、D-山梨糖、L-果糖和L-塔格糖等一系列稀有糖的合成，实验证明该醛缩酶具有很好热稳定性，并且在以D-甘油醛为受体时，能够以很高的选择性来合成具有重要应用价值的D-阿洛酮糖。
附图说明
图1为温度对于RhaD醛缩酶的影响示意图。
图2为稀有糖合成的HPLC检测图，A为以D-甘油醛为受体，B为以L-甘油醛为受体。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD醛缩酶)由TM1072基因编码，将基因序列优化后进行人工合成的TM1072基因片段，插入到表达质粒pET-43.1a得到重组表达质粒ET-43.1a-TM1072。pET-43.1a-TM1072质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)用来表达RhaD醛缩酶。挑取含有重组质粒的单克隆接种到50mLLB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm，过夜培养。吸取20mL培养液转接到1LLB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm振荡培养。当OD600为0.8～1.0时，加入IPTG(终浓度为0.1mM)，16℃诱导20h后，停止培养，离心，弃去上清，得到菌体(4000g，30min，4℃)。菌体超声波破碎，破碎条件：80W功率，破碎2s，间隔2s，破碎液高速离心(16000g，30min，4℃)，得到的上清液用来纯化目的蛋白。首先用平衡缓冲液50mMTris-HCl(pH7.5)对Ni2+亲和层析柱进行平衡后上样，上样完毕后，用洗涤缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.5)，100mMNaCl，10mM咪唑)洗掉以较小吸附力结合在柱子上的杂蛋白；最后用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.5)，100mMNaCl，500mM咪唑)洗脱目的蛋白并收集，洗脱液用超滤管进行浓缩和脱盐。为了切除Nus-RhaD融合蛋白的Nus标签，用凝血酶进行处理，反应体系为120μLNus-RhaD蛋白(18mg/mL)，2μL凝血酶(1U/μL)，补ddH2O至1mL，37℃反应30min后，反应液进行离心(15000g，10min，4℃)上清液用Ni2+-NTA柱纯化，由于Nus-RhaD融合蛋白的Nus标签和His标签均位于凝血酶作用位点的N端，不含有Nus标签的RhaD酶能够很容易地从镍柱上洗脱下来，并用超滤管进行浓缩和脱盐。
温度对RhaD醛缩酶的影响
为了测定温度对RhaD醛缩酶的影响，反应体系如下：2.5μLDHAP(0.2M)，1.5μLD-甘油醛(0.5M)，19.5μLddH2O。加入RhaD(6.2mg/mL，1.5μL)在10～70℃反应20min后加入5μL6NHCl终止反应，12000rpm离心10min使反应液澄清，用2NNaOH调节pH至5后加入0.1μL酸性磷酸酶在37℃反应12h。反应液pH用1NNaOH调节为pH7.0。RhaD的酶活根据HPLC测得产生的稀有糖的量来测定。相对酶活定义为RhaD的酶活相对于最大酶活的百分比。
如图1所示，为了研究温度对于RhaD醛缩酶的影响，以DHAP和D-甘油醛作为底物，在不同温度下，以不带有Nus标签的RhaD醛缩酶作为催化剂，进行反应，酶活用HPLC进行测定。结果显示：RhaD醛缩酶在40～60℃显示了相对较高的酶活，其中50℃是该酶的反应最适温度。RhaD在70℃酶活的迅速下降原因是DHAP在该温度下不稳定。
RhaD的立体选择性分析
RhaD醛缩酶催化的反应底物为两个：第一个为DHAP(磷酸二羟基丙酮)，第二个为醛类，本研究所用的醛类为D-甘油醛或L-甘油醛。
如图2所示：
当RhaD(带有Nus标签)以DHAP和D-甘油醛为底物时，主要生成D-阿洛酮糖，还有少量D-山梨糖产生，二者的比例约为15:1。当RhaD(不带有Nus标签)以DHAP和D-甘油醛为底物时，D-阿洛酮糖和D-山梨糖二者的比例约为15:1。
当RhaD(带有Nus标签)以DHAP和L-甘油醛为底物时，生成两种稀有糖L-果糖和L-塔格糖，二者的比例约为1.1:1。当RhaD(不带有Nus标签)以DHAP和L-甘油醛为底物时，生成两种稀有糖L-果糖和L-塔格糖比例约为1.5:1。
具体测定步骤如下：
反应体系如下：DHAP(0.2M，5μL)，D-甘油醛/L-甘油醛(0.5M，3μL)，Nus-RhaD(带标签)或RhaD(不带标签)(终浓度为0.5mg/mL)，补加去离子水至50μL。反应液在30℃反应16-22h，用6NHCl调节pH为4.0-5.0后，加入0.1μL酸性磷酸酶在37℃反应20-24h。反应结束后用1NNaOH调节反应液pH为7.0。利用色谱柱利用色谱柱HPX-87H(300×7.8mm，氢型阳离子交换树脂，填料为聚苯乙烯二乙烯苯树脂)来测定反应液中D-山梨糖和D-阿洛酮糖的比例。HPLC工作条件：5mM硫酸作为流动相，流速0.5mL/min，柱温箱温度60℃，用示差检测器进行检测。使用色谱柱HPX-87C(250×4.0mm，钙型阳离子交换树脂，填料为聚苯乙烯二乙烯苯树脂)检测L-果糖和L-塔格糖的比例，HPLC工作条件如下：去离子水(18.2MΩ.cm)作为流动相，流速0.3mL/min，柱温箱温度80℃，用示差检测器进行检测。
以DL-3-磷酸甘油(DL-GP)为前体“一釜四酶法”合成稀有糖
因为底物DHAP价格昂贵且不稳定，为了避免直接使用DHAP，采用“一釜四酶法”进行合成。
“一釜四酶法”原理：以DL-3-磷酸甘油作为底物，在磷酸甘油氧化酶(GPO)的作用下生成DHAP，此过程需要通入氧气，在生成DHAP的同时，也会生成副产物过氧化氢，考虑到过氧化氢对GPO的抑制作用，向反应体系中加入过氧化氢酶将过氧化氢分解为水和氧气；在RhaD醛缩酶的作用下，生成的DHAP与甘油醛进行缩合反应生成相应的酮糖-1-磷酸；最后在酸性磷酸酶的作用下脱去磷酸基团，最终得到目标产物稀有糖。
反应体系(10mL)：DL-3-磷酸甘油(548.78mg，2.4mmol)，D-甘油醛或L-甘油醛(0.5M，2mL，1mmol)，磷酸甘油氧化酶(70U，2mg)，过氧化氢酶(1000U，1.18μL)，Nus-RhaD(272μL，终浓度0.5mg/mL)，补加无菌水使反应总体积为10mL反应液在30℃下轻摇反应16～22h，反应通过TLC来检测(展开剂正丁醇:乙酸:水＝2:1:1(v:v:v))。反应终了后，向反应液中加入6MHCl调pH为4.6，然后加入11μL酸性磷酸酶(18U)，在37℃轻摇反应20～24h，用TLC来监测反应(展开剂乙酸乙酯:异丙醇:水＝9:3:1(v:v:v))。反应完全后，用1NNaOH将pH调整到7.0，并用HPLC进行检测。反应上清液减压浓缩，用硅胶纯化(流动相为乙酸乙酯:异丙醇:水＝9:3:1(v:v:v))，进而用P-2凝胶过滤层析纯化得到稀有糖的混合物，进而用Ca2+离子交换层析分离得到单个稀有糖。
表1RhaD催化的以不同的起始底物和醛受体合成稀有糖汇总表
稀有糖的分离纯化
(1)硅胶纯化
①样品的预处理
向反应液加入适量的甲醇以沉淀反应液中的蛋白，5000g离心20min，将得到的上清液转入100mL圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩样品。待样品浓缩至较少体积(约5mL)时，加入适量的硅胶使样品吸附到硅胶粉后结束旋蒸。
②装柱及上样纯化
取适量硅胶粉，用乙酸乙酯混匀，倒入层析柱中，加压使最终的硅胶大约达到柱子的三分之一高度并且胶面上方应该留有一部分乙酸乙酯。将吸附有样品的硅胶粉末用漏斗加到层析柱中，流动相为乙酸乙酯:异丙醇:水＝9:3:1(v/v/v)，将洗脱液按顺序收集到试管中。
③目的产物洗脱液的鉴定及浓缩
用毛细管蘸取试管中的洗脱液，滴到硅胶层析板上用显色液显色，初步判断哪些试管洗脱液中含有目的产物。然后将含有目的产物的试管用对应的稀有糖为标准品，以乙酸乙酯:异丙醇:水＝9:3:1(体积比)为展开剂再次做TLC检测，进一步确定哪些试管含有目的产物。将含有目的产物的试管合并，倒入250mL圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪将其浓缩至1-2mL用于P-2凝胶过滤层析分离。
(2)P-2凝胶过滤层析
①P-2填料的预处理与装柱
P-2填料的预处理参照P-2凝胶的说明进行操作。将P-2玻璃柱子(1.5cm×90cm)垂直固定在铁架台上，倒入适量去离子水并关闭出水口。将P-2填料混匀倒入柱子，待其沉积一定的高度后，打开出水口不断加入填料，直至胶面离柱子上边缘约10cm，使用蠕动泵将脱气后的去离子水泵入入水口来过夜平衡柱子，主要目的是将填料压实，从而增强分离性能。
②上样与分离
将平衡好的柱子的出水口打开，使液面下降至胶面处时将出水口关闭。将硅胶纯化后的浓缩液(1-2mL)加入到胶面上，尽量保持胶面平整，打开出水口，当浓缩液完全进入胶面时关闭出水口，加入适量去离子水，接通入水口，设置合适的流速，开始分离，同时用自动收集器进行收集。先用TLC显色初步判断哪些收集管洗脱液中含有目的产物。然后将含有目的产物的收集管用对应的稀有糖为标准品，以乙酸乙酯:异丙醇:水＝9:3:1(v/v/v)为展开剂再次做TLC检测，进一步确定哪些试管含有目的产物。将那些含有目的产物的试管合并，用冷冻干燥机冻干，称重计算产率。
(3)Ca2+离子交换树脂分离D-山梨糖和D-阿洛酮糖(L-果糖和L-塔格糖)
①离子交换树脂预处理及装柱
树脂用超纯水浸泡30min后，倒掉一些悬浮物，重复三次或直至树脂浸泡后的水颜色较浅。然后用超纯水浸泡，混匀。将带有夹套的层析柱(26×100cm)垂直固定于铁架台上，将出水口关闭，向柱子中加入适量的超纯水，倒入混匀好的树脂，等树脂沉积到一定高度时，打开出水口，继续向其中加树脂，直至树脂高度距离柱子最上端约5cm时，柱子即为装好。将水浴锅打开，设定温度为65℃，待达到指定温度后，通过蠕动泵将热水打到夹套中，在夹套的出水口连接管路联通到水浴锅里，平衡1h后准备上样。
②上样与分离参照P-2凝胶过滤层析
将分别含有D-山梨糖和D-阿洛酮糖(L-果糖和L-塔格糖)产物的试管合并，冷冻干燥机冻干。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用。
2.根据权利要求1所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶来源于嗜热菌ThermotogamaritimaMSB8，其基因序列表如SP9所示。
3.根据权利要求1或2所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在大肠杆菌重组菌中进行表达和纯化。
4.根据权利要求3所述的的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述大肠杆菌重组菌的构建方法为：
将L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因片段连接到pET-43.1a载体上，并将该重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到大肠杆菌重组菌。
5.根据权利要求3所述的的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述表达和纯化，包括，
培养大肠杆菌重组菌至OD600＝0.8-1.0，添加终浓度为0.1-1.0mMIPTG，在15-37℃，120～220rpm条件下诱导4～16h；
用含有10-20mM咪唑的缓冲液洗脱杂蛋白，用含有300-500mM咪唑的缓冲液洗脱纯酶。
6.根据权利要求1所述的的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述合成，包括，
向反应体系中加入底物DL-3-磷酸甘油、醛受体、磷酸甘油氧化酶、过氧化氢酶、L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，在氧气存在的环境下，25-35℃反应12-20h后，调节pH为4.0-5.0，加入酸性磷酸酶，35-39℃反应12-20h。
7.根据权利要求6所述的的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述醛受体为D-甘油醛、L-甘油醛或甘油醛的衍生物。
8.根据权利要求6或7所述的的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用，其特征在于：所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶为带标签的融合蛋白或不带标签的蛋白。
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