CN112760316B - 人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种基于人工油体固定化多酶及其在塔格糖制备中的应用。本发明利用人工油体将表达的目标蛋白酶‑油体蛋白的融合蛋白与油体混合，超声处理，通过人体蛋白的特异疏水性将融合蛋白锚定到油体表面，形成含有目标蛋白酶的人工油体，从而实现酶的纯化和固定化同步完成。本发明提供的一种可用于塔格糖生产的固定化多酶，首次采用人工油体作为固定化酶基质，显著提高固定化酶的稳定性，降低了当前酶法制备塔格糖的生产成本，且制备工艺简单。

Description

人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法
技术领域
本发明涉及一种以基因工程领域，具体涉及酶蛋白的表达以及制备固定化多酶生产塔格糖的方法。
背景技术
目前塔格糖主流生产方法是经过半乳糖异构化、脱盐、脱色、分离、浓缩、结晶等步骤制成塔格糖纯品。然而，这种方法也存在缺陷，半乳糖不能完全转化为塔格糖，最终产物是半乳糖和塔格糖的混合物，导致塔格糖分离工艺复杂，转化率低，分离成本高昂，同时原料半乳糖的价格并不低廉，最终塔格糖的生产成本高昂。(Rhimi M, Aghajari N, Juy M,Chouayekh H, Maguin E, Haser R, Bejar S: Rational design of Bacillusstearothermophilus US100l-arabinose isomerase: Potential applications for d-tagatose production. Biochim. 2009, 91:650-653. Oh H-J, Kim H-J, Oh D-K:Increase in d-tagatose production rate by site-directed mutagenesis of l-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnol. Lett.2006, 28:145-149. Bosshart A, Hee CS, Bechtold M, Schirmer T, Panke S:Directed divergent evolution of a thermostable D-tagatose epimerase towardsimproved activity for two hexose substrates. ChemBioChem 2015,16:592-601.) 韩国CJ公司和中国科学院天津工业生物技术研究所均开发了一种体外多酶新路线合成塔格糖（WO2018004310A1，CN 109790524 A，CN107988286A，CN109666620A）。该塔格糖体外多酶合成新路线可以淀粉、麦芽糊精、蔗糖为原料，通过多步酶催化反应合成塔格糖，从根本上改变了现有异构化生产塔格糖的生产工艺。但是，该合成新路线涉及多个酶分子，酶分子需要经过繁琐的提取和纯化才能用于催化反应，导致酶的生产成本昂贵；而且生物酶是一种水溶性分子，在催化反应结束后水溶性酶分子难以回收再利用，造成酶的浪费。这些因素导致塔格糖合成新路径的生产成本较高昂，亟需开发一种多酶固定化方法，固定化塔格糖合成新路径中的多酶，使其能够重复利用，降低生产成本。
油体是植物种子尤其是油料植物种族的重要贮脂细胞器，油体结构模型是由单分子磷脂层和嵌于其内的油体结合蛋白包裹液态基质三酰甘油形成的弹性球体或椭球体，具有显著的物理稳定性和化学稳定性。油体在蛋白表达、纯化和固定化，益生菌、生物活性物质的包埋，作为乳化剂使用等生物技术领域得到了广泛的开发和应用。人工油体是在体外将主要成分三酰甘油、磷脂和油体蛋白按照一定比例混合，重新组合而成的稳定油体。人工油体的工艺流程如下：首先构建重组油体蛋白-目标蛋白表达载体，然后在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达重组融合蛋白；再将菌体破碎，离心收集沉淀，最后将其与磷脂和三酰甘油重组成人工油体。
通过构建人工油体，可将蛋白纯化、固定化和复性等多个步骤可通过简单的一步同时实现，能够避免传统蛋白质固定化过程中蛋白的纯化步骤，从而节省蛋白固定化时间和降低蛋白固定化的成本。目前，人们已利用该方法固定化了重组纤维素酶（Chiang C J,Chen P T, Yeh C Y, et al.A useful method integrating production andimmobilization of recombinant cellulose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013,97 (20 ): 9185-9192．）、脂肪酶（CN102321693A）、阿洛酮糖差向异构酶（Immobilizationof Clostridium cellulolyticumd-Psicose 3-Epimerase on Artificial Oil Bodies,J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 28, 6771–6776）等。
综上，人工油体固定化多酶将是研究的重点，仍然需要寻找或者建立人工油体应用于多酶共固定化策略，从而建立利用人工油体固定化多酶催化生产塔格糖的新技术，在提升级联催化反应的催化效率的同时，降低酶催化生产成本。
发明内容
虽然人工油体应用于固定化单酶具有成本低廉，工艺简单，固定化酶的稳定性及重复利用性得到显著提高等优点，但将人工油体固定化单酶应用于酶级联催化反应生产塔格糖体系将存在严重的缺陷。经过本发明人研究发现，多酶催化生产塔格糖途径涉及5种不同酶分子，将5种酶分别固定化混合后用于催化反应，存在严重的底物/产物传质问题，上游产物很难被下游固定化酶快速捕捉，造成级联催化反应的催化效率极大的降低。因而，本发明提出将5种酶共固定化以用于催化反应效果得到了大大的提高。
因此，本发明的目的在于降低固定化酶级联催化反应中严重的底物/产物传质问题，提高固定化多酶级联催化反应的催化效率。利用人工油体共固定化塔格糖生产过程中的5个酶分子，按照特定比例混合5种酶分子通过人工油体同步实现多酶的纯化和固定化。人工油体共固定化多酶避免了酶单独固定化引起的传质问题，提高了多酶级联催化效率，增强多酶体系的稳定性及循环使用效果。该发明提供了一种全新的酶固定化技术用于塔格糖的生产，降低了当前酶法制备塔格糖的生产成本，制备工艺简单。
本发明提供一种人工油体固定化酶，其特征在于，将α-葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白和6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白混合后与油体，磷脂混合超声处理，离心收集上层物质即为人工油体固定化酶。
在具体实施方式中，通过基因工程的方法将油体蛋白基因分别与各酶的基因构建形成表达载体，转化重组菌并表达获得各个融合蛋白。
在具体实施方式中，所述油体蛋白基因是芝麻的olesion 蛋白基因，大豆的olesion 蛋白基因，花生的olesion 蛋白基因。更具体地，所述的油体蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在具体实施方式中，所述的各种酶是耐热型的，即耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶。相对于不耐热的常温酶来说，采用耐热的酶在菌株灭活方面具有优势，即后者在发酵结束后可以通过加热处理的方式将菌株灭活，而同时塔格糖合成相关的酶仍保持活性，从而能够将灭活的菌株混合用来生产塔格糖，更适于工业应用。
具体地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将淀粉磷酸化为葡萄糖-1-磷酸（G1P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、 Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热α-葡聚糖磷酸化酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima。
具体地，耐热葡萄糖磷酸变位酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-1-磷酸（G1P）变位为葡萄糖-6-磷酸（G6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸变位酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸变位酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于Pyrococcus furiosus。
具体地，耐热葡萄糖磷酸异构酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-6-磷酸（G6P）变位为果糖-6-磷酸（F6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、 Clostridium thermocellum、Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于Thermus thermophilus。
具体地，耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有果糖-6-磷酸（F6P）异构为塔格糖-6-磷酸（T6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、 Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、 Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐6-磷酸塔格糖4位差向异构酶来源于Caldicellulosiruptor kronotskyensis。
具体地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有塔格糖-6-磷酸（T6P）脱掉磷酸基团为产物塔格糖（Tagatose）功能的酶。进一步优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、 Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、 Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的6-磷酸塔格糖磷酸酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于Archaeoglobus fulgidus。
在优选实施方式中，葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白：α-葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白：葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白按(1-2): (1-2): (1-2):(2-4): (2-4)的质量比混合。
优选地，所述油体是甘油三酯或含有甘油三酯的动植物油；所述磷脂是如来源于动物磷脂，具体如卵磷脂，脑磷脂或心磷脂等。
在优选实施方式中，将融合蛋白的总量与甘油三酯按照质量比为0.5-3:1进行混合，甘油三酯与卵磷脂按照质量比为100:1进行混合，再利用超声处理样品。
在优选实施方式中，所述超声处理的功率20-30%，处理时间5-15分钟；所述离心是于8000-12000 rpm/min下离心5-15 min。
本发明还提供所述的人工油体固定化酶在制备塔格糖中的应用。
具体实施方式中，以淀粉或淀粉衍生物为原料，利用所述人工油体固定化多酶，通过酶催化转化法制备塔格糖。更具体步骤为：取淀粉或淀粉衍生物50~150 g/L，pH值为6.0~7.0的HEPES缓冲液80~120 mM，无机磷酸根8~12 mM，二价镁离子3~7 mM，锌离子或锰离子0.3~0.7 mM，去分支酶3~7 U/ml，所述人工油体固定化多酶1~5 mg/ml，在40~70℃进行酶催化转化反应，收集生成的塔格糖。
进一步地，在反应结束后进行固液分离，收集所述人工油体固定化多酶，循环利用于制备塔格糖，例如可以循环利用所述人工油体固定化多酶2~20次。
本发明采用人工油体共固定化多酶，避免了多酶级联催化反应中由于固定化单酶混合使用带来的传质问题，实现了多酶的纯化和固定化的同步进行，简化了固定化酶的制备工艺；人工油体作为固定化酶的基质，不仅成本低廉，而且提高了固定化酶的稳定性；人工油体固定化多酶用于塔格糖生产反应后经过简单的处理后可循环利用，降低生产成本。
附图说明
图1 质粒构建模式图。
图2 融合蛋白SDS-PAGE电泳分析。其中，泳道M为蛋白marker；泳道1-3为葡聚糖磷酸化酶细胞总蛋白、超声上清、超声沉淀；泳道4-6为葡萄糖磷酸变位酶细胞总蛋白、超声上清、超声沉淀；泳道7-9为葡萄糖磷酸异构酶细胞总蛋白、超声上清、超声沉淀；泳道10-12为6磷酸塔格糖4位差向异构酶细胞总蛋白、超声上清、超声沉淀；13-15为6磷酸塔格糖磷酸酶细胞总蛋白、超声上清、超声沉淀。
图3 人工油体固定化酶制备流程。
图4人工油体固定化葡聚糖磷酸化酶活性检测。
图5人工油体固定化葡萄糖磷酸变位酶活性检测。
图6人工油体固定化葡萄糖磷酸异构酶活性检测。
图7人工油体固定化6-磷酸塔格糖4位差向异构酶活性检测。
图8人工油体固定化6-磷酸塔格糖磷酸酶活性检测。
图9人工油体固定化单酶混合反应生产塔格糖。
图10 人工油体固定化多酶生产塔格糖浓度检测。
图11人工油体固定化多酶循环使用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式和实施例对本发明作进一步的说明。本领域技术人员可以借鉴本文内容，可以适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1构建表达载体及融合蛋白表达
1、构建表达载体
利用基因重组技术分别将葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白和6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白基因构建于表达载体上。
在本实施例中，首先通过基因合成的方式将来源于芝麻的olesion 蛋白（NCBIReference Sequence: XP_011076526.1）前140氨基酸编码基因进行密码子优化后（SEQ IDNO.1），合成至载体pET20b载体(酶切位点为NdeI和XhoI)，获得pET20b-olesion。随后，将来源于Thermotoga maritima的α-葡聚糖磷酸化酶，基因在KEGG上的编号为TM1168；来源于Pyrococcus furiosus的葡萄糖磷酸变位酶，基因在KEGG上的编号为PF0588；来源于Thermus thermophilus葡萄糖磷酸异构酶，基因在KEGG上的编号为TTHA0277；来源于Caldicellulosiruptor kronotskyensis的6-磷酸塔格糖4位差向异构酶，基因所编码的酶在KEGG上的编号为Calkro_0564；来源于Archaeoglobus fulgidus的6-磷酸塔格糖磷酸酶，基因在KEGG上的编号为AF_0444，这五个基因采用基因合成的方式获得，并克隆至pET20b-olesion载体中，获得相应的表达载体pET20b-TmαGP-olesion、pET20b-pfuPGM-olesion、pET20b-TtcPGI-olesion、pET20b-CkTPE-olesion和pET20b-AfTPP-olesion。其质粒构建示意图如图1所示。
2、表达融合蛋白
将上述质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen ,Carlsbad ,CA)中，挑取单克隆进行发酵培养，当其OD600 = 0.8-1.0时，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG，200 mM/L）诱导使其大量表达融合蛋白。收集菌液，6000 rpm/min 转速下离心菌液10分钟，再用0.9%氯化钠溶液洗涤菌体，收集菌体后进行超声破碎（功率50%；破碎时间10 min），离心收集沉淀，得到融合蛋白。获得的融合蛋白通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质电泳分析。结果如图2所示。
实施例2 人工油体固定化单酶及其酶活检测
1、人工油体固定化葡聚糖磷酸化酶
依照图3所示的制备流程构建本发明的人工油体固定化葡聚糖磷酸化酶。
将实施例1中所制得的葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白（100 mg）加入至一试管中，添加75 mg 甘油三酯，750 ug 卵磷脂，再利用超声处理样品（功率20-30%），10 min后10000 rpm/min离心，收集上层白色物质即为人工油体固定化葡聚糖磷酸化酶。
2、人工油体固定化葡萄糖磷酸变位酶：方法与上述第1点的步骤相同，与其不同的是：所固定化的酶由葡聚糖磷酸化酶变为葡萄糖磷酸变位酶。
3、人工油体固定化葡萄糖磷酸异构酶：方法与上述第1点的步骤相同，与其不同的是：所固定化的酶由葡聚糖磷酸化酶变为葡萄糖磷酸异构酶。
4、人工油体固定化6-磷酸塔格糖4位差向异构酶：方法与上述第1点的步骤相同，与其不同的是：所固定化的酶由葡聚糖磷酸化酶变为6-磷酸塔格糖4位差向异构酶。
5、人工油体固定化6-磷酸塔格糖磷酸酶：方法与上述第1点的步骤相同，与其不同的是：所固定化的酶由葡聚糖磷酸化酶变为6-磷酸塔格糖磷酸酶。
6、人工油体固定化单酶的酶活检测
分别采用本实施例上述制备的各个固定化单酶，通过如下方法制备塔格糖：
取淀粉10 g/L，pH值为6.5的HEPES缓冲液100 mM，无机磷酸根40 mM，二价镁离子5mM，锌离子或锰离子0.5 mM，去分支酶1 U/ml，葡聚糖磷酸化酶0.1 g/L，葡萄糖磷酸变位酶0.1 g/L，葡萄糖磷酸异构酶0.1 g/L，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶0.2 g/L，6-磷酸塔格糖磷酸酶0.2 g/L，在70℃下进行反应，通过高效液相色谱对塔格糖的浓度进行检测。其中上述实施例固定化单酶的酶活检测时，分别采用本实施例上述制备的各个固定化单酶替代各自对应的游离酶进行活性检测，其中固定化葡聚糖磷酸化酶0.1 g/L，固定化葡萄糖磷酸变位酶 0.1 g/L，固定化葡萄糖磷酸异构酶0.1 g/L，固定化6-磷酸塔格糖4位差向异构酶0.2g/L，固定化6-磷酸塔格糖磷酸酶0.2 g/L。
采用本实施例制备的固定化葡聚糖磷酸化酶进行上述反应，反应1h可生产2.5 g/L塔格糖，反应8h可达到反应平衡，生成5.5g/L塔格糖。采用游离酶反应1h可生产5.0g/L塔格糖，反应5h可达反应平衡，生成7.0g/L塔格糖。相比于游离酶，人工油体固定化葡聚糖磷酸化酶具有50%的初始相对酶活性（图4）。
采用本实施例制备的固定化葡萄糖磷酸变位酶进行上述反应，反应1h可生产5.0g/L塔格糖，反应6h可达到反应平衡，生成7.4g/L塔格糖。采用游离酶反应1h可生产5.0g/L塔格糖，反应5h可达反应平衡，生成7.0g/L塔格糖。相比于游离酶，人工油体固定化葡萄糖磷酸变位酶具有100%的初始相对酶活性（图5）。
采用本实施例制备的固定化葡萄糖磷酸异构酶进行上述反应，反应1h可生产5.7g/L塔格糖，反应8h可达到反应平衡，生成7.5g/L塔格糖。采用游离酶反应1h可生产5.0g/L塔格糖，反应5h可达反应平衡，生成7.0g/L塔格糖。相比于未固定化酶，人工油体固定化葡萄糖磷酸异构酶具有114%的初始相对酶活性（图6）。
采用本实施例制备的固定化6-磷酸塔格糖4位差向异构酶进行上述反应，反应1h可生产5.5 g/L塔格糖，反应5h可达到反应平衡，生成6.6 g/L塔格糖。采用游离酶反应1h可生产5.0 g/L塔格糖，反应5h可达反应平衡，生成7.0g/L塔格糖。相比于游离酶，人工油体固定化6-磷酸塔格糖4位差向异构酶具有110%的初始相对酶活性（图7）。
采用本实施例制备的固定化人工油体固定化6-磷酸塔格糖磷酸酶进行上述反应，反应1h可生产4.5 g/L塔格糖，反应5h可达到反应平衡，生成6.8 g/L塔格糖。采用游离酶反应1h可生产5.0g/L塔格糖，反应5h可达反应平衡，生成7.0g/L塔格糖。相比于游离酶，人工油体固定化6-磷酸塔格糖磷酸酶具有90%相对酶活性（图8）。
实施例3 人工油体固定化单酶混合反应生产塔格糖
采用实施例2提供的各个固定化单酶，通过如下方法制备塔格糖：
取淀粉100 g/L，pH值为6.5的HEPES缓冲液100 mM，无机磷酸根40 mM，二价镁离子5 mM，锌离子或锰离子0.5 mM，去分支酶5 U/ml，将实施例2制备的各个固定化单酶进行混合，其中，葡聚糖磷酸化酶0.1 g/L，葡萄糖磷酸变位酶 0.1 g/L，葡萄糖磷酸异构酶0.1 g/L，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶0.2 g/L，6-磷酸塔格糖磷酸酶0.2 g/L，在70℃下进行反应，通过高效液相色谱对塔格糖的浓度进行检测。
结果如图9所示，反应2h后，塔格糖生产浓度为14g/L,反应进行12 h后，生产塔格糖反应趋于平衡，其塔格糖生产浓度为50 g/L。
实施例4 人工油体固定化多酶生产塔格糖
将实施例1中所制得的五种融合蛋白（100 mg）按照葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白：葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白：葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白=1:1:1:2:2的质量比，加入至一试管中，添加75 mg甘油三酯，750 ug卵磷脂，再利用超声处理样品（功率20-30%），10分钟后10000 rpm/min离心，收集上层白色物质即为人工油体固定化多酶。
采用该实施例提供的固定化多酶，通过如下方法制备塔格糖：
取淀粉100 g/L，pH值为6.5的HEPES缓冲液100 mM，无机磷酸根40 mM，二价镁离子5 mM，锌离子或锰离子0.5 mM，去分支酶5 U/ml，该实施例提供的固定化多酶混合，其中所述固定化酶的用量是使得各酶在反应体系中按浓度计分别为：葡聚糖磷酸化酶0.1 g/L，葡萄糖磷酸变位酶 0.1 g/L，葡萄糖磷酸异构酶0.1 g/L，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶0.2g/L，6-磷酸塔格糖磷酸酶0.2 g/L（由于制备固定化多酶时，加入的酶量会全部被固定）。在70℃下进行反应，通过高效液相色谱对塔格糖的浓度进行检测。
如图10所示，经高效液相色谱检测分析，反应2h后，塔格糖的生产浓度为21g/L,反应进行12 h后，生产塔格糖反应达到反应平衡，其塔格糖生产浓度为70 g/L。相比于实施例2，实施例3具有更高的初始塔格糖生产速度和更高的塔格糖生产浓度。
实施例5 人工油体固定化多酶循环使用
通过实施例4提供的方法制备塔格糖后，进行固液分离，收集固定化多酶，循环利用于制备塔格糖。通过高效液相色谱对每次循环过程中产生的塔格糖的浓度进行检测，结果以相对塔格糖生产浓度表示，将第一次循环反应产生的塔格糖浓度设定为100%。结果如图11所示，人工油体固定化多酶循环使用20次后仍能维持50%的相对酶活性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaatggcag atattggtag cgaatttcac atgtggatct ataatagcgt tccgacctgc 60
aaaccgaatt ggattaagag caatcagcat aatccgaccc gtgccccgaa tccgagtagc 120
accattcaga gctgtctggc cggtattggc catctgcaga ttcgcccgaa acagacctgt 180
ccgcagcgca gtccgagtgc actgcatgcc acctttgcct gttatagcct gcagcatgtt 240
accccgccgc cgccgcatcc gacccctcct cctcctccac cgccgttaca gcagcagacc 300
cgcgcccctc atctgcagct gcagccgcgt gcacagcgcg ttgttaaagc cgccaccgcc 360
gttaccgccg gtggcagctt actggtgctg agcggtctga ccctggcagg taccgtgatt 420
gcactgacca ttgcaacccc gctgctggtt 450

Claims (14)

1.一种人工油体固定化酶，其特征在于，将α-葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白和6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白混合后与油体，磷脂混合超声处理，离心收集上层物质即为人工油体固定化酶。
2.根据权利要求1所述的人工油体固定化酶，其特征在于，通过基因工程的方法将油体蛋白基因分别与各酶的基因构建形成表达载体，转化重组菌并表达获得各个融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的人工油体固定化酶，其特征在于，所述油体蛋白基因是芝麻的olesion 蛋白基因，大豆的olesion 蛋白基因，花生的olesion 蛋白基因。
4.根据权利要求3所述的人工油体固定化酶，其特征在于，所述的油体蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的人工油体固定化酶，其特征在于，所述各酶基因编码的酶是耐热型酶。
6.根据权利要求5所述的人工油体固定化酶，其特征在于，所述各酶基因来源于Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、 Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus。
7.根据权利要求1所述的人工油体固定化酶，其特征在于，α-葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白：葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白：葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白按(1-2): (1-2): (1-2): (2-4): (2-4)的质量比混合。
8.根据权利要求1所述的人工油体固定化酶，其特征在于，所述油体是甘油三酯。
9.根据权利要求8所述的人工油体固定化酶，其特征在于，将融合蛋白的总量与甘油三酯按照质量比为0.5-3:1进行混合，甘油三酯与卵磷脂按照质量比为100:1进行混合，再利用超声处理样品。
10.根据权利要求1所述的人工油体固定化酶，其特征在于，所述超声处理的功率20-30%，处理时间5-15分钟；所述离心是于8000-12000 rpm/min下离心5-15 min。
11.如权利要求1至10任一项所述的人工油体固定化酶在制备塔格糖中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，以淀粉或淀粉衍生物为原料，利用所述人工油体固定化多酶，通过酶催化转化法制备塔格糖。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，具体步骤为：取淀粉或淀粉衍生物50~150g/L，pH值为6.0~7.0的HEPES缓冲液80~120 mM，无机磷酸根8~12 mM，二价镁离子3~7 mM，锌离子或锰离子0.3~0.7 mM，去分支酶3~7 U/ml，所述人工油体固定化多酶1~5 mg/ml，在40~70℃进行酶催化转化反应，收集生成的塔格糖。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，在反应结束后进行固液分离，收集所述人工油体固定化多酶，循环利用于制备塔格糖。
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