CN111172123A

CN111172123A - 一种d-甘油醛的生产方法

Info

Publication number: CN111172123A
Application number: CN202010014710.5A
Authority: CN
Inventors: 高晓冬; 李子杰; 陈洲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111172123B

Abstract

本发明公开了一种D‑甘油醛的生产方法，其通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D‑甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明获得了天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶AldO的氨基酸序列，通过密码子优化，并将其表达在大肠杆菌细胞中。该酶能够将廉价的甘油转化为D‑甘油醛，并且具有很好的催化效率，反应条件温和，操作简单，这对通过基因重组合表达技术的大规模工业化应用生产十分有利。

Description

一种D-甘油醛的生产方法

技术领域

本发明属于D-甘油醛生产技术领域，具体涉及一种D-甘油醛的生产方法。

背景技术

甘油醛(glyceraldehyde)是一种最早发现的具有光学活性的醛糖化合物，根据其光学活性不同可分为D-甘油醛和L-甘油醛。甘油醛能够作为多种糖类化合物合成的重要前体，比如磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)能够以D-甘油醛为受体，合成D-山梨糖和D- 阿洛酮糖；D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等生理功能。2011年美国FDA已经批准D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用，自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展，市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品，2012年松谷化学在日本国内发售添加有13％～15％比例的D-阿洛酮糖、阿洛糖等3种以上的稀少糖糖浆产品(Rare-sugar sweet(简称RSS))，受到消费者欢迎。甘油醛的制备方法有化学法和生物法。但是，由于生物法报道较少，目前市场上销售的D-甘油醛大部分是通过化学方法生产而来。相比生物法，化学方法具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点。利用生物法生产甘油醛，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此越来越受到关注。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种D-甘油醛的生产方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种D-甘油醛的生产方法，其包括，通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D-甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：包括，将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，制备得到AldO的表达菌株。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：还包括，在含卡那霉素的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素的 LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mL LB培养基中， 37℃，200rpm继续培养2～3h；待培养物OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养，6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，用镍柱进行纯化。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述卡那霉素终浓度为50μg/mL。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其适宜反应温度为25～45℃。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为30～40℃。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为35℃。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其其适宜反应pH值为7.0～8.0。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其其适宜反应pH值为7.5。

本发明的有益效果：本发明来源于天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得了天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶 AldO的氨基酸序列，通过密码子优化，并将其表达在大肠杆菌细胞中。该酶能够将廉价的甘油转化为D-甘油醛，并且具有很好的催化效率，反应条件温和，操作简单，这对通过基因重组合表达技术的大规模工业化应用生产十分有利。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为转化甘油和焦磷酸生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，RhaD，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；AldO，糖醇氧化酶。

图2为SDS-PAGE检测5个关键酶；A为酸性磷酸酶；B为糖醇氧化酶； C为甘油磷酸氧化酶；D为L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；E为L-墨角藻糖-1- 磷酸醛缩酶。第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列,细胞破碎液上清；第5列，纯化后蛋白。

图3为用HPLC检测以甘油为底物，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶为醛缩酶，经过酶促反应后的产物。

图4为单次利用L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶转化甘油生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。

图5为转化甘油和焦磷酸生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化途径的示意图；其中，FucA，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶； Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；AldO，糖醇氧化酶。

图6为用HPLC检测以甘油为底物，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶为醛缩酶，经过酶促反应后的产物。

图7为单次利用L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶转化甘油生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。

图8为糖醇氧化酶AldO的表达纯化及活性测定。

图9为糖醇氧化酶AldO的最适反应温度和最适pH测定。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实验材料：

甘油，国药集团化学试剂有限公司，产品编号：100106193；

焦磷酸二氢二钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号D165310；

焦磷酸四钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号S165317；

过氧化氢酶，上海生工有限公司产品，产品编号A001896；

pET28a载体，Novagen，Madison，WI；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

实验例1：一种D-甘油醛的生产方法：

重组糖醇氧化酶AldO的表达纯化及活性测定：

本发明来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2))的糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，由此制备得到AldO的表达菌株。在含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的 LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mL LB培养基中， 37℃，200rpm继续培养2-3h；待培养物OD600＝0.6-0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养。6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤三次，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm 离心收集上清液，上清液用镍柱进行纯化，纯化结果用SDS-PAGE电泳检测，如图8a所示。

AldO活性测定反应体系如下：50mM Tris-HCl buffer(pH 7.5)，AldO(终浓度0.1mg/mL)，甘油(10mM)30℃反应30min后100℃处理5min使酶失活。反应液上清用高效液相色谱检测，以购买的甘油、D-甘油醛和D-甘油酸纯品作为标准品，检测条件如下所示：伯乐有机酸柱(Aminex HPX-87H,300× 7.8mm)，流动相：5mM稀硫酸，流速：0.5mL/min，检测器：Waters示差折光检测器，柱温：60℃，进样量：20μL。如图8b所示以甘油为底物，在糖醇氧化酶AldO的催化下可以生成甘油醛(D-甘油醛标品作为对照)并且在该反应条件下没有甘油酸的生成。

重组糖醇氧化酶AldO催化甘油生成D-甘油醛：

本发明研究发现，当醛缩酶RhaD以D-甘油醛作为受体时，会产生D-阿洛酮糖和D-山梨糖；当RhaD以L-甘油醛作为底物时，会生成唯一的产物L- 果糖。为了确认甘油醛的构型，采用如下反应体系：Tris-HCl buffer(50mM,pH 7.5),甘油(20mM),DL-甘油-3-磷酸(30mM),磷酸甘油氧化酶(0.1mg/mL), RhaD(0.1mg/mL),YqaB磷酸酶(0.1mg/mL),AldO(0.1mg/mL)和过氧化氢酶(10U/mL)。30℃反应12h，生成的产物用HPLC进行检测，结果显示生成的产物为D-阿洛酮糖和D-山梨糖，表明重组糖醇氧化酶AldO催化甘油生成的为D-甘油醛。

重组糖醇氧化酶AldO最适温度和pH测定：

最适温度的测定：参照实施例1的酶活测定条件，以10mM甘油为底物，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下反应30min，然后100℃处理5min使酶灭活，计算各温度下的相对酶活。最适pH的测定：参照实施例1的酶活测定条件，以10mM甘油为底物，分别于pH7.0、7.5、8.0、8.5、 9.0下反应30min，然后100℃处理5min使酶灭活，计算各pH下的相对酶活。相对酶活的定义为测定酶活相对于最高酶活的百分比。结果如图9所示，糖醇氧化酶AldO的最适反应温度为35℃，最适pH为7.5。

糖醇氧化酶AldO核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：

体外多酶催化将甘油转化为D-阿洛酮糖和D-山梨糖

通过一个体外多酶催化体系将甘油转化为D-阿洛酮糖和D-山梨糖(图1)。这些关键酶包括：(1)酸性磷酸酶(PhoN-Sf，EC:3.1.3.2)，将甘油磷酸化生成 DL-3-磷酸甘油。同时，将磷酸糖脱磷酸生成稀有酮糖；(2)甘油磷酸氧化酶(GPO，EC：1.1.3.21)，催化DL-3-磷酸甘油为磷酸二羟基丙酮(DHAP)；(3)糖醇氧化酶(AldO,EC:1.1.3.41)，将甘油转化为D-甘油醛；(4)L-鼠李树胶糖-1- 磷酸醛缩酶(RhaD，EC 4.1.2.19)，将转化DHAP和D-甘油醛为磷酸糖；(5)过氧化氢酶(Catalase，EC:1.11.1.6)，将过氧化氢分解为水和氧气。

在本发明中，酸性磷酸酶来源于福氏志贺菌(Shigela flexneri)，其基因序列在KEGG上的编号为CP0190，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；甘油磷酸氧化酶来源于肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)，其基因序列在 KEGG上编号为SP_2185，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，其基因序列在KEGG上编号为b3902；糖醇氧化酶来源于天蓝色链霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)，其基因序列在KEGG上编号为SCO6147，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化。通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-phoN，pET28a-glpO，pET28a-rhaD和pET28a-aldO。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。

本研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.0，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价镍离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩为1U/mL，酸性磷酸酶为1U/mL，改变甘油磷酸氧化酶量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩用量提高到8U/mL，产量进一步提高。

在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.0)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，700mM甘油和40mM 焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有酮糖的样品浓缩至原有体积，如图4所示，转化率为98％(稀有酮糖产量/ 被消耗甘油的理论产糖量*100％)。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。循环四次循环后生成稀有酮糖产量为56.7g/L，结果如表1所示。

实验例2：利用L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶，体外多酶催化将甘油转化为 D-阿洛酮糖和D-山梨糖

来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(L-fuculose-1-phosphate aldolase，EC 4.1.2.17)与L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD，EC4.1.2.19)具有相同的催化活性，故本发明将L-墨角藻糖-1- 磷酸醛缩酶加入多酶催化体系。

在本发明中，通过一个体外多酶催化体系将甘油转化为D-阿洛酮糖和D- 山梨糖(图5)。来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的L-墨角藻糖 -1-磷酸醛缩酶，其基因序列在NCBI上的编号为2827875,，按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化；通过分子克隆获得相应的表达载体pET28a-fucA。这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达和纯化，蛋白质纯化的结果如图2-E所示。

本研究首先优化了反应条件：pH(4.0-9.0)、温度(25-45℃)、以及金属离子，得到最优条件pH：7.0，最优温度：30摄氏度，金属离子为二价钙离子。在最优条件下，优化联级反应的各个酶比例。首先保持L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶为1U/mL，酸性磷酸酶为1U/mL，改变甘油磷酸氧化酶量(14-112U/mL)得到最优甘油磷酸氧化酶为28U/mL；同时进一步将实验L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩用量提高到1.6U/mL，产量进一步提高。

在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.0)，1mM的二价镍离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为8U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，700mM甘油和40mM 焦磷酸盐，在30℃进行催化反应。24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有酮糖的样品浓缩至原有体积，如图4所示，转化率为98％(稀有酮糖产量/ 被消耗甘油的理论产糖量*100％)。同时，浓缩含有甘油的样品，结果如表1所示，在相同条件下进一步反应。循环四次循环后生成稀有酮糖产量为56.7g/L。

在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的Tris-Hcl(pH7.0)，1mM的二价钙离子，所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶用量为1.6U/mL，所述甘油磷酸氧化酶的用量为28U/mL，所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述糖醇氧化酶的用量为1U/mL，700mM甘油和40mM 焦磷酸盐，在30℃进行催化反应，反应24小时后24h后，用P2分离甘油和样品，收集含稀有酮糖的样品浓缩至原有体积，用HPLC检测稀有酮糖浓度，结果如图6所示，转化率为96％(稀有酮糖产量/被消耗甘油的理论产糖量 *100％)。同时，浓缩含有甘油的样品，在相同条件下进一步反应。结果如表1所示，循环四次循环后生成稀有酮糖产量为40.4g/L。

表1

反应体系	转化率<sup>a</sup>	产量
			PhoN+GPO+Catalase+RhaD	98％	56.7g/L
PhoN+GPO+Catalase+FucA	96％	40.4g/L

a:C₁×2/C₂×100％

其中，C₁为稀有酮糖的摩尔浓度；C₂为消耗甘油的摩尔浓度

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种D-甘油醛的生产方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcgaca tcaccgttac caactgggcc ggcaacatca cctacaccgc gaaggaactg 60

ctgcgtccgc actccctgga cgcgctgcgt gccctggtgg cggacagcgc ccgtgtgcgt 120

gtgctgggca gcggtcactc cttcaacgag atcgccgagc cgggcgacgg tggtgttctg 180

ctgtctctgg cgggcctgcc gtccgtggtg gacgtggaca ccgcggcccg taccgtgcgt 240

gttggcggcg gtgtgcgtta cgcggagctg gcccgtgtgg tgcacgcgcg tggcctggcg 300

ctgccgaaca tggcctctct gccgcacatc tctgttgccg gttctgtggc caccggcacc 360

cacggttctg gtatgggcaa cggttctctg gcctctatgg tgcgcgaggt ggagctggtt 420

accgcggacg gttctaccgt ggtgatcgcg cgtggcgacg agcgtttcgg cggtgcggtg 480

acctctctgg gcgcgctggg cgtggtgacc tctctgaccc tggacctgga gccggcgtac 540

gagatggaac agcacgtttt caccgagctg ccgctggccg gtctggaccc ggcgaccttc 600

gagaccgtga tggcggcggc gtacagcgtg tctctgttca ccgactggcg tgcgccgggt 660

ttccgtcagg tgtggctgaa gcgtcgcacc gaccgtccgc tggacggttt cccgtacgcg 720

gccccggcca ccgagaagat gcatccggtg ccgggcatgc cggcggtgaa ctgcaccgag 780

cagttcggtg tgccgggtcc gtggcacgag cgtctgccgc acttccgcgc ggagttcacc 840

ccgagcagcg gtgccgagct gcagtctgag tacctgatgc cgcgtgagca cgccctggcc 900

gccctgcacg cgatggacgc gatccgtgag accctggcgc cggtgctgca gacctgcgag 960

atccgcaccg ttgccgccga cgcgcagtgg ctgagcccgg cgtacggtcg tgacaccgtg 1020

gccgcgcact tcacctgggt tgaggacacc gcggcggtgc tgccggtggt gcgtcgtctg 1080

gaggaggcgc tggttccgtt cgcggcccgt ccgcactggg gtaaggtgtt caccgttccg 1140

gcgggcgagc tgcgtgcgct gtacccgcgt ctggccgact tcggtgcgct ggcccgtgcg 1200

ctggacccgg cgggtaagtt caccaacgcg ttcgtgcgcg gtgtgctggc gggctaa 1257

Claims

1.一种D-甘油醛的生产方法，其特征在于：通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D-甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：包括，将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，制备得到AldO的表达菌株。

3.如权利要求2所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：还包括，在含卡那霉素的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mL LB培养基中，37℃，200rpm继续培养2～3h；待培养物OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养，6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，用镍柱进行纯化。

4.如权利要求3所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：所述卡那霉素终浓度为50μg/mL。

5.如权利要求1所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：所述糖醇氧化酶AldO，其适宜反应温度为25～45℃。

6.如权利要求5所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为30～40℃。

7.如权利要求6所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为35℃。

8.如权利要求1所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：所述糖醇氧化酶AldO，其其适宜反应pH值为7.0～8.0。

9.如权利要求8所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：所述糖醇氧化酶AldO，其其适宜反应pH值为7.5。