CN111172215A - 一种d型稀有己酮糖的制备方法 - Google Patents

一种d型稀有己酮糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种D型稀有己酮糖的制备方法，包括以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、糖醇氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应，将酶催化反应产物分离、纯化。本发明以甘油和焦磷酸为原料，而不是使用昂贵的D‑甘油醛或者D‑果糖为原料。因此，D型稀有己酮糖生产成本低，适于大规模生产。本发明制备方法不用甘油激酶，不需要ATP进行底物磷酸化生产甘油三磷酸，大大降低生产D型稀有己酮糖的成本。

Description

一种D型稀有己酮糖的制备方法
技术领域
本发明属于D型稀有酮糖的酶催化制备技术领域，具体涉及一种D型稀有己酮糖的制备方法。
背景技术
稀有酮糖是一类在自然界中存在但含量很低、同时具有重要生理功能的一类单糖及其衍生物。D-构型包括D-山梨糖和D-阿洛酮糖等，具有低热量、天然甜味等优势，可作为功能性甜味剂，同时具有抗癌、抗肥胖、神经保护、清除自由基等生理活性，在生命医药、化妆品、膳食等领域拥有广泛的应用前景。因此，完善稀有糖合成体系具有重要意义。
生产D型稀有酮糖的方法有化学合成法和生物转化法两种。传统的化学合成法步骤繁琐，副反应较多，且很难得到单一构型的产物。相对于化学合成法，酶法因其反应条件温和，高效和立体选择性好而逐渐成为该领域的主流。迄今为止，许多酶促反应依赖于两种或多种糖之间通过异构化或差向异构化来获得各种稀有酮糖(如Izumoring方法)。但是，由于涉及热力学平衡，转化率较低，同时产品难以分离与纯化。
因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的适合规模化生产稀有酮糖的新方法。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种D型稀有己酮糖的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种D型稀有己酮糖的制备方法，其包括，
以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、糖醇氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应，将酶催化反应产物分离、纯化。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述甘油浓度为300～800mM。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述焦磷酸为焦磷酸盐，所述焦磷酸的浓度为20～100mM。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述焦磷酸盐包括焦磷酸二氢二钠和焦磷酸四钠，所述焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1～8U/mL。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述甘油磷酸氧化酶的用量为14～112U/mL。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述过氧化氢酶的用量为10U/mL。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶的用量为0.5～4U/mL。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述酶催化反应的条件是25～45℃反应12～24h。
作为本发明所述的D型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：多酶催化反应体系中还包括，缓冲液和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0～8.5的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液浓度为20～50mM；所述二价镍离子浓度为1mM。
本发明的有益效果：(1)原料价格低廉。本发明以甘油和焦磷酸为原料，而不是使用昂贵的D-甘油醛或者D-果糖为原料。因此，D型稀有己酮糖生产成本低，适于大规模生产。
(2)本发明制备方法不用甘油激酶，不需要ATP进行底物磷酸化生产甘油三磷酸，大大降低生产D型稀有己酮糖的成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为转化甘油和焦磷酸生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，RhaD，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；AldO，糖醇氧化酶。
图2为SDS-PAGE检测5个关键酶；A为酸性磷酸酶；B为糖醇氧化酶；C为甘油磷酸氧化酶；D为L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；E为L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶。第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列,细胞破碎液上清；第5列，纯化后蛋白。
图3为用HPLC检测以甘油为底物，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶为醛缩酶，经过酶促反应后的产物。
图4为单次利用L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶转化甘油生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。
图5为转化甘油和焦磷酸生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化途径的示意图；其中，FucA，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；AldO，糖醇氧化酶。
图6为用HPLC检测以甘油为底物，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶为醛缩酶，经过酶促反应后的产物。
图7为单次利用L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶转化甘油生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。
图8为糖醇氧化酶AldO的表达纯化及活性测定。
图9为糖醇氧化酶AldO的最适反应温度和最适pH测定。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明D-阿洛酮糖和D-山梨糖的制备方法，包括以下步骤：(1)以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(L-rhamnulose-1-phosphate aldolase，EC4.1.2.19)、甘油磷酸氧化酶(L-α-glycerophosphate oxidase，EC：1.1.3.21)过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，EC:3.1.3.2)糖醇氧化酶(alditol oxidase,EC:1.1.3.41)的多酶催化物建立多酶反应体系进行酶催化反应。(2)将酶催化反应产物分离、纯化，即得。
其中，步骤(1)所述甘油浓度为300-800mM；优选的，所述甘油浓度为500-800mM，最优选为700mM；所述焦磷酸的浓度为20-100mM；最优选的为40mM；其中所述焦磷酸为焦磷酸盐，优选为焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠(W：W)为3:2。所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1-8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为14-112U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为0.5-4U/mL。最优选的，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL。所述酶催化反应的条件是25-45℃反应3-24h，优选为30℃反应12-24h。
本发明所述多酶催化反应体系中还包括：缓冲液和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0-8.5的缓冲液，优选为pH值7.0的缓冲液，所述各成分的用量为：Tris-Hcl缓冲液20-50mM、二价镍离子0-1mM；更优选的，各成分的用量为：Tris-Hcl缓冲液20mM、二价镍离子1mM。
本发明以甘油为底物，加入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和糖醇氧化酶，配制多酶反应体系，多酶分子催化途径包括：酸性磷酸酶可将甘油磷酸化生成DL-3-磷酸甘油，DL-3-磷酸甘油在可在甘油磷酸氧化酶作用下生成DHAP。同时，甘油在糖醇氧化酶催化作用下生成D-甘油醛。生成的DHAP与D-甘油醛可在醛缩酶作用下形成磷酸糖，酸性磷酸酶可将磷酸糖作用下形成稀有己酮糖。
实验材料：
甘油，国药集团化学试剂有限公司，产品编号：100106193；
焦磷酸二氢二钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号D165310；
焦磷酸四钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号S165317；
过氧化氢酶，上海生工有限公司产品，产品编号A001896；
pET28a载体，Novagen，Madison，WI；
大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；
实验例1：体外多酶催化将甘油转化为D-阿洛酮糖和D-山梨糖
通过一个体外多酶催化体系将甘油转化为D-阿洛酮糖和D-山梨糖(图1)。这些关键酶包括：(1)酸性磷酸酶(PhoN-Sf，EC:3.1.3.2)，将甘油磷酸化生成DL-3-磷酸甘油。同时，将磷酸糖脱磷酸生成稀有酮糖；(2)甘油磷酸氧化酶(GPO，EC：1.1.3.21)，催化DL-3-磷酸甘油为磷酸二羟基丙酮(DHAP)；(3)糖醇氧化酶(AldO,EC:1.1.3.41)，将甘油转化为D-甘油醛；(4)L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD，EC 4.1.2.19)，将转化DHAP和D-甘油醛为磷酸糖；(5)过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)，将过氧化氢分解为水和氧气。
在本发明中，酸性磷酸酶来源于福氏志贺菌(Shigelaflexneri)，其基因序列在KEGG上的编号为CP0190，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；甘油磷酸氧化酶来源于肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)，其基因序列在KEGG上编号为SP_2185，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，其基因序列在KEGG上编号为b3902；糖醇氧化酶来源于天蓝色链霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)，其基因序列在KEGG上编号为SCO6147，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化。通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-phoN，pET28a-glpO，pET28a-rhaD和pET28a-aldO。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。
本研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.0，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价镍离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩为1U/mL，酸性磷酸酶为1U/mL，改变甘油磷酸氧化酶量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩用量提高到8U/mL，产量进一步提高。
在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.0)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，700mM甘油和40mM焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有酮糖的样品浓缩至原有体积，如图四所示，转化率为98％(稀有酮糖产量/被消耗甘油的理论产糖量*100％)。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。循环四次循环后生成稀有酮糖产量为56.7g/L，结果如表1所示。
本发明还提供一种D-甘油醛的生产方法：
重组糖醇氧化酶AldO的表达纯化及活性测定：
本发明来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2))的糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，由此制备得到AldO的表达菌株。在含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mL LB培养基中，37℃，200rpm继续培养2-3h；待培养物OD600＝0.6-0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养。6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤三次，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，上清液用镍柱进行纯化，纯化结果用SDS-PAGE电泳检测，如图8a所示。
AldO活性测定反应体系如下：50mM Tris-HCl buffer(pH 7.5)，AldO(终浓度0.1mg/mL)，甘油(10mM)30℃反应30min后100℃处理5min使酶失活。反应液上清用高效液相色谱检测，以购买的甘油、D-甘油醛和D-甘油酸纯品作为标准品，检测条件如下所示：伯乐有机酸柱(Aminex HPX-87H,300×7.8mm)，流动相：5mM稀硫酸，流速：0.5mL/min，检测器：Waters示差折光检测器，柱温：60℃，进样量：20μL。如图8b所示以甘油为底物，在糖醇氧化酶AldO的催化下可以生成甘油醛(D-甘油醛标品作为对照)并且在该反应条件下没有甘油酸的生成。
重组糖醇氧化酶AldO催化甘油生成D-甘油醛：
本发明研究发现，当醛缩酶RhaD以D-甘油醛作为受体时，会产生D-阿洛酮糖和D-山梨糖；当RhaD以L-甘油醛作为底物时，会生成唯一的产物L-果糖。为了确认甘油醛的构型，采用如下反应体系：Tris-HCl buffer(50mM,pH7.5),甘油(20mM),DL-甘油-3-磷酸(30mM),磷酸甘油氧化酶(0.1mg/mL),RhaD(0.1mg/mL),YqaB磷酸酶(0.1mg/mL),AldO(0.1mg/mL)和过氧化氢酶(10U/mL)。30℃反应12h，生成的产物用HPLC进行检测，结果显示生成的产物为D-阿洛酮糖和D-山梨糖，表明重组糖醇氧化酶AldO催化甘油生成的为D-甘油醛。
重组糖醇氧化酶AldO最适温度和pH测定：
最适温度的测定：参照实施例1的酶活测定条件，以10mM甘油为底物，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下反应30min，然后100℃处理5min使酶灭活，计算各温度下的相对酶活。最适pH的测定：参照实施例1的酶活测定条件，以10mM甘油为底物，分别于pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0下反应30min，然后100℃处理5min使酶灭活，计算各pH下的相对酶活。相对酶活的定义为测定酶活相对于最高酶活的百分比。结果如图9所示，糖醇氧化酶AldO的最适反应温度为35℃，最适pH为7.5。
糖醇氧化酶AldO核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：
atgagcgacatcaccgttaccaactgggccggcaacatcacctacaccgcgaaggaactgctgcgtccgcactccctggacgcgctgcgtgccctggtggcggacagcgcccgtgtgcgtgtgctgggcagcggtcactccttcaacgagatcgccgagccgggcgacggtggtgttctgctgtctctggcgggcctgccgtccgtggtggacgtggacaccgcggcccgtaccgtgcgtgttggcggcggtgtgcgttacgcggagctggcccgtgtggtgcacgcgcgtggcctggcgctgccgaacatggcctctctgccgcacatctctgttgccggttctgtggccaccggcacccacggttctggtatgggcaacggttctctggcctctatggtgcgcgaggtggagctggttaccgcggacggttctaccgtggtgatcgcgcgtggcgacgagcgtttcggcggtgcggtgacctctctgggcgcgctgggcgtggtgacctctctgaccctggacctggagccggcgtacgagatggaacagcacgttttcaccgagctgccgctggccggtctggacccggcgaccttcgagaccgtgatggcggcggcgtacagcgtgtctctgttcaccgactggcgtgcgccgggtttccgtcaggtgtggctgaagcgtcgcaccgaccgtccgctggacggtttcccgtacgcggccccggccaccgagaagatgcatccggtgccgggcatgccggcggtgaactgcaccgagcagttcggtgtgccgggtccgtggcacgagcgtctgccgcacttccgcgcggagttcaccccgagcagcggtgccgagctgcagtctgagtacctgatgccgcgtgagcacgccctggccgccctgcacgcgatggacgcgatccgtgagaccctggcgccggtgctgcagacctgcgagatccgcaccgttgccgccgacgcgcagtggctgagcccggcgtacggtcgtgacaccgtggccgcgcacttcacctgggttgaggacaccgcggcggtgctgccggtggtgcgtcgtctggaggaggcgctggttccgttcgcggcccgtccgcactggggtaaggtgttcaccgttccggcgggcgagctgcgtgcgctgtacccgcgtctggccgacttcggtgcgctggcccgtgcgctggacccggcgggtaagttcaccaacgcgttcgtgcgcggtgtgctggcgggctaa
实验例2：利用L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶，体外多酶催化将甘油转化为D-阿洛酮糖和D-山梨糖
来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(L-fuculose-1-phosphate aldolase，EC 4.1.2.17)与L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD，EC4.1.2.19)具有相同的催化活性，故本发明将L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶加入多酶催化体系。
在本发明中，通过一个体外多酶催化体系将甘油转化为D-阿洛酮糖和D-山梨糖(图5)。来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶，其基因序列在NCBI上的编号为2827875,，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-fucA。这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图2-E所示。
本研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.0，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价钙离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶为1U/mL，酸性磷酸酶为1U/mL，改变甘油磷酸氧化酶量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩用量提高到1.6U/mL，产量进一步提高。
在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.0)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，700mM甘油和40mM焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有酮糖的样品浓缩至原有体积，如图四所示，转化率为98％(稀有酮糖产量/被消耗甘油的理论产糖量*100％)。同时，浓缩含有甘油的样品，结果如表1所示，在相同条件下进一步反应。循环四次循环后生成稀有酮糖产量为56.7g/L。
在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.0)，1mM的二价钙离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶用量为1.6U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，700mM甘油和40mM焦磷酸盐，在30℃进行催化反应，反应24小时后24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有酮糖的样品浓缩至原有体积，用HPLC检测稀有酮糖浓度，结果如图6所示，转化率为96％(稀有酮糖产量/被消耗甘油的理论产糖量*100％)。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。结果如表1所示，循环四次循环后生成稀有酮糖产量为40.4g/L。
表1
反应体系 转化率<sup>a</sup> 产量
PhoN+GPO+Catalase+RhaD 98％ 56.7g/L
PhoN+GPO+Catalase+FucA 96％ 40.4g/L
a:C1×2/C2×100％
其中，C1为稀有酮糖的摩尔浓度；C2为消耗甘油的摩尔浓度；
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：包括，
以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、糖醇氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应，将酶催化反应产物分离、纯化。
2.如权利要求1所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述甘油浓度为300～800mM。
3.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述焦磷酸为焦磷酸盐，所述焦磷酸的浓度为20～100mM。
4.如权利要求3所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述焦磷酸盐包括焦磷酸二氢二钠和焦磷酸四钠，所述焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。
5.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1～8U/mL。
6.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述甘油磷酸氧化酶的用量为14～112U/mL。
7.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述过氧化氢酶的用量为10U/mL。
8.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述糖醇氧化酶的用量为0.5～4U/mL。
9.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件是25～45℃反应12～24h。
10.如权利要求1或2所述的D型稀有己酮糖的制备方法，其特征在于：多酶催化反应体系中还包括，缓冲液和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0～8.5的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液浓度为20～50mM；所述二价镍离子浓度为1mM。
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