CN111088301B

CN111088301B - 一种l型稀有己酮糖的制备方法

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Publication number: CN111088301B
Application number: CN202010014721.3A
Authority: CN
Inventors: 李子杰; 高晓冬; 李芬
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111088301A

Abstract

本发明公开了一种L型稀有己酮糖的制备方法,其包括，以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、马肝醇脱氢酶、NADH氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应；将酶催化反应产物分离、纯化。本发明原料价格低廉，不用甘油激酶，不需要ATP进行底物磷酸化生产甘油三磷酸，大大降低生产L型稀有己酮糖的成本，本发明将马肝醇脱氢酶与NADH氧化酶相结合生产L‑甘油醛，减少NAD⁺的使用。

Description

一种L型稀有己酮糖的制备方法

技术领域

本发明属于L型稀有己酮糖的酶催化制备技术领域，具体涉及一种L型稀有己酮糖的制备方法。

背景技术

稀有己酮糖是一类在自然界中存在但含量很低、同时具有重要生理功能的一类单糖及其衍生物。L-构型包括L-山梨糖、L-果糖和L-塔格糖等，具有低热量、天然甜味等优势，可作为功能性甜味剂，同时具有抗癌、抗肥胖、神经保护、清除自由基等生理活性，在生命医药、化妆品、膳食等领域拥有广泛的应用前景。因此，完善稀有糖合成体系具有重要意义。

生产L型稀有己酮糖的方法有化学合成法和生物转化法两种。传统的化学合成法步骤繁琐，副反应较多，且很难得到单一构型的产物。相对于化学合成法，酶法因其反应条件温和，高效和立体选择性好而逐渐成为该领域的主流。迄今为止，许多酶促反应依赖于两种或多种糖之间通过异构化或差向异构化来获得各种稀有己酮糖(如Izumoring方法)。但是，由于涉及热力学平衡，转化率较低，同时产品难以分离与纯化。

因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的适合规模化生产稀有己酮糖的新方法。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

本发明所要解决的技术问题是提供一种L-型稀有己酮糖的制备方法，该方法通过体外多酶催化甘油以制备L-型稀有己酮糖，具有产率高，生产成本低，无污染等优点。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种L型稀有己酮糖的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种L型稀有己酮糖的制备方法,其包括，

以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、马肝醇脱氢酶、NADH氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应；

将酶催化反应产物分离、纯化。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述甘油，浓度为300～900mM。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述焦磷酸为焦磷酸盐，所述焦磷酸的浓度为5～125mM。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述焦磷酸盐包括焦磷酸二氢二钠和焦磷酸四钠，所述焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1～8U/mL。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述甘油磷酸氧化酶的用量为14～112U/mL。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述NADH氧化酶的用量为30～34U/mL。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述酶催化反应的条件是25～45℃反应3～24h。

作为本发明所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：多酶催化反应体系中还包括，缓冲液、NAD⁺和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0～8.5的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液浓度为20～50mM；所述二价镍离子浓度为1mM；所述NAD⁺浓度为1mM。

本发明的有益效果：(1)原料价格低廉。本发明以甘油和焦磷酸为原料，而不是使用昂贵的L-甘油醛为原料。因此，L型稀有己酮糖生产成本低，适于大规模生产。

(2)本发明制备方法不用甘油激酶，不需要ATP进行底物磷酸化生产甘油三磷酸，大大降低生产L型稀有己酮糖的成本。

(3)本发明将马肝醇脱氢酶与NADH氧化酶相结合生产L-甘油醛，减少NAD⁺的使用。

术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为肝醇脱氢酶和NADH氧化酶相结合生产L-甘油醛。

图2为转化甘油和焦磷酸生成转化L-果糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，RhaD，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；HLADH，马肝醇脱氢酶；NOX，为NADH氧化酶。

图3为SDS-PAGE检测7个关键酶；A为酸性磷酸酶；B为L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；C为L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；D为D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列,细胞破碎液上清；第5列，纯化后蛋白；E为马肝醇脱氢酶；F为NADH氧化酶；G为甘油磷酸氧化酶；第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列，纯化后蛋白。

图4为用HPLC检测以甘油为底物经过酶促反应后的产物。

图5为单次转化甘油生成L-果糖的体外多酶分子机器催化体系的时间效应曲线；

图6为为转化甘油和焦磷酸生成L-果糖和L-塔格糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，FucA，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；HLADH，马肝脱氢酶；NOX，为NADH氧化酶。

图7为用HPLC检测以甘油为底物经过酶促反应后的产物。

图8为单次转化甘油生成L-果糖和L-塔格糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线；

图9为转化甘油和焦磷酸生成L-山梨糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，FruA，D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；HLADH，马肝醇脱氢酶；NOX，为NADH氧化酶。

图10为用HPLC检测以甘油为底物经过酶促反应后的产物。

图11为单次转化甘油生成L-山梨糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实验材料：

甘油，国药集团化学试剂有限公司，产品编号：100106193；

焦磷酸二氢二钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号D165310；

焦磷酸四钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号S165317；

过氧化氢酶，上海生工有限公司产品，产品编号A001896；

pET28a载体，Novagen，Madison，WI；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本发明L-果糖的制备方法，包括以下步骤：(1)以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(L-rhamnulose-1-phosphate aldolase，EC 4.1.2.19)、甘油磷酸氧化酶(L-α-glycerophosphate oxidase，EC：1.1.3.21)、过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，EC:3.1.3.2)马肝醇脱氢酶(horse liveralcohol dehydrogenase,EC:1.1.1.2)、NADH氧化酶(NADH oxidase，EC:1.6.3.4)的多酶催化物建立多酶反应体系进行酶催化反应；(2)将酶催化反应产物分离、纯化。

其中，步骤(1)所述甘油浓度为300-900mM；优选的，所述甘油浓度为500-800mM，最优选为800mM；所述焦磷酸的浓度为5-125mM，优选的，所述焦磷酸的浓度为20-100mM；最优选的为40mM；其中所述焦磷酸为焦磷酸盐，优选为焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1-8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为14-112U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL；所述NADH氧化酶的用量为32U/mL。最优选的，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL；所述NADH氧化酶的用量为32U/mL。所述酶催化反应的条件是25-45℃反应3-24h，优选为30℃反应12-24h。

多酶催化反应体系中还包括：缓冲液、NAD⁺和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0-8.5的缓冲液，优选为pH值7.5的缓冲液，所述各成分的用量为：Tris-Hcl缓冲液20-50mM、二价镍离子0-1mM；更优选的，各成分的用量为：Tris-Hcl缓冲液20mM、NAD⁺1mM、二价镍离子1mM。

本发明以甘油为底物，加入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和糖醇氧化酶，配制多酶反应体系，多酶分子催化途径包括：酸性磷酸酶可将甘油磷酸化生成DL-3-磷酸甘油，DL-3-磷酸甘油在可在甘油磷酸氧化酶作用下生成DHAP。同时，甘油在马肝醇脱氢酶与NADH氧化酶催化作用下生成L-甘油醛。生成的DHAP与L-甘油醛可在醛缩酶作用下形成磷酸糖，酸性磷酸酶可将磷酸糖作用下形成L-果糖。

实验例1：体外多酶催化将甘油转化为L-果糖

马肝醇脱氢酶可以特异的氧化甘油生成L-甘油醛，并无其他对映异构体产生，可用于L-甘油醛生产。但是其生产过程中需要NAD⁺，生产成本较高。NADH氧化酶能够将NADH的电子传递给氧生成H2O。本研究首次将马肝醇脱氢酶和NADH氧化酶相结合在低浓度NAD⁺作用下生产L-GA。

在0.5mL反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.5)，马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL，NADH氧化酶的用量为32U/mL，甘油100mM和NAD⁺1mM；另一个反应不含NADH氧化酶作为对照。在反应6h通过HPLC测量反应液中D-甘油醛的用量。结果如图1所示，马肝醇脱氢酶与NADH氧化酶组合生产L-甘油醛的相对活性是对照的23倍。

通过一个体外多酶催化体系将甘油转化L-果糖(图2)。这些关键酶包括：(1)酸性磷酸酶(PhoN-Sf，EC:3.1.3.2)，将甘油磷酸化生成DL-3-磷酸甘油。同时，将磷酸糖脱磷酸生成稀有己酮糖；(2)甘油磷酸氧化酶(GPO，EC：1.1.3.21)，催化DL-3-磷酸甘油为磷酸二羟基丙酮(DHAP)；(3)马肝醇脱氢酶(horse liver alcohol dehydrogenase,EC:1.1.1.2)，将甘油转化为L-甘油醛；(4)L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD，EC 4.1.2.19)，将转化DHAP和L-甘油醛为磷酸酮糖；(5)过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)，将过氧化氢分解为水和氧气；(6)NADH氧化酶(NADH oxidase，EC:1.6.3.4)，将NADH转化为NAD⁺。

在本发明中，酸性磷酸酶来源于福氏志贺菌(Shigela flexneri)，其基因序列在KEGG上的编号为CP0190，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；甘油磷酸氧化酶来源于肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)，其基因序列在KEGG上编号为SP_2185，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，其基因序列在KEGG上编号为b3902；马肝醇脱氢酶来源于马肝(horse liver)，其基因序列在NCBI上编号为ID:100034242；NADH氧化酶来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，其基因序列NCBI上编号为ID:901266，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化。通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-phoN，pET28a-glpO，pET28a-rhaD，pET28a-nox和pET28a-ADH1E。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图3所示。

本研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.5，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价镍离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩为1U/mL，酸性磷酸酶为1U/mL，马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL，NADH氧化酶的用量为32U/mL，改变甘油磷酸氧化酶量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩没量提高到8U/mL，产量进一步提高。

在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.5)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，800mM甘油，1mMNAD⁺和40mM焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有己酮糖的样品浓缩至原有体积，如图5所示，转化率为96％。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。循环六次循环后生成L-果糖产量为64.0g/L，结果如表1所示。

实验例2：体外多酶催化将甘油转化为L-果糖和L-塔格糖

通过一个体外多酶催化体系将甘油转化L-果糖和L-塔格糖(图6)。这些关键酶包括：(1)酸性磷酸酶(PhoN-Sf，EC:3.1.3.2)，将甘油磷酸化生成DL-3-磷酸甘油。同时，将磷酸糖脱磷酸生成稀有己酮糖；(2)甘油磷酸氧化酶(GPO，EC：1.1.3.21)，催化DL-3-磷酸甘油为磷酸二羟基丙酮(DHAP)；(3)肝醇脱氢酶(horse l iver alcohol dehydrogenase,EC:1.1.1.2)，将甘油转化为L-甘油醛；(4)L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(FucA，EC 4.1.2.17)，将转化DHAP和L-甘油醛为磷酸糖；(5)过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)，将过氧化氢分解为水和氧气；(6)NADH氧化酶(NADH oxidase，EC:1.6.3.4)，将NADH转化为NAD⁺。

来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶，其基因序列在NCBI上的编号为2827875，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-fucA。这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图3所示。

研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.5，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价钙离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶用量为1U/mL，酸性磷酸酶用量为1U/mL，马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL，NADH氧化酶的用量为32U/mL，改变甘油磷酸氧化用量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶用量提高到1.6U/mL，产量进一步提高。

在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.5)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，800mM甘油，1mM NAD+和40mM焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有己酮糖的样品浓缩至原有体积，如图8所示，转化率为92％。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。循环六次循环后生成L-果糖和L-塔格糖产量为48.7g/L，结果如表1所示。

实验例3：体外多酶催化将甘油转化为L-山梨糖

通过一个体外多酶催化体系将甘油转化L-山梨糖(图9)。这些关键酶包括：(1)酸性磷酸酶(PhoN-Sf，EC:3.1.3.2)，将甘油磷酸化生成DL-3-磷酸甘油。同时，将磷酸糖脱磷酸生成稀有己酮糖；(2)甘油磷酸氧化酶(GPO，EC：1.1.3.21)，催化DL-3-磷酸甘油为磷酸二羟基丙酮(DHAP)；(3)马肝醇脱氢酶(HLADH,EC:1.1.1.1)，将甘油转化为L-甘油醛；(4)D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FruA，EC 00000)，将转化DHAP和L-甘油醛为磷酸糖；(5)过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)，将过氧化氢分解为水和氧气；(6)NADH氧化酶(NADH oxidase，EC:1.6.3.4)，将NADH转化为NAD⁺。

来源于肉质葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)的D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶，通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-fruA。这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图3所示。

研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.5，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价铜离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶用量为1U/mL，酸性磷酸酶用量为1U/mL，马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL，NADH氧化酶的用量为32U/mL，改变甘油磷酸氧化用量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶提高到1.4U/mL，产量进一步提高。

在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.5)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，800mM甘油，1mM NAD+和40mM焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有己酮糖的样品浓缩至原有体积，如图11所示，转化率为93％。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。循环六次循环后生成L-山梨糖产量为57.84g/L，结果如表1所示。

表1

实施案例	转化率	产率
			实施案例1	96％	64.0g/L
实施案例2	96％	48.7g/L
			实施案例3	93％	57.84g/L

a:C₁×2/C₂×100％

其中，C₁为稀有己酮糖的摩尔浓度；C₂为消耗甘油的摩尔浓度；

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：包括，

将酶催化反应产物分离、纯化；

其中，加入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的酶催化反应产物为L-果糖，酶催化反应的条件是pH7.5，反应温度30℃，金属离子为二价镍离子。

2.如权利要求1所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述甘油，浓度为300～900mM。

3.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述焦磷酸为焦磷酸盐，所述焦磷酸的浓度为5～125mM。

4.如权利要求3所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述焦磷酸盐包括焦磷酸二氢二钠和焦磷酸四钠，所述焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。

5.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1～8U/mL。

6.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述甘油磷酸氧化酶的用量为14～112U/mL。

7.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL。

8.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述NADH氧化酶的用量为30～34U/mL。

9.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：多酶催化反应体系中还包括，缓冲液、NAD⁺和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0～8.5的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液浓度为20～50mM；所述二价镍离子浓度为1mM；所述NAD⁺浓度为1mM。