CN107988286B - 一种全细胞催化制备塔格糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全细胞催化制备塔格糖的方法。所述方法包括将含有α‑葡聚糖磷酸化酶基因(或纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶基因、或蔗糖磷酸化酶基因)、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6‑磷酸塔格糖差向异构酶基因、6‑磷酸塔格糖磷酸酶基因的质粒转入大肠杆菌工程菌中获得转化菌株；诱导转化菌株产酶后进行透性化处理；透性化处理后的菌体混合后与无机磷酸根以及淀粉或淀粉衍生物(或者是纤维素酶和纤维素或纤维素衍生物组成的混合物、或者是蔗糖)建立全细胞的酶催化反应体系，进行基于全细胞的酶催化反应，即得塔格糖。本发明利用全细胞催化制备塔格糖，具有成本低、污染低、产率高等优点，适合规模化生产塔格糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种塔格糖的制备方法，尤其涉及一种利用全细胞催化制备塔格糖的方法，属于塔格糖的制备领域。
背景技术
塔格糖(D-Tagatose)是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。甜味特性与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的三分之一，所以被称之为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。塔格糖具有四大功能：低能量，降血糖，改善肠道菌群和抗龋齿(Oh D-K:Tagatose:properties,applications,and biotechnological processes.App.Microbiol.Biotechnol.2007,76:1-8)。
生产塔格糖的方法有化学合成法和生物转化法两种。一般都以半乳糖为原料，通过化学方法或生物转化进行异构化反应而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到，也有研究使用半乳糖醇为原料，经生物氧化为塔格糖。但半乳糖醇价格较高，目前暂不适宜用作工业化生产原料。化学合成法是利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催化剂，促使D-半乳糖在碱性条件下生成塔格糖，并形成金属氢氧化物-塔格糖复合物，再用酸中和获得D-塔格糖。生物转化法包括将半乳糖醇氧化成塔格糖，和利用微生物所产生的异构酶将半乳糖异构成塔格糖两种方法。因化学法能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，产生化学污染，故生物转化法具有较好的应用前景。目前研究较多的生物转化生产塔格糖的方法是利用L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖转化为塔格糖，然而半乳糖的较高价格影响了塔格糖的最终价格，导致无法广泛的使用(Rhimi M,Aghajari N,Juy M,Chouayekh H,Maguin E,Haser R,BejarS:Rational design of Bacillus stearothermophilus US100l-arabinose isomerase:Potential applications for d-tagatose production.Biochim.2009,91:650-653.OhH-J,Kim H-J,Oh D-K:Increase in d-tagatose Production Rate by Site-directedMutagenesis of l-arabinose Isomerase from Geobacillus thermodenitrificans.Biotechnol.Lett.2006,28:145-149.Bosshart A,Hee CS,Bechtold M,Schirmer T,PankeS:Directed Divergent Evolution of a Thermostable D-Tagatose Epimerase towardsImproved Activity for Two Hexose Substrates.ChemBioChem 2015,16:592-601.MenY,Zhu Y,Zhang L,Kang Z,Izumori K,Sun Y,Ma Y:Enzymatic conversion of D-galactose to D-tagatose:Cloning,overexpression and characterization of l-arabinose isomerase from Pediococcus pentosaceus PC-5.Microbiol.Res.2014,169:171-178.)。
韩国科学家发明一种多酶催化的方法将果糖转化为塔格糖，包括利用6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶将果糖转化为塔格糖(Oh DK,HONG SH,Lee SH:Aldolase,aldolase mutants and tagatose using the same production methods andcompositions for production.WO 2015016544A1.Google Patents；2015.)，但是该方法是从果糖生产6-磷酸果糖，因此需要ATP对果糖进行底物磷酸化，导致塔格糖生产成本高，不适应大规模生产。
因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的适合规模化生产塔格糖的新方法。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种利用全细胞催化制备塔格糖的方法，该方法是采用全新的催化路径。用该方法制备塔格糖，具有成本低、产率高等优点，适合规模化生产塔格糖。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种从淀粉及其衍生物利用全细胞催化制备塔格糖的方法，包括以下步骤：
(1)将含有α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的质粒转入大肠杆菌工程菌中获得相应的转化菌株；(2)诱导转化菌株产酶后,对菌体进行透性化处理；(3)透性化处理后的菌体混合在一起后与无机磷酸根以及淀粉或淀粉衍生物一同建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，即得。
其中，透性化处理包括但不限于热处理和化学试剂处理。
优选的，步骤(1)中可以将α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因各自转入大肠杆菌工程菌中分别获得5个转化菌株；或者是将α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因以任意排列组合方式共转入一个大肠杆菌工程菌中获得1个转化菌株；还可以是将α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因以及6-磷酸塔格糖磷酸酶基因按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的大肠杆菌工程菌中获得两个或两个以上的转化菌株。
为了达到更好的效果，还可以将全细胞催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化，得到高纯度的塔格糖产品。
所述全细胞催化反应的反应体系中还含有以下(1)或(2)中的多酶混合物中的任何一种：
(1)淀粉去分支酶，麦芽糖磷酸化酶和α淀粉酶；
(2)淀粉去分支酶，葡聚糖转移酶和α淀粉酶；
其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。
进一步优选的，所述全细胞催化反应的反应体系中还含有聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
其中，所述淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶、α淀粉酶、淀粉去分支酶以及聚磷酸葡萄糖激酶可通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理的方式进行添加；也可直接将购买获得的淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶、α淀粉酶、淀粉去分支酶或聚磷酸葡萄糖激酶添加到全细胞催化反应的反应体系中；优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶采用通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理的方式进行添加。
所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。
其中，在建立全细胞催化反应体系时，可以将透性化处理后的菌体或相应替换这些菌体的纯酶以及它们的混合物和底物采用同时加入或先后加入的方式建立全细胞催化反应体系，优选为采用同时加入的方式建立全细胞催化反应体系。
本发明进一步提供了另一种从纤维素及其衍生物利用利用全细胞催化制备塔格糖的方法，包括以下步骤：
(1)将含有纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的质粒转入大肠杆菌工程菌中获得相应的转化菌株；(2)诱导转化菌株产酶后,对菌体进行透性化处理；(3)透性化处理的菌体混合在一起后与由纤维素酶和纤维素组成的混合物或由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物,并添加无机磷酸根离子建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，即得。
其中，步骤(1)中可以将纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因各自转入大肠杆菌工程菌中分别获得6个转化菌株；或者是将纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因以任意排列组合方式共转入一个大肠杆菌工程菌中获得1个转化菌株；还可以是将纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的大肠杆菌工程菌中获得两个或两个以上的转化菌株。
为了达到更好的效果，优选的，将全细胞催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化，得到高纯度的塔格糖产品。
优选的，所述由纤维素酶和纤维素组成的混合物的制备方法包括：将纤维素和纤维素酶混合后离心、去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物；所述由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物的制备方法包括：将纤维素衍生物和纤维素酶混合后离心，去上清，得到纤维素酶和纤维素衍生物的混合物。
其中，所述由纤维素酶和纤维素组成的混合物或由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物中几乎不含葡萄糖苷酶。
所述全细胞催化反应的反应体系中还含有聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
其中，所述聚磷酸葡萄糖激酶可通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理的方式进行添加；也可直接将购买的聚磷酸葡萄糖激酶添加到全细胞催化反应的反应体系中；优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶采用通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理的方式进行添加。
所述纤维素衍生物包括纤维素经过预处理后的产物；优选的，所述纤维素衍生物选自纤维多糖或纤维二糖。
在建立全细胞催化反应体系时，可以将透性化处理后的菌体或相应替换这些菌体的纯酶以及它们的混合物和底物采用同时加入或先后加入的方式建立全细胞催化反应体系，优选为采用同时加入的方式建立全细胞催化反应体系。
本发明进一步提供了另一种从蔗糖利用利用全细胞催化制备塔格糖的方法，包括以下步骤：
(1)将含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的质粒转入大肠杆菌工程菌中获得转化菌株；(2)诱导转化菌株产酶后,对菌体进行透性化处理；(3)透性化处理后的菌体混合后与蔗糖和无机磷酸根离子一同建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，即得。
其中，步骤(1)可以将蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因各自转入大肠杆菌工程菌中分别获得5个转化菌株；或者是将蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因以任意排列组合方式共转入一个大肠杆菌工程菌中获得1个转化菌株；还可以是将蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的大肠杆菌工程菌中获得两个或两个以上的转化菌株。
为了达到更好的效果，优选的，将全细胞催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化，得到高纯度的塔格糖产品。
所述全细胞催化反应的反应体系中还包括：葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
其中，所述葡萄糖异构酶以及聚磷酸葡萄糖激酶可通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理的方式进行添加；也可直接将购买的：葡萄糖异构酶或聚磷酸葡萄糖激酶直接添加到全细胞催化反应的反应体系中；优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶采用通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理的方式进行添加。
其中，在建立全细胞催化反应体系时，可以将透性化处理后的菌体或相应替换这些菌体的纯酶以及它们的混合物和底物采用同时加入或先后加入的方式建立全细胞催化反应体系，优选为采用同时加入的方式建立全细胞催化反应体系。
本发明方法利用全细胞催化制备塔格糖，具有成本低，污染低，塔格糖产率高等优点，适合规模化生产塔格糖。
附图说明
图1反应产物的HPLC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1从淀粉制备塔格糖
(1)分别构建含有α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒分转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理：
在本实施例中，α-葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM1168；葡萄糖磷酸变位酶也来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶来源于Clostridium thermocellum，基因在KEGG上的编号为Cthe0217；6-磷酸塔格糖差向异构酶来自于Thermoanaerobacter indiensis，基因所编码的酶在NCBI上的编号为WP_019907213.1；6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于Archaeoglobusfulgidus，基因在KEGG上的编号为AF_0444，这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这五个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并克隆至pET20b载体((Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TmαGP、pET20b-TmPGM、pET20b-CtPGI、pET20b-TiT6E和pET20b-AfT6P。这五个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中并发酵获得表达相应酶的全细胞。
本实施例采取的透性化处理的方式是热处理。收集含有酶的全细胞，利用10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)洗一次细胞，弃上清，重新加入10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)重悬细胞。重悬好的细胞在75℃处理15分钟，即完成细胞透性化处理。
(2)将经过透性化处理的菌体混合在一起后加入无机磷酸根以及淀粉等进行全细胞催化反应：
在一个1.0毫升的反应体系中含有10mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达α-葡聚糖磷酸化酶的细胞用量为0.14g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.08g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞用量为0.08g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，15g/L的可溶性淀粉，在70℃进行催化反应，反应46个小时。
根据保持时间的不同，HPLC可以用来区分反应液中的塔格糖、葡萄糖、1-磷酸葡萄糖或6-磷酸葡萄糖；并且可以对塔格糖进行定量，塔格糖的浓度与HPLC中塔格糖特征峰的强度是成正比的；HPLC的流动相为5mM的稀硫酸。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是8g/L(图1)，转化率为53％。
实施例2从淀粉制备塔格糖
(1)分别构建含有α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因、淀粉去分支酶的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理：
在本实施例中，淀粉去分支酶来源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的编号为ST0928。基因组DNA可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。该基因通过PCR获取，并克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-StIA。将质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并发酵获得表达相应酶的全细胞。麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284，淀粉酶从Sigma公司购买，产品编号为A3306。其他酶对应的重组质粒的构建方法、酶的表达和细胞透性化处理的方法同实施例1。
(2)在一个1.0毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达α-葡聚糖磷酸化酶的细胞用量为1.4g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为5g DCW/mL，所述表达淀粉去分支酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，，150g/L的可溶性淀粉，在70℃进行催化反应，反应24小时后，再加入10U/mL麦芽糖磷酸化酶和0.1U/ml的α淀粉酶，在50℃处理4-6小时后，再把温度提高到70℃反应，总共反应72个小时。反应结束后，最终塔格糖的终浓度是109g/L，转化率为72.6％。
(3)将催化反应产物分离、纯化，即得高纯度的塔格糖。
实施例3从淀粉制备塔格糖
(1)分别构建含有α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因、淀粉去分支酶、葡聚糖转移酶、聚磷酸葡萄糖激酶的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理：
在本实施例中，聚磷酸葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的编号为Tfu1811。葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的编号为OCC_10078。基因组DNA可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这两个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-TfuPPGK和pET20b-Tl4GT，这两个质粒分别转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并发酵获得表达相应酶的全细胞。其他酶对应的重组质粒的构建方法、酶的表达和细胞透性化处理的方法同实施例1和实施例2。
(2)在一个1.0毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达α-葡聚糖磷酸化酶的细胞用量为1.4g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为5g DCW/mL，所述表达淀粉去分支酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，150g/L的可溶性淀粉，在70℃进行催化反应，反应24小时后，加入0.8g DCW/mL的表达葡聚糖转移酶的细胞后，继续在70℃反应12个小时，再加入0.8g DCW/mL的表达聚磷酸葡萄糖激酶的细胞和50mM的焦磷酸钠，在50℃处理4-6小时后，再把温度提高到70℃反应，总共反应72个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是132g/L，转化率为88％。
(3)将催化反应产物分离、纯化，即得高纯度的塔格糖。
实施例4从纤维素制备塔格糖
(1)分别构建含有纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒分别转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理：
纤维多糖磷酸化酶(Cthe_2989)和纤维二糖磷酸化酶(Cthe_0275)都是来源于Clostridium thermocellum。基因组DNA信息可从ATCC的官方网站(www.atcc.org/)上获得。通过PCR将基因克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-CthCDP和pET20b-CthCBP。这两个质粒分别转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并发酵获得表达相应酶的全细胞。其他酶对应的重组质粒的构建方法、酶的表达和细胞透性化处理的方法同实施例1。
(2)纤维素酶和纤维素组成的混合物的制备：所述纤维素酶购买于sigma公司，产品编号为C2730。所述纤维素和纤维素酶的制备方法为：将纤维素和纤维素酶混合后离心，去上清，得到由纤维素酶和纤维素组成的混合物。
在一个1.0毫升的反应体系中含有10mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达纤维多糖磷酸化酶的细胞用量为0.4g DCW/mL，所述表达纤维二糖磷酸化酶的细胞用量为0.4g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.08g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞用量为0.08g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，10g/L的纤维素及纤维素酶混合物，在70℃进行催化反应，反应48个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是1.6g/L，转化率为16％。
实施例5从纤维素制备塔格糖
(1)分别构建含有纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理
所述纤维素衍生物和纤维素酶的制备方法为：将纤维素衍生物和纤维素酶混合后离心，去上清，得到由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物。其他酶对应的重组质粒的构建方法、酶的表达和细胞透性化处理的方法同实施例1、实施例3和实施例4。
(2)将这些经过透性化处理的菌体混合并加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸钠再加入由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物，并添加无机磷酸根进行全细胞催化反应：
在一个1.0毫升的反应体系中含有10mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达纤维多糖磷酸化酶的细胞用量为0.4g DCW/mL，所述表达纤维二糖磷酸化酶的细胞用量为0.4g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.08g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞用量为0.08g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，10g/L的纤维素及纤维素酶混合物，反应24小时后，加入0.8g DCW/mL的表达聚磷酸葡萄糖激酶的细胞和10mM的焦磷酸钠，在50℃处理4-6小时后，再把温度提高到70℃反应，总共反应48个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是3.4g/L，转化率为34％。
(3)将催化反应产物分离、纯化，即得高纯度的塔格糖。
实施例6从蔗糖制备塔格糖
(1)分别构建含有蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒分别转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理：蔗糖磷酸化酶是来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumJW/SL-YS485，该基因所编码的酶在NCBI数据库的编号是WP_015312040.1。将该基因通过PCR克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-SP。这个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并发酵获得表达相应酶的全细胞。其他酶对应的重组质粒的构建方法、酶的表达和细胞透性化处理的方法同实施例1；
(2)将这些经过透性化处理的菌体混合后再加入无机磷酸根以及蔗糖进行全细胞酶催化反应：
在一个1.0毫升的反应体系中含有10mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达蔗糖磷酸化酶的细胞用量为0.4g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.08g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞用量为0.08g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为0.5g DCW/mL，10g/L的蔗糖，在37℃进行催化反应，反应48个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是4.5g/L，转化率为45％。
实施例7从蔗糖制备塔格糖
(1)分别构建含有蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的原核表达质粒；将所构建的原核表达质粒转入大肠杆菌工程菌中获得重组菌株；诱导重组菌株表达产酶后进行透性化处理，
葡萄糖异构酶购自sigma公司，产品编号为G4166。其他酶对应的重组质粒的构建方法、酶的表达和细胞透性化处理的方法同实施例1、实施例3和实施例6。
(2)将这些经过透性化处理的菌体混合并加入葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸钠，再加入无机磷酸根以及蔗糖进行全细胞催化反应：
在一个1.0毫升的反应体系中含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子，所述表达蔗糖磷酸化酶的细胞用量为4g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸变位酶的细胞的用量为0.8g DCW/mL，所述表达葡萄糖磷酸异构酶的细胞用量为0.8g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的细胞的用量为5g DCW/mL，所述表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的细胞的用量为5g DCW/mL，所述表达聚磷酸葡萄糖激酶的全细胞的用量为0.8g DCW/mL，所述葡萄糖异构酶的用量为10U/mL，50mM聚磷酸钠，100g/L的蔗糖，在50℃进行催化反应，反应72个小时。
反应结束后，最终塔格糖的终浓度是89g/L,转化率是89％。
(3)将催化反应产物分离、纯化，即得高纯度的塔格糖。
Claims (13)
1.一种从淀粉或其衍生物利用全细胞催化制备塔格糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因各自转入大肠杆菌工程菌中分别获得5个转化菌株；或者是将α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因以任意排列组合方式共转入一个大肠杆菌工程菌中获得1个转化菌株；或者是将α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因以及6-磷酸塔格糖磷酸酶基因按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的大肠杆菌工程菌中获得两个或两个以上的转化菌株；(2)诱导转化菌株产酶后,对菌体进行透性化处理；所述透性化处理是热处理；(3)透性化处理后的菌体混合在一起后与无机磷酸根以及淀粉或淀粉衍生物建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，即得塔格糖；
所述淀粉衍生物选自部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精或麦芽多糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，任何一种透性化处理后的菌体被相应的纯化的酶替换。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应的反应体系中还有以下(1)或(2)的多酶混合物中的任何一种：
(1)淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶和α淀粉酶；
(2)淀粉去分支酶、葡聚糖转移酶和α淀粉酶；
所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述全细胞催化反应的反应体系中还有聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐为聚磷酸钠；所述聚磷酸葡萄糖激酶是通过构建基因工程菌，随后经过透性化处理来进行添加。
5.一种从纤维素及其衍生物利用全细胞催化制备塔格糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因各自转入大肠杆菌工程菌中分别获得6个转化菌株；或者是将纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因以任意排列组合方式共转入一个大肠杆菌工程菌中获得1个转化菌株；或者是将纤维多糖磷酸化酶基因、纤维二糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的大肠杆菌工程菌中获得两个或两个以上的转化菌株；(2)诱导转化菌株产酶后,对菌体进行透性化处理；(3)透性化处理的菌体混合在一起后与由纤维素酶和纤维素组成的混合物或者由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物并添加无机磷酸根建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，即得塔格糖；所述纤维素衍生物选自纤维多糖或纤维二糖。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，任何一种透性化处理后的菌体被相应的纯化的酶替换。
7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述由纤维素酶和纤维素组成的混合物的制备方法包括：将纤维素和纤维素酶混合后离心、去上清，得到由纤维素酶和纤维素组成的混合物；
所述由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物的制备方法包括：将纤维素衍生物和纤维素酶混合后离心，去上清，得到由纤维素酶和纤维素衍生物组成的混合物。
8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述全细胞催化反应的反应体系中还有聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐为聚磷酸钠。
9.一种从蔗糖利用全细胞催化制备塔格糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因各自转入大肠杆菌工程菌中分别获得5个转化菌株；或者是将蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因以任意排列组合方式共转入一个大肠杆菌工程菌中获得1个转化菌株；或者是将蔗糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的大肠杆菌工程菌中获得两个或两个以上的转化菌株；(2)诱导转化菌株产酶后,对菌体进行透性化处理；(3)透性化处理后的菌体混合后与蔗糖以及无机磷酸根建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，即得塔格糖。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，任何一种透性化处理后的菌体相应的被纯化的酶替换。
11.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：所述全细胞催化反应的反应体系中还有葡萄糖异构酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐为聚磷酸钠。
12.按照权利要求1、5或9所述的方法，其特征在于：透性化处理后的菌体或相应替换这些菌体的纯酶以及它们的混合物和底物采用同时加入或先后加入的方式建立全细胞催化反应体系。
13.按照权利要求12所述的方法，其特征在于，采用同时加入的方式建立全细胞催化反应体系。
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