CN113249372B - 一种用于甘露糖生产的固定化细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产甘露糖的固定化细胞制备方法及其用于生产甘露糖的方法。其中本发明的固定化枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，连续催化25批次后，产物得率仍可维持45%。本发明的固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，连续催化25批次后，产物得率仍可维持44%。本发明简化了酶分离纯化步骤，提高酶回收利用率，实现了酶的循环使用。本发明的方法具有易于产品分离，生产工艺简单，成本低廉等优点，为工业化应用提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及甘露糖的生产制备领域。
背景技术
甘露糖是一种六碳糖，是葡萄糖的同分异构体。甘露糖具有调节免疫、抵御细菌和病毒侵染、促进体内糖蛋白合成、抗癌等作用。因此，甘露糖被广泛应用于生物学和医学领域。甘露糖不仅可作为合成某些医药化工原料和重要糖类药物前体的原材料，而且可用于食品及饮料的甜味剂。近年来，甘露糖在功能食品、饲料添加剂及医药领域需求显著增加，具有巨大的经济开发价值。
工业生产甘露糖的方法主要为提取法和异构法。提取法主要是以椰子壳或象牙棕榈子等为原料，通过酸性水解得到含有甘露糖的混合糖液，这种方法原料成分复杂，导致分离纯化工艺成本高，工艺中使用大量的稀酸及有机溶剂易造成环境污染等问题 (Fan, S.-P., et al., High yield production of sugars from deproteinated palm kernelcake under microwave irradiation via dilute sulfuric acid hydrolysis.Bioresource Technology, 2014. 153(0): 69-78. Saari, P. and M. Hurme, ProcessSynthesis Principles in the Chromatographic Separation of Sugars from BiomassHydrolysates. Chemical Engineering & Technology, 2011. 34(2): 282-288.) 。异构法主要是以葡萄糖或果糖为原料经过化学异构或酶法异构制备，这种方法受到热力学的限制，导致转化率低，分离工艺复杂 (Kockritz, A., et al., Rearrangement of glucoseto mannose catalyzed by polymer-supported Mo catalysts in the liquid phase.Applied Catalysis A: General, 2008. 334(1-2): 112-118. Park, C.S., et al.,Mannose production from fructose by free and immobilized D-lyxose isomerasesfrom Providencia stuartii. Biotechnol Lett, 2010. 32(9) 1305-1309.) 。
中国科学院天津工业生物技术研究所申请的专利CN109750011A中公开了一套全新的甘露糖生物合成制备方法，该方法通过构建多酶反应器，转化甲醛、甘油、淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖等廉价碳源合成甘露糖，从根本上改变了现有甘露糖的生产工艺。该多酶合成甘露糖途径不仅打破了提取法合成甘露糖能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，化学污染大的限制；而且克服了异构法转化率低，分离工艺复杂的缺陷。但是该方法中使用的多酶需要从发酵获得的含酶细胞中提取，该过程主要包括菌体收集、重悬、均质、收集上清液、酶分离纯化等一系列繁琐步骤，导致酶的生产较复杂，不易实现规模化生产。同时，游离酶与反应液形成均相混合液，催化反应结束后酶难以回收循环利用，造成酶的回收利用率低，酶成本高。这些问题导致甘露糖生物合成制备方法的生产成本无法进一步降低，无法实现工业化生产。
中国科学院天津工业生物技术研究所授权的专利CN112342179B报道了一种利用枯草芽孢杆菌全细胞催化淀粉生产塔格塘的方法。该方法将透性化处理的枯草芽孢杆菌进行固定化，获得固定化全细胞，然后应用于塔格塘的生产。虽然该方法实现了全细胞的循环使用，降低了生产成本，但是经过研究分析表明该方法在制备固定化细胞时仍然存在一些不足：一是该方法在进行固定化前需要经过菌体收集，菌体重悬以及菌体透性化处理等多个繁琐步骤。二是该方法在透性细胞的基础上进行制粒固定化，而细胞透性化处理易造成胞内表达的异源蛋白的泄漏，进而在固定化进程中导致异源蛋白的损失以及酶固定化效率的降低。三是该方法只是通过简单挤压制粒的方式得到固定化酶颗粒，获得的固定化酶颗粒并非均一的。
因此，亟需在此基础上开发一种可简便获得均匀的固定化细胞的方法，既能简化酶的生产工序；又能避免或降低透性细胞在固定化过程中造成的酶的泄漏和损失，提高酶的固定化效率，实现酶的循环利用，从而降低甘露糖的生产成本，实现甘露糖的工业化生产。
发明内容
针对现有的多酶催化制备甘露糖的方法所存在的问题如酶的生产步骤繁琐、分离纯化复杂、酶回收利用率低，难以循环使用导致甘露糖的生产成本高的问题，本发明的目的在于提供一种固定化细胞生产甘露糖的方法，简化甘露糖生产过程中酶的生产步骤，简便甘露糖制备过程中产品和酶的分离纯化，实现甘露糖的多酶合成新路线中多酶的循环使用，降低甘露糖的生产成本，实现甘露糖的工业化生产。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种用于甘露糖生产的固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
通过发酵分别获得表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、甘露糖6-磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液，将上述发酵液混合得到发醇混合液；
向所述发酵混合液中加入1-10% w/v无机土，搅拌均匀；
再向所述发酵混合液中加入0.1-2% w/v絮凝剂絮凝菌体，随后加入0.05-3% v/v交联剂交联1-4 h；
真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压成长条状，然后采用球形抛丸机将长条状固定化细胞截断成长短均匀的颗粒；
获得的颗粒经沸腾干燥后得到用于甘露糖生产的固定化细胞，其中所述沸腾干燥的进风口温度控制在60-90℃。
对于所述发酵液的制备使用本领域已知的方法进行。发酵可使用任何外源蛋白标的培养基，包括但不限于LB培养基、SR培养基、TB培养基等。
优选地，优选地，α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、甘露糖6-磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸磷酸酶分别是耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸异构酶和耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶。
所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将淀粉磷酸化为葡萄糖-1-磷酸（G1P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、 Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热α-葡聚糖磷酸化酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于Thermococcus kodakarensis。
具体地，耐热葡萄糖磷酸变位酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-1-磷酸（G1P）变位为葡萄糖-6-磷酸（G6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸变位酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸变位酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermococcus kodakarensis。
具体地，耐热葡萄糖磷酸异构酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-6-磷酸（G6P）变位为果糖-6-磷酸（F6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、 Clostridium thermocellum、Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于Thermus thermophilus。
具体地，甘露糖6-磷酸异构酶在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将果糖-6-磷酸（F6P）变位为甘露糖-6-磷酸（M6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热甘露糖6-磷酸异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热甘露糖6-磷酸异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热甘露糖6-磷酸异构酶来源于Geobacillus thermodenitrificans。
具体地，所述甘露糖6-磷酸磷酸酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将甘露糖-6-磷酸（M6P）脱磷转化为甘露糖功能的酶。进一步优选地，所述和甘露糖6-磷酸磷酸酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、 Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热甘露糖6-磷酸异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶来源于Thermotoga maritima。
进一步优选地，分别表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸异构酶和耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的湿菌体的按比例为（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）进行混合，且混合后的菌悬液OD600在10-150之间。
进一步，所述无机土包括但并不限于蒙脱土、硅藻土、高岭土和膨润土等，优选地，所述无机土为硅藻土。
进一步，所述絮凝剂包括但并不限于聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDADMAC）、聚丙烯酰胺等，优选地，所述絮凝剂为聚乙烯亚胺和PDADMAC，优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量为600-70000。
进一步，所述交联剂包括但不限于戊二醛、三羟甲基磷、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、环氧氯丙烷等，优选地，所述交联剂为戊二醛。
所述方法进一步包括将获得的固定化细胞经过筛分得到形态均匀的固定化细胞的步骤。
本发明因此还提供一种固定化细胞生产甘露糖的方法，其特征在于：利用上述固定化细胞将淀粉或淀粉衍生物转化为甘露糖。
进一步地，反应结束后还包括过滤回收固定化细胞的步骤。
在具体实施方式中，其中生物转化反应体系中包含淀粉或淀粉衍生物50-300 g/L，pH值为5.0-8.0的缓冲液，10-50 mM无机磷酸根，3-7 mM二价镁离子和固定化细胞。
进一步，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。所述无机磷酸根可为磷酸钠或磷酸钾。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：所述固定化细胞生产甘露糖的方法，与多酶催化反应相比，不仅简化了酶的生产制备过程，而且克服了多酶与产品的分离困难，有利于产物甘露糖的分离纯化。所述固定化细胞与反应液可通过简单过滤进行分离，与全细胞催化反应相比，更加简化了酶与产品的分离，实现酶的重复使用，有利于提高细胞的利用率，降低甘露糖的生产成本。同时，细胞重复使用，避免了多次发酵产生的环境污染及简化操作步骤。其中，比较重要之处在于，本发明在制备得到表达酶的发酵液混合后，直接将发酵混合液用于制粒，省略发酵液菌体收集，菌体重悬及细胞透性化处理的步骤（省去发酵液菌体回收步骤，简便了固定化过程，提高了过程的可操作性；省去细胞透性化处理步骤）。而采用发酵混合液直接进行固定化，此时细胞的细胞膜或细胞壁几乎没有破损，经过固定化处理后表达的酶几乎不会泄漏，因此能够获得较高的酶固定化效率。而对于本发明在固定化后获得固定化细胞，首先采用旋转挤压制粒机制备出粗细可控的长条，然后用球形抛丸机将制备得到的长条截短成长度均匀的颗粒，再经过沸腾干燥高温干燥处理颗粒（以达到细胞透性化处理的目的），筛分后得到粒径均匀的固定化酶颗粒，如此能更有效的用于甘露糖的生产。其中本发明采用的制粒流程不仅更有利于后面的透性化处理和颗粒的均匀度，而且更能简化前面的菌体收集步骤（如图1所示本发明固定化细胞的具体流程）。经实验表明，本发明获得的效果十分显著，本发明的固定化枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达63%，连续催化25批次后，产物得率仍可维持43%。本发明的固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，连续催化25批次后，产物得率仍可维持44%。
附图说明
图1为本发明固定化细胞的具体流程示意图。
图2为实施例1各酶的SDS PAGE图。其中，M代表蛋白marker，S代表细胞破碎液上清，T代表总蛋白。
图3为实施例9各酶的SDS PAGE图。其中，M代表蛋白marker，S代表细胞破碎液上清，T代表总蛋白。
图4为实施例3固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖效果。
图5为实施例11固定化大肠杆菌生产甘露糖效果。
图6为对比例1枯草芽孢杆菌生产甘露糖效果。
图7为对比例2大肠杆菌生产甘露糖效果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：表达酶的枯草芽孢杆菌发酵液的制备
(1) pMA5-Pylb-aGP的构建
本实施例中耐热a-葡聚糖磷酸化酶编码基因agp序列（ NCBI-ProteinID:BAD85595）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并拼接到普通质粒上。耐热a-葡聚糖磷酸化酶基因agp基因使用一对引物（1-IF和1-IR）通过PCR获得。pMA5‐ Pylb线性骨架使用一对引物（1-VF和1-VR）通过PCR获取。然后使用POE-PCR组装耐热a-葡聚糖磷酸化酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。连接产物用氯化钙法转入感受态SCK6，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定及测序验证，获得表达载体，命名为pMA5-Pylb-aGP。
1-IF：AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatggtgaacgtttccaatgccgttg
1-IR：gcttgagctcgactctagaggatcctcagtcaagtcccttccacttgacca
1-VF：tggtcaagtggaagggacttgactgaggatcctctagagtcgagctcaagc
1-VR：caacggcattggaaacgttcaccatACAAATCTC CCCCTTTGTTGTTTCT
(2) pMA5-Pylb-PGM的构建
本实施例中耐热葡萄糖磷酸变位酶编码基因pgm序列（NCBI-ProteinID:BAD85297）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并拼接到普通质粒上。耐热葡萄糖磷酸变位酶基因基因pgm基因使用一对引物（2-IF和2-IR）通过PCR获得。pMA5‐ Pylb线性骨架使用一对引物（2-VF和2-VR）通过PCR获取。然后使用POE-PCR组装耐热葡萄糖磷酸变位酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。连接产物用氯化钙法转入感受态SCK6，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定及测序验证，获得表达载体，命名为pMA5-Pylb-PGM。
2-IF：AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatgggcaaactgtttggtaccttcg
2-IR：gcttgagctcgactctagaggatccTTAacctttcagtgcttcttccagc
2-VF：gctggaagaagcactgaaaggtTAAggatcctctagagtcgagctcaagct
2-VR：cgaaggtaccaaacagtttgcccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT
(3)pMA5-Pylb-PGI的构建
本实施例中耐热葡萄糖磷酸异构酶基因编码基因pgi序列（ NCBI-ProteinID:AAS82052）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并拼接到普通质粒上。耐热葡萄糖磷酸异构酶基因基因pgi基因使用一对引物(3-IF和4-IR)通过PCR获得。pMA5‐ Pylb线性骨架使用一对引物（3-VF和3-VR）通过PCR获取。然后使用POE-PCR组装耐热葡萄糖磷酸异构酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。连接产物用氯化钙法转入感受态SCK6，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定及测序验证，获得表达载体，命名为pMA5-Pylb-PGI。
3-IF：AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTATGCTGCGTCTGGATACTCGCTTTC
3-IR：agcttgagctcgactctagaggatccTTAACCAGCCAGGCGTTTACGAGTC
3-VF：GACTCGTAAACGCCTGGCTGGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagct
3-VR：GAAAGCGAGTATCCAGACGCAGCATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT
(4) pMA5-Pylb-MPI的构建
本实施例中耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因编码基因mpi序列（NCBI-ProteinID:AAS81322）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并拼接到普通质粒上。耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因基因mpi基因使用一对引物（4-IF和4-IR）通过PCR获得。pMA5‐ Pylb线性骨架使用一对引物（4-VF 和4-VR）通过PCR获取。然后使用POE-PCR组装耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。连接产物用氯化钙法转入感受态SCK6，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定及测序验证，获得表达载体，命名为pMA5-Pylb-MPI。
4-IF:GTAGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatgaggcggttggagcccaaacccgtggc
4-VF: ccacgggtttgggctccaaccgcctcatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCTAC
4-VR: tgccgccctggccaaggagggggcgtgaggatcctctagagtcgagctcaagc
4-IR:gcttgagctcgactctagaggatcctcacgccccctccttggccagggcggca
(5) pMA5-Pylb-M6PP的构建
本实施例中耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因编码基因m6pp序列（NCBI-ProteinID:NP_228460）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并拼接到普通质粒上。耐热耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因基因m6pp基因使用一对引物(5-IF和5-IR)通过PCR获得。pMA5‐ Pylb线性骨架使用一对引物（5-VF 和5-VR）通过PCR获取。然后使用POE-PCR组装耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。连接产物用氯化钙法转入感受态SCK6 ，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定及测序验证，获得表达载体，命名为pMA5-Pylb-M6PP。
5-IF:GTAGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTATGTACCGCGTTTTTGTTTTTGATC
5-VF:GATCAAAAACAAAAACGCGGTACATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCTAC
5-VR:AGCACCGATTGTCTGGATGAAtgaggatcctctagagtcgagctcaagc
5-IR:gcttgagctcgactctagaggatcctcaTTCATCCAGACAATCGGTGCT
(6) 发酵液的获得
分别挑取表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶基因、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌重组工程菌(本实施例的出发菌选用SCK6，见CN112342179B)，并分别接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1%的接种量转接于LB培养基中，37℃震荡培养过夜，分别获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液。耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶在枯草芽孢杆菌中的表达情况如图2所示。
实施例2：固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入2% w/v蒙脱土，搅拌均匀。随后，加入1% w/v分子量为600的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.5% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成3.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
在1L反应体系中，分别加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM磷酸钠缓冲（pH 7.0）以及固定化枯草芽孢杆菌，使OD600=20，在70℃水浴摇床反应。反应过程中用高效液相色谱分析甘露糖含量。反应结束后通过简单过滤收集固定化枯草芽孢杆菌，经缓冲液洗涤后进行下一批次反应。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达60%，连续催化20批次后，产物得率仍可达40%。
实施例3：固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入5% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v分子量为70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.5% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成0.4 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经60℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果如图4所示，结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，连续催化25批次后，产物得率仍可达45%。
实施例4：固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入2% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.5% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联3h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经90oC沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达63%，连续催化25批次后，产物得率仍可达43%。
实施例5：固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:2:2将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入4% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入1% w/v聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入1% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联3h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70oC沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达63%，连续催化25批次后，产物得率仍可达40%。
实施例6:固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入6% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.8% w/v分子量为70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.5% v/v三羟甲基磷水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成0.4 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达64%，连续催化25批次后，产物得率仍可达41%。
实施例7: 固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入3% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v聚丙烯酰胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入2.0% v/v N,N-亚甲基双丙烯酰胺水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经90℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，连续催化25批次后，产物得率仍可达42%。
实施例8:固定化枯草芽孢杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例1中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的枯草芽孢杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入1% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.1% w/v分子量70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.3% v/v 环氧氯丙烷水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达63%，连续催化25批次后，产物得率仍可达40%。
实施例9：表达酶的大肠杆菌发酵液的制备
耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、耐热葡萄糖磷酸异构酶基因、耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因、耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因质粒的构建方法如专利CN 109750011 A 所述。分别将耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、耐热葡萄糖磷酸异构酶基因、耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因、耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因直接合成在pET-21a载体上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒分别命名为pET-21a-aGP，pET-21a-PGM，pET-21a-PGI，pET-21a-MPI，pET-21a-M6PP。
分别重组质粒pET-21a-aGP，pET-21a-PGM，pET-21a-PGI，pET-21a-MPI，pET-21a-M6PP分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌。分别挑取单克隆至LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1%的接种量转接于LB培养基中，18℃用IPTG诱导，震荡培养过夜，分别获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液。耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶在枯草芽孢杆菌中的表达情况如图3所示。
实施例10：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600 = 100，向菌悬液中加入1% w/v蒙脱土，搅拌均匀。随后，加入0.2% w/v分子量为600的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.2% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成0.8 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机截断成长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经60oC沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达60%，连续催化20批次后，产物得率仍可达40%以上。
实施例11：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600 = 100，向菌悬液中加入1% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v分子量为70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入1% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机截断成长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70oC沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果如图5所示，结果表明，固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，连续催化25批次后，产物得率仍可达44%。
实施例12：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600 = 100，向菌悬液中加入2% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.5% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联3h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成3.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机截断成长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经90oC沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达60%，连续催化25批次后，产物得率仍可达40%。
实施例13：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:2:2将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600 = 100，向菌悬液中加入3% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.4% w/v聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入1% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联3h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机截断成长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70oC沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达60%，连续催化25批次后，产物得率仍可达41%。
实施例14：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入3% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v分子量为70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入1.0% v/v三羟甲基磷水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达61%，连续催化25批次后，产物得率仍可达40%。
实施例15：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入5% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.8% w/v聚丙烯酰胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.8% v/vN,N-亚甲基双丙烯酰胺水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经90℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达63%，连续催化25批次后，产物得率仍可达41%。
实施例16：固定化大肠杆菌生产甘露糖
按照OD600比例1:1:1:1:1将实施例9中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的大肠杆菌发酵液、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌发酵液进行混合，使得OD 600=100，向菌悬液中加入1% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.4% w/v分子量600的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.4% v/v 环氧氯丙烷水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的长条状，然后经过球形抛丸机将长条截断后得到长短均匀的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经70℃沸腾干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达61%，连续催化25批次后，产物得率仍可达39%。
对比例1：枯草芽孢杆菌生产甘露糖
将实施例1中制备得到的发酵液于5500 rpm离心10 min，弃去上清，分别获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的全细胞。分别向上述细胞中加入50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5），重悬菌体至OD 600=200。将重悬的菌体75oC热处理90 min。用pH 7.0磷酸钠缓冲液按照比例1:1:1:1:1将上述全细胞进行混合，使得OD600=200。
在1L反应体系中，分别加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM磷酸钠缓冲（pH 7.0）以及上述混合的枯草芽孢杆菌OD600=20，在70oC水浴摇床反应。反应过程中用高效液相色谱分析甘露糖含量。反应结束后通过离心获得沉淀菌体，经缓冲液洗涤后进行下一批次反应。实验结果如图6所示，结果表明，固定草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达65%，但连续催化2批次后，产物得率仅剩余15%。
对比例2：大肠杆菌生产甘露糖
将实施例9中制备得到的发酵液于5500 rpm离心10 min，弃去上清，分别获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的全细胞。分别向上述细胞中加入50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5），重悬菌体至OD 600=200。将重悬的菌体75oC热处理90 min。用pH 7.0磷酸钠缓冲液按照比例1:1:1:1:1将上述全细胞进行混合，使得OD600=200。
在1L反应体系中，分别加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM磷酸钠缓冲（pH 7.0）以及上述混合的大肠杆菌 OD 600=20，在70oC水浴摇床反应。反应过程中用高效液相色谱分析甘露糖含量。反应结束后通过离心获得沉淀菌体，经缓冲液洗涤后进行下一批次反应。实验结果如图7所示，结果表明，大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达63%，但连续催化2批次后，产物得率仅剩余12%。
对比例3:固定化透性枯草芽孢杆菌生产甘露糖
分别挑取表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶基因、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌重组工程菌，并分别接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1%的接种量转接于LB培养基中，37℃震荡培养过夜，5500 rpm离心10 min，弃去上清，分别获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的全细胞。分别向上述细胞中加入50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5），重悬菌体至OD 600=200。将重悬的菌体75oC热处理90 min。
用pH 7.0磷酸钠缓冲液按照比例1:1:1:1:1将上述透性全细胞进行混合，使得OD600 = 100，向菌悬液中加入5% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v分子量为70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入0.5% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成0.4 mm粒径的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经30℃干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定化透性枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达55%，连续催化25批次后，产物得率为27%。
对比例4：固定化透性大肠杆菌生产甘露糖
分别挑取表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶基因、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶基因、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶基因的大肠杆菌重组工程菌，并分别接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1%的接种量转接于LB培养基中，18℃ IPTG诱导，震荡培养过夜，5500 rpm离心10min，弃去上清，分别获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸异构酶的全细胞、表达耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的全细胞。分别向上述细胞中加入50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5），重悬菌体至OD 600=200。将重悬的菌体75oC热处理90 min。
用pH 7.0磷酸钠缓冲液按照比例1:1:1:1:1将上述透性全细胞进行混合，使得OD600=100，向菌悬液中加入1% w/v硅藻土，搅拌均匀。随后，加入0.5% w/v分子量为70000的聚乙烯亚胺水溶液在室温条件下絮凝。然后，加入1% v/v戊二醛水溶液在室温条件下交联2h。真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成1.0 mm粒径的颗粒；获得的固定化细胞颗粒经30oC干燥后得到固定化细胞。
按实施例二的方法进行甘露糖的生产。实验结果表明，固定化透性大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达56%，连续催化25批次后，产物得率为26%。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种用于甘露糖生产的固定化细胞的制备方法及其应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaaacaaca aagggggaga tttgtatggt gaacgtttcc aatgccgttg 50
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcttgagctc gactctagag gatcctcagt caagtccctt ccacttgacc a 51
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtcaagtg gaagggactt gactgaggat cctctagagt cgagctcaag c 51
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caacggcatt ggaaacgttc accatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agaaacaaca aagggggaga tttgtatggg caaactgttt ggtaccttcg 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcttgagctc gactctagag gatccttaac ctttcagtgc ttcttccagc 50
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctggaagaa gcactgaaag gttaaggatc ctctagagtc gagctcaagc t 51
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgaaggtacc aaacagtttg cccatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaaacaaca aagggggaga tttgtatgct gcgtctggat actcgctttc 50
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<212> DNA
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<400> 10
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<212> DNA
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gactcgtaaa cgcctggctg gttaaggatc ctctagagtc gagctcaagc t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaaagcgagt atccagacgc agcatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
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<212> DNA
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<400> 13
gtagaaacaa caaaggggga gatttgtatg aggcggttgg agcccaaacc cgtggc 56
<210> 14
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<212> DNA
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<400> 14
ccacgggttt gggctccaac cgcctcatac aaatctcccc ctttgttgtt tctac 55
<210> 15
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgccgccctg gccaaggagg gggcgtgagg atcctctaga gtcgagctca agc 53
<210> 16
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcttgagctc gactctagag gatcctcacg ccccctcctt ggccagggcg gca 53
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gtagaaacaa caaaggggga gatttgtatg taccgcgttt ttgtttttga tc 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gatcaaaaac aaaaacgcgg tacatacaaa tctccccctt tgttgtttct ac 52
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agcaccgatt gtctggatga atgaggatcc tctagagtcg agctcaagc 49
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcttgagctc gactctagag gatcctcatt catccagaca atcggtgct 49
Claims (13)
1.一种用于甘露糖生产的固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
通过发酵分别获得表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、甘露糖6-磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸磷酸酶的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液，将上述发酵液进行混合得发酵混合液；
向所述发酵混合液中加入1-10% w/v无机土，搅拌均匀；
再向所述发酵混合液中加入0.1-2% w/v絮凝剂絮凝菌体，随后加入0.05-3% v/v交联剂交联1-4 h；
真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成长条状，然后经过球形抛丸机截断成长短均匀的颗粒；
获得的颗粒经沸腾干燥后得到用于甘露糖生产的固定化细胞，其中所述沸腾干燥的进风口温度控制在60-90℃。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、甘露糖6-磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸磷酸酶分别是耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸异构酶和耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述耐热是指40℃以上仍具有酶的活性。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，分别表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热甘露糖6-磷酸异构酶和耐热甘露糖6-磷酸磷酸酶的湿菌体的按比例为（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）进行混合，且混合后的菌悬液OD600在10-150之间。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机土选自蒙脱土、硅藻土、高岭土或膨润土。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚丙烯酰胺。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂为聚乙烯亚胺或PDADMAC，且所述聚乙烯亚胺的分子量为600-70000。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自戊二醛、三羟甲基磷、N,N-亚甲基双丙烯酰胺或环氧氯丙烷。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括将获得的固定化细胞经过筛分得到形态均匀的固定化细胞的步骤。
10.一种固定化细胞生产甘露糖的方法，其特征在于：利用如权利要求1至9任一项所述方法得到的固定化细胞将淀粉或淀粉衍生物转化为甘露糖。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步地，反应结束后还包括过滤回收固定化细胞的步骤。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，其中生物转化反应体系中包含淀粉或淀粉衍生物50-300 g/L，pH值为5.0-8.0的缓冲液，10-50 mM无机磷酸根，3-7 mM二价镁离子和固定化细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述无机磷酸根可为磷酸钠或磷酸钾。
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