CN112342179A - 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法 - Google Patents

产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法，所述基因工程菌包括构建单独表达或共表达耐热α‑葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6‑磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6‑磷酸塔格糖磷酸酶。利用所述基因工程菌可以有效的将淀粉转化为塔格糖。本发明的方法与现有生产塔格糖的方法相比，可以适用于全细胞循环使用、安全性能高、产率高、生产工艺简单、成本低且易于规模化制备等优点。

Description

产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及产塔格糖的基因工程菌及其制备塔格糖的方法。
背景技术
塔格糖是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。塔格糖的甜味特性与蔗糖相似，热量只有蔗糖的三分之一，被称为低热量甜味剂。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。塔格糖提供非常新鲜和纯净的甜度，其味道的特点与果糖相似。研究表明塔格糖具有低热量、低升糖指数、抗龋齿、抗氧化、益生元、改善肠道功能、免疫调节、药物前体等重要生理功能特性，可以广泛应用于食品、饮料、医药、保健等领域，具有巨大的经济价值 (Oh D-K: Tagatose: properties, applications, andbiotechnological processes. App. Microbiol. Biotechnol. 2007, 76:1-8)。
2001年，美国食品及药物管理局（FDA）对塔格糖安全性进行了确认，批准其为GRAS（Generally Regarded As Safe）产品。FDA在2002年12月批准塔格糖作为牙齿友好的成分，以及2003年10月批准其作为食品添加剂，可作为甜味剂用于食品饮料业以及医药领域。2001年，联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会（JECFA）推荐塔格糖为一种新的低热量甜味剂，可以作为食品添加剂使用。2004 年第 63 次会议中声明不需要限制塔格糖的允许日摄取量 (ADI)，并将“未指定的”ADI 分配在 JECFA 可安排食品组分的最安全的目录中。韩国，澳洲（澳大利亚和新西兰）和欧盟分别于2003年，2004年和2005年批准塔格糖在本地区上市，其中2005 年12月，塔格糖在欧盟被正式批准为无任何使用限制的新型食品组分。我国也于2014年5月批准塔格糖为新食品原料。目前，塔格糖已获全球30多个国家以及WHO/FAO和国际食品法典委员会的核准，并对其每天允许摄入量和使用用途不作限制。
塔格糖的生产方法主要有化学合成法和生物转化法。一般都以半乳糖为原料，通过化学方法或生物转化进行异构化反应而成。化学合成法是利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催化剂，促使半乳糖在碱性条件下生成塔格糖，并形成金属氢氧化物-塔格糖复合物，再用酸中和获得塔格糖。化学法能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，产生化学污染。生物法是利用半乳糖醇或半乳糖，在酶或者微生物的催化作用下将相应的底物转化为塔格糖。半乳糖醇价格较高且来源受限，不适宜用作工业化生产原料。目前塔格糖主流生产方法是经过半乳糖异构化、脱盐、脱色、分离、浓缩、结晶等步骤制成塔格糖纯品。然而，这种方法也存在缺陷，半乳糖不能完全转化为塔格糖，最终产物是半乳糖和塔格糖的混合物，导致塔格糖分离工艺复杂，转化率低，分离成本高昂，同时原料半乳糖的价格并不低廉，最终塔格糖的生产成本高昂。(Rhimi M, Aghajari N, Juy M, Chouayekh H, Maguin E, Haser R,Bejar S: Rational design of Bacillus stearothermophilus US100l-arabinoseisomerase: Potential applications for d-tagatose production. Biochim. 2009,91:650-653. Oh H-J, Kim H-J, Oh D-K: Increase in d-tagatose production rateby site-directed mutagenesis of l-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnol. Lett. 2006, 28:145-149. Bosshart A, Hee CS,Bechtold M, Schirmer T, Panke S:Directed divergent evolution of athermostable D-tagatose epimerase towards improved activity for two hexosesubstrates. ChemBioChem 2015,16:592-601.)
韩国CJ公司发明多酶催化果糖转化为塔格糖技术（Oh DK ,HONG SH ,Lee SH:Aldolase, aldolase mutants and tagatose using the same production methods andcompositions for production. WO 2015016544A1），包括果糖激酶、醛缩酶、植酸酶，但是从果糖生产6-磷酸果糖需要ATP对果糖进行底物磷酸化，添加昂贵的ATP导致塔格糖生产成本高，不具备工业化生产价值（TW107111500，US20160186162A1）。韩国CJ公司挖掘和改造己糖醛酸酯4-差向异构酶将果糖转化为塔格糖（CN105431541B，CN109415715A），经过改造的己糖醛酸酯4-差向异构酶酶活性极低，不具备工业化应用价值。韩国CJ公司还挖掘新型来源的6-磷酸塔格糖磷酸酶并将其应用到淀粉、麦芽糊精和蔗糖等底物转化生产塔格糖（WO2018004310A1，CN 109790524 A），但是该6-磷酸塔格糖磷酸酶酶活性极低，现阶段不具备工业化应用价值。
中国科学院天津工业生物技术研究所以廉价玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖等为原料，建立了塔格糖体外多酶合成新路线，从根本上改变了现有塔格糖的生产工艺（CN106399427A）。在此基础上，中国科学院天津工业生物技术研究所以廉价玉米淀粉、纤维素、麦芽糊精、蔗糖等为原料，利用全细胞催化制备塔格糖的方法（CN107988286A），该工艺减少了多酶纯化工艺步骤，降低了生产成本低和环境污染，提高了塔格糖产率。但是该方法中关键酶的发酵生产宿主是大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌不适合作为食品制剂生产相关酶的生产菌株进行工业化生产，除此之外体外酶分离纯化步骤繁琐，酶回收利用率低，循环使用困难，无法进一步降低生产成本，无法实现工业化高浓度产物大批量生产应用。
因此，亟待开发一种全细胞循环使用、安全性能高、产率高、生产工艺简单、成本低且且适用于高底物浓度投放和高产物塔格糖产出，易于规模化制备塔格糖的新方法。
发明内容
针对现有的多酶催化制备塔格糖的方法所存在的问题如大肠杆菌不利于食品制剂的工业化生产，纯化步骤繁琐，酶回收利用利用率低和循环使用困难，以及低浓度底物淀粉的投料问题，本发明的主要目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌全细胞催化高浓度淀粉制备生产高浓度塔格糖的方法。
本发明首先提供一种产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其是共表达α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌、或分别表达α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌的混合物。
上述技术方案的原理在于充分利用相关催化途径而活体细胞水平表达并实现有效催化反应，其包括由α-葡聚糖磷酸化酶在无机磷存在下将底物淀粉转化为中间体葡萄糖-1-磷酸（G1P）；由葡萄糖磷酸变位酶将中间体葡萄糖-1-磷酸（G1P）变位为另一中间体葡萄糖-6-磷酸（G6P）；由葡萄糖磷酸异构酶将中间体葡萄糖-6-磷酸（G6P）变位为另一中间体果糖-6-磷酸（F6P）；由6-磷酸塔格糖差向异构酶将中间体果糖-6-磷酸（F6P）异构化为另一中间体塔格糖-6-磷酸（T6P）；由6-磷酸塔格糖磷酸酶将中间体塔格糖-6-磷酸（T6P）脱掉磷酸基团为产物塔格糖（Tagatose）。
本领域已知的各种枯草芽孢杆菌菌株均可用作本发明的出发菌株，如Bacillus subtilis 168、DB104、WB800、WB600、SCK6、1A751、ATCC6051a、ATCC6051等。优选地，所述枯草芽孢杆菌出发菌株为敲除蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，例如WB800、WB600、SCK6、1A751等。更优选地，所述枯草芽孢杆菌出发菌株为SCK6。
在具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌中包括共表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的表达载体，或者为包含α-葡聚糖磷酸化酶的表达载体的基因工程菌、葡萄糖磷酸变位酶的表达载体的基因工程菌、葡萄糖磷酸异构酶的表达载体的基因工程菌、6-磷酸塔格糖差向异构酶的表达载体的基因工程菌和6-磷酸塔格糖磷酸酶的表达载体的基因工程菌的混合物。
优选地，所述的各种酶是耐热型的，即耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶。相对于不耐热的常温酶来说，采用耐热的酶在菌株灭活方面具有优势，即后者在发酵结束后可以通过加热处理的方式将菌株灭活，而同时塔格糖合成相关的酶仍保持活性，从而能够将灭活的菌株混合用来生产塔格糖，更适于工业应用。如果使用常温的相关酶，那么在发酵生产结束后，则需要通过破碎菌体和酶纯化步骤获取纯酶，才能够获得相关酶用来塔格糖的生产。
具体地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将淀粉磷酸化为葡萄糖-1-磷酸（G1P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、 Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热α-葡聚糖磷酸化酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于Thermococcus kodakarensis。
具体地，耐热葡萄糖磷酸变位酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-1-磷酸（G1P）变位为葡萄糖-6-磷酸（G6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸变位酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸变位酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermococcus kodakarensis。
具体地，耐热葡萄糖磷酸异构酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-6-磷酸（G6P）变位为果糖-6-磷酸（F6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、 Clostridium thermocellum、Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于Thermus thermophilus。
具体地，耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有果糖-6-磷酸（F6P）异构为塔格糖-6-磷酸（T6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、 Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、 Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐6-磷酸塔格糖差向异构酶来源于Thermoanaerobacter indiensis。
具体地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有塔格糖-6-磷酸（T6P）脱掉磷酸基团为产物塔格糖（Tagatose）功能的酶。进一步优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、 Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、 Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的6-磷酸塔格糖磷酸酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于Archaeoglobus fulgidus。
本发明相应地提供一种用于上述基因工程菌的表达载体，其包含α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因，并能够实现这些基因的共表达。
本领域技术人员可以理解，本发明所涉及的载体和基因工程菌可以通过本领域已知的常规方法制备，例如，通过重组DNA技术构建，获取α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、6-磷酸塔格糖磷酸酶基因，构建重组表达载体，再通过已知的方法转入枯草芽孢杆菌获得基因工程菌。
更优选地，所述载体包括启动子、耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、耐热葡萄糖磷酸异构酶基因、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶基因和终止子。而分别各所述表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的载体包括启动子、耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、终止子；所述表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的载体包括启动子、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、终止子；所述表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的载体包括启动子、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、终止子；所述表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的载体包括启动子、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因、终止子；所述表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的载体包括启动子、耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶基因、终止子。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种启动子均可用作本发明的启动子包括但不限于P43启动子、Pylb启动子、PamyL启动子、Plaps启动子、PhpaII启动子、PamyE启动子、Pgrac启动子、PsacB启动子、PsigX启动子、PaprE启动子、PgroES启动子等。优选地，本发明的启动子选择PhpaII启动子和Pylb启动子串联。本领域已知的各种终止子也可用作本发明中的终止子。
在优选的实施方式中，所述基因工程菌中的内源性的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，和/或α-淀粉酶基因、和/或孢子形成RNA 聚合酶 σF 因子基因，和/或表面活性肽合成酶亚基3基因被失活或敲除。最优选地，所述基因工程菌中内源性的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，α-淀粉酶基因，孢子形成RNA 聚合酶 σF 因子基因，和表面活性肽合成酶亚基3基因均被失活或敲除。其中失活或敲除上述基因能够进一步提高基因工程菌生产塔格糖的效率，具体理由是，失活或敲除尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因可以构建无痕遗传操作系统，后续的遗传操作（即敲除基因）可以做到无痕操作，不引入抗性基因等外源基因；失活或敲除α-淀粉酶基因可以切除菌株利用外源淀粉的途径，防止生产塔格糖的底物淀粉被菌株作为碳源代谢利用；失活或敲除孢子形成RNA 聚合酶 σF 因子基因，可以为菌种代谢流向塔格糖合成相关的异源蛋白合成表达方向，同时也可以使菌株发酵控制不形成芽孢；失活或敲除表面活性肽合成酶亚基3基因可以在发酵生产菌体的时候更容易控制，不产生太多的泡沫。因此，失活或敲除上述4个基因能够更有利于基因工程菌产生塔格糖，因此是优选的实施方式。
本领域已知的方法来实现内源性基因的失活或敲除，优选采用基因编辑的方法实现。
本发明进一步提供利用上述基因工程菌全细胞催化淀粉制备生产塔格糖的方法，其包括下述步骤：
(1) 将所述枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵获得全细胞；
(2) 将步骤（1）获得的枯草芽孢杆菌全细胞进行细胞膜通透性处理，获得透性全细胞；
(3) 利用步骤（2）获得的透性全细胞催化淀粉制备塔格糖，其中对于共表达的枯草芽孢杆菌工程菌直接用于催化，对于分别表达各种酶的枯草芽孢杆菌工程菌则进行混合用于催化。
优选地，还包括将步骤（2）中获得的枯草芽孢杆菌透性全细胞进行固定化处理，获得固定化全细胞，或者固定化全细胞混合物，然后再用于催化。
在具体实施方式中，步骤（1）所述全细胞的制备使用本领域已知的方法进行。发酵可使用任何适合外源蛋白表达的培养基，包括但不限于LB培养基、SR 培养基、TB培养基等。
在优选实施方式中地，步骤(2)中所述细胞膜通透性处理可以采用已知方法，包括但不限于热处理、添加有机溶剂和/或添加表面活性剂等。其中，有机溶剂包括但不限于丙酮、乙腈等。表面活性剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、Tween-80等。优选地，细胞膜通透性处理为热处理。对细胞膜进行通透性处理的目的是为了使细胞外的淀粉能够通过细胞膜进入到细胞内。
其中优选地，所述热处理温度为45-100℃；更优选地，热处理温度为70-80℃。优选地，热处理时间为10-100 min；更优选地，热处理时间为50-70 min。优选地，热处理时的细胞浓度为OD600 = 10-300；更优选地，细胞浓度为OD600 = 30-150。同时，所述热处理可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；优选地，所述热处理在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。其中，磷酸盐缓冲液例如磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液等。
在具体实施方式中，催化的反应体系中，底物淀粉的浓度为50-300 g/L；更优选地，底物淀粉的浓度为100-200 g/L。优选地，其反应条件为：在pH 5.0-8.0、40-80℃下反应0.5-96 h；更优选地在pH 6.5-7.5、45-75℃下反应12-60 h；最优选地在pH 7.5、60-70℃下反应12-96 h。所述的催化可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；优选地，是在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。其中，磷酸盐缓冲液，例如磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液等。
优选地，对于分别表达各种酶的枯草芽孢杆菌工程菌透性全细胞，其混合物是将表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的透性全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的透性全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的透性全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的透性全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的透性全细胞的比例为(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)；更优选地为(0.5-5)：(0.5-5)：(0.5-5)：(0.5-5)：(0.5-5)，最优选为1:1:1:1:1。
在具体实施方式中，所述透性全细胞固定化处理方法为：用磷酸钠或磷酸钾缓冲液重悬共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的透性全细胞，加入适量无机土，搅拌均匀。加入聚乙烯亚胺水溶液于室温条件下絮凝，在加入交联剂进行交联。然后抽滤得到滤饼层，滤饼用去离子水洗涤后挤压制备成颗粒，干燥后得到固定化全细胞。
而对于所述固定化透性全细胞的混合物的处理方法为：分别用磷酸钠或磷酸钾缓冲液重悬表达耐热α--葡聚糖磷酸化酶的透性全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的透性全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的透性全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的透性全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的透性全细胞，加入适量无机土，搅拌均匀。加入聚乙烯亚胺水溶液于室温条件下絮凝，在加入交联剂进行交联。然后抽滤得到滤饼层，滤饼用去离子水洗涤后挤压制备成颗粒，干燥后得到固定化全细胞。
其中，所述无机土包括但并不限于蒙脱土、硅藻土、高岭土和膨润土等，优选地，所述无机土为硅藻土；所述交联剂包括但不限于戊二醛、三羟甲基磷、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、环氧氯丙烷、京尼平等，优选地，所述交联剂为戊二醛。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1) 本发明首次利用表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的全细胞催化淀粉生产塔格糖，开发了一种简单且易于规模化制备塔格糖的新方法。
(2) 枯草芽孢杆菌是一般认为安全（Generally Recognized As Safe, GRAS）的食品级微生物，不产生内毒素。更进一步地是，敲除α-淀粉酶编码基因，有利于后续底物淀粉的催化应用；敲除孢子形成RNA 聚合酶 σF 因子的编码基因，有利于后续发酵生产基因工程菌株在底物转化生产塔格糖的应用；敲除表面活性肽合成酶亚基3的编码基因，有利于后续发酵生产基因工程菌株在底物转化生产塔格糖的应用；
(3) 在优选实施方式中，采用耐热的各种酶，则塔格糖的制备可以在较高温度下进行，从而可以增加底物淀粉的溶解度，相对于现有技术，本发明可在较高底物浓度下实现塔格糖的制备，有利于提高生产效率，进一步降低生产成本。
(4) 本发明的方法中塔格糖的转化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行，不需要使用含有碳源、氮源、无机盐及抗生素的培养基，一方面有利于降低生产成本，另一方面有利于产物塔格糖的分离纯化。
附图说明
图1为本发明的全细胞催化淀粉生产塔格糖的示意图。
图2为重组表达载体pMA5-Pylb-aGP的图谱。
图3为重组表达载体pMA5-Pylb-PGM的图谱。
图4重组表达载体pMA5-Pylb-PGI的图谱。
图5为重组表达载体pMA5-Pylb-TPE的图谱。
图6为重组表达载体pMA5-Pylb-TPP的图谱。
图7为重组表达载体pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP的图谱。
图8为塔格糖的产量随反应时间变化过程曲线图。
图9为固定化共表达工程菌株生产塔格糖产量趋势图。
图10为分表达工程菌株固定化生产塔格糖产量趋势图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的而且是优选的实施例，但不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8的构建
（1）构建重组整合载体pSS-upp-FR
根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶编码基因upp基因序列（NCBI-ProteinID: NP_391570），设计引物，并通过PCR扩增获得upp基因上游500 bp同源片段和下游500 bp的同源片段，采用simple cloning连接方式（You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via directtransformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11）构建至整合载体pSS中，得到重组整合载体pSS-upp-FR。
（2）构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8
制备枯草芽孢杆菌菌株SCK6超级感受态细胞（200 µl）（Zhang, X. Z., & Zhang, Y.H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system fordirected evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microb. Biotechnol., 4(1), 98-105. doi:10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x），将重组整合载体pSS-upp-FR（1µg）与枯草芽孢杆菌菌株SCK6超级感受态细胞（200 µl）混合均匀，随后放入37℃摇床中复苏90 min，将菌液涂布于含有氯霉素（5 µg/mL）的固体LB培养基（酵母抽提物5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L）中，放置于37℃培养箱中培养14-16 h。
挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1000 bp DNA片段和2000 bp DNA片段两条条带（其中1000 bp DNA片段大小是载体pSS-upp-FR中载体中的upp编码基因上下游同源臂的片段大小，2000 bp DNA片段大小是基因组上包括upp编码基因上游同源臂、upp编码基因和upp编码基因下游同源臂的片段大小)的为阳性克隆。
挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 µl菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于5-氟尿嘧啶（5-FU）基本盐培养基固体平板（40% 葡萄糖20.0 ml/L, 4% 谷氨酰胺 50.0 mL/L, 0.5% 色氨酸 10.0 mL/L, 1% 维他命 B1 1.0mL/L, 20 mM 5-氟尿嘧啶 500 μL/L, 10×基本盐 100.0 mL/L, 1000×微量元素 1.0mL/L）中，放置37℃培养箱中培养24 h。此步骤的目的是在于通过不添加抗生素的LB培养基培养，促使阳性转化子发生分子内同源重组，再通过5-FU基本盐培养基筛选培养获得upp敲除的目的转化子。
从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得仅有1000 bp的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即upp基因敲除的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，即无尿嘧啶磷酸核糖基转移酶酶活性的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，命名为SCK8。
实施例2 枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8-ST1的构建
（1）构建重组整合载体pSS-amyE-FR
根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的α-淀粉酶的编码基因amyG基因序列（NCBI-ProteinID: NP_388186），设计引物，并通过PCR扩增获得amyG基因上游500 bp同源片段和下游500 bp的同源片段，采用simple cloning连接方式（You, C.,Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via direct transformationof PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis.Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11）构建至整合载体pSS中，得到重组整合载体pSS-amyE-FR。
（2）构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8-ST1
制备枯草芽孢杆菌菌株SCK8超级感受态细胞（200 µl），将重组整合载体pSS-amyE-FR（1 µg）与枯草芽孢杆菌菌株SCK8超级感受态细胞（200 µl）混合均匀，随后放入37℃摇床中复苏90 min，将菌液涂布于含有氯霉素（5 µg/mL）的固体LB培养基（酵母抽提物5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L）中，放置于37℃培养箱中培养14-16 h。
挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1000 bp DNA片段和2000 bp DNA片段两条条带（其中1000 bp DNA片段大小是载体pSS-amyE-FR中载体中的amyE编码基因上下游同源臂的片段大小，2000 bp DNA片段大小是基因组上包括amyE编码基因上游同源臂、amyE编码基因和amyE编码基因下游同源臂的片段大小)的为阳性克隆。
挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 µl菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于5-FU基本盐培养基固体平板（40% 葡萄糖20.0 ml/L, 4% 谷氨酰胺 50.0 mL/L, 0.5% 色氨酸 10.0 mL/L, 1% 维他命 B1 1.0 mL/L, 20 mM5-氟尿嘧啶 500 μL/L, 10×基本盐 100.0 mL/L,1000×微量元素 1.0 mL/L）中，放置37℃培养箱中培养24 h。此步骤的目的是在于通过不添加抗生素的LB培养基培养，促使阳性转化子发生分子内同源重组，再通过5-FU基本盐培养基筛选培养获得amyE敲除的目的转化子。
从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得仅有1000 bp的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即amyG基因敲除的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，即无α-淀粉酶酶活性的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，命名为SCK8-ST1。
实施例3 枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8-ST2的构建
（1）构建重组整合载体pSS-spoIIAC-FR
根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的孢子形成RNA 聚合酶 σF 因子的编码基因spoIIAC基因序列（NCBI-ProteinID: NP_390226），设计引物，并通过PCR扩增获得孢子形成spoIIAC基因上游500 bp同源片段和下游500 bp的同源片段，采用simple cloning连接方式（You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simplecloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) toEscherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5),1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11）构建至整合载体pSS中，得到重组整合载体pSS-spoIIAC-FR。
（2）构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8-ST2
制备枯草芽孢杆菌菌株SCK8-ST1超级感受态细胞（200 µl），将重组整合载体pSS-spoIIAC-FR （1 µg）与枯草芽孢杆菌菌株SCK8-ST1超级感受态细胞（200 µl）混合均匀，随后放入37℃摇床中复苏90 min，将菌液涂布于含有氯霉素（5 µg/mL）的固体LB培养基（酵母抽提物5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L）中，放置于37℃培养箱中培养14-16 h。
挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1000 bp DNA片段和2000 bp DNA片段两条条带（其中1000 bp DNA片段大小是载体pSS-spoIIAC-FR中载体中的spoIIAC编码基因上下游同源臂的片段大小，2000 bp DNA片段大小是基因组上包括spoIIAC编码基因上游同源臂、spoIIAC编码基因和spoIIAC编码基因下游同源臂的片段大小)的为阳性克隆。
挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 µl菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于5-FU基本盐培养基固体平板（40% 葡萄糖20.0 ml/L, 4% 谷氨酰胺 50.0 mL/L, 0.5% 色氨酸 10.0 mL/L, 1% 维他命 B1 1.0 mL/L, 20 mM5-氟尿嘧啶 500 μL/L, 10×基本盐 100.0 mL/L, 1000×微量元素 1.0 mL/L）中，放置37℃培养箱中培养24 h。此步骤的目的是在于通过不添加抗生素的LB培养基培养，促使阳性转化子发生分子内同源重组，再通过5-FU基本盐培养基筛选培养获得spoIIAC敲除的目的转化子。
从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得仅有1000 bp的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即孢子形成spoIIAC基因敲除的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，即无孢子形成RNA 聚合酶 σF 因子活性的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，命名为SCK8-ST2。
实施例4 枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8-ST3的构建
（1）构建重组整合载体pSS-srfAC-FR
根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的表面活性肽合成酶亚基3编码基因srfAC基因序列（NCBI-ProteinID: NP_388233），设计引物，并通过PCR扩增获得srfAC基因上游500 bp同源片段和下游500 bp的同源片段，采用simple cloning连接方式（You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via directtransformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11）构建至整合载体pSS中，得到重组整合载体pSS-srfAC-FR。
（2）构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8-ST3
制备枯草芽孢杆菌菌株SCK8-ST2超级感受态细胞（200 µl），将重组整合载体pSS-srfAC-FR（1 µg）与枯草芽孢杆菌菌株SCK8-ST2超级感受态细胞（200 µl）混合均匀，随后放入37℃摇床中复苏90 min，将菌液涂布于含有氯霉素（5 µg/mL）的固体LB培养基（酵母抽提物5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L）中，放置于37℃培养箱中培养14-16 h。
挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1000 bp DNA片段和2000 bp DNA片段两条条带（其中1000 bp DNA片段大小是载体pSS-srfAC-FR中载体中的srfAC编码基因上下游同源臂的片段大小，2000 bp DNA片段大小是基因组上包括srfAC编码基因上游同源臂、srfAC编码基因和srfAC编码基因下游同源臂的片段大小)的为阳性克隆。
挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 µl菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于5-FU基本盐培养基固体平板（40% 葡萄糖20.0 ml/L, 4% 谷氨酰胺 50.0 mL/L, 0.5% 色氨酸 10.0 mL/L, 1% 维他命 B1 1.0 mL/L, 20 mM5-氟尿嘧啶 500 μL/L, 10×基本盐 100.0 mL/L, 1000×微量元素 1.0 mL/L）中，放置37℃培养箱中培养24 h。此步骤的目的是在于通过不添加抗生素的LB培养基培养，促使阳性转化子发生分子内同源重组，再通过5-FU基本盐培养基筛选培养获得srfAC敲除的目的转化子。
从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得仅有1000 bp的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即srfAC基因敲除的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，即无表面活性肽合成酶亚基3酶活性的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，命名为SCK8-ST3。
实施例5：重组载体的构建
（1）pMA5-Pylb-aGP的构建
本实施例中耐热α-葡聚糖磷酸化酶来自Thermococcus kodakarensis。耐热α-葡聚糖磷酸化酶编码基因agp序列（NCBI-ProteinID: BAD85595）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接到普通质粒上。耐热α-葡聚糖磷酸化酶编码基因agp基因使用一对引物通过PCR获取。使用引物299-F：5´-AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatggtgaacgtttccaatgccgttg-3´和300-R：5´-gcttgagctcgactctagaggatcctcagtcaagtcccttccacttgacca-3´；pMA5-Pylb线性骨架使用一对引物通过PCR获取。使用引物301-F：5´-tggtcaagtggaagggacttgactgaggatcctctagagtcgagctcaagc-3´和302-R：5´-caacggcattggaaacgttcaccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´；
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5 min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）回收目的片段用于重组表达载体的构建。
然后使用POE-PCR组装耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pMA5-Pylb线性骨架，200 ng；纯化后的耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因片段131 ng；2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (大连宝生物，中国)，25 μL，加水补足50 μL。POE-PCR条件为98℃变性2 min，按如下参数循环30次：98℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72℃延伸3.5 min，最后72℃延伸5 min。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coliTop10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pMA5-Pylb-aGP重组共表达载体，质粒图谱如图2所示。
（2）pMA5-Pylb-PGM的构建
本实施例中耐热葡萄糖磷酸变位酶来自Thermococcus kodakarensis。耐热葡萄糖磷酸变位酶编码基因pgm序列（NCBI-ProteinID: BAD85297）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接到普通质粒上。耐热葡萄糖磷酸变位酶编码基因pgm使用一对引物从基因组DNA中通过PCR获取。使用引物327-F：5´-AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatgggcaaactgtttggtaccttcg-3´和328-R：5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAacctttcagtgcttcttccagc-3´；pMA5-Pylb线性骨架使用一对引物通过PCR获取。使用引物329-F：5´-gctggaagaagcactgaaaggtTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´和330-R：5´-cgaaggtaccaaacagtttgcccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´；
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5 min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，58℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）回收目的片段用于重组表达载体的构建。
然后使用POE-PCR组装耐热葡萄糖磷酸变位酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pMA5-Pylb线性骨架，200 ng；纯化后的耐热葡萄糖磷酸变位酶基因片段131 ng；2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (大连宝生物，中国)，25 μL，加水补足50 μL。POE-PCR条件为98℃变性2 min，按如下参数循环30次：98℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72℃延伸3.5 min，最后72℃延伸5 min。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coliTop10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pMA5-Pylb-PGM重组共表达载体，质粒图谱如图3所示。
（3）pMA5-Pylb-PGI的构建
本实施例中耐热葡萄糖磷酸异构酶来自Thermus thermophilus。耐热葡萄糖磷酸异构酶编码基因pgi序列（NCBI-ProteinID: AAS82052）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接到普通质粒上。耐热葡萄糖磷酸异构酶编码基因pgi使用一对引物从基因组DNA中通过PCR获取。使用引物331-F：5´-AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTATGCTGCGTCTGGATACTCGCTTTC-3´和332-R：5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAACCAGCCAGGCGTTTACGAGTC-3´；pMA5-Pylb线性骨架使用一对引物通过PCR获取。使用引物333-F：5´-GACTCGTAAACGCCTGGCTGGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´和334-R：5´-GAAAGCGAGTATCCAGACGCAGCATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´；
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5 min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）回收目的片段用于重组表达载体的构建。
然后使用POE-PCR组装耐热葡萄糖磷酸异构酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pMA5-Pylb线性骨架，200 ng；纯化后的耐热葡萄糖磷酸异构酶基因片段131 ng；2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (大连宝生物，中国)，25 μL，加水补足50 μL。POE-PCR条件为98℃变性2 min，按如下参数循环30次：98℃变性15 s，58℃退火15s，72℃延伸3.5 min，最后72℃延伸5 min。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coliTop10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pMA5-Pylb-PGI重组共表达载体，质粒图谱如图4所示。
（4）pMA5-Pylb-TPE的构建
本实施例中耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶来自Thermoanaerobacter indiensis。耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶编码基因tpe序列（NCBI-ProteinID: B044_RS0101530）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接到普通质粒上。耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶编码基因tpe使用一对引物从基因组DNA中通过PCR获取。使用引物335-F：5´- AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatgaaagtttggctggttggtgcct-3´和324-R：5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAtttcaggttgctataccattct-3´；pMA5-Pylb线性骨架使用一对引物通过PCR获取。使用引物325-F：5´-agaatggtatagcaacctgaaaTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´和326-R：5´-aggcaccaaccagccaaactttcatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´；
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5 min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）回收目的片段用于重组表达载体的构建。
然后使用POE-PCR组装耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pMA5-Pylb线性骨架，200 ng；纯化后的耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因片段131 ng；2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (大连宝生物，中国)，25 μL，加水补足50 μL。POE-PCR条件为98℃变性2 min，按如下参数循环30次：98℃变性15s，58℃退火15 s，72℃延伸3.5 min，最后72℃延伸5 min。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pMA5-Pylb-TPE重组共表达载体，质粒图谱如图5所示。
（5）pMA5-Pylb-TPP的构建
本实施例中耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶来自Archaeoglobus fulgidus。耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶编码基因tpp序列（NCBI-ProteinID: AAB90791）通过苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接到普通质粒上。耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶编码基因tpp使用一对引物从基因组DNA中通过PCR获取。使用引物339-F：5´- AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTATGTTCAAGCCGAAAGCGATCGCGG-3´和340-R：5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAACGCAGCAGGCCCAGAAACTG-3´；pMA5-Pylb线性骨架使用一对引物通过PCR获取。使用引物；341-F：5´- CAGTTTCTGGGCCTGCTGCGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´和342-R：5´- CCGCGATCGCTTTCGGCTTGAACATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´。
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）回收目的片段用于重组表达载体的构建。
然后使用POE-PCR组装耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pMA5-Pylb线性骨架，200 ng；纯化后的耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶基因片段131 ng；2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (大连宝生物，中国)，25 μL，加水补足50 μL。POE-PCR条件为98℃变性2 min，按如下参数循环30次：98℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸3.5 min，最后72℃延伸5 min。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coliTop10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pMA5-Pylb-TPP重组共表达载体，质粒图谱如图6所示。
（6）pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP的构建
本实施例中耐热α-葡聚糖磷酸化酶来自Thermococcus kodakarensis；耐热葡萄糖磷酸变位酶来自Thermococcus kodakarensis；耐热葡萄糖磷酸异构酶来自Thermus thermophilus；耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶来自Thermoanaerobacter indiensis；和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶来自Archaeoglobus fulgidus。耐热α-葡聚糖磷酸化酶编码基因agp（NCBI-ProteinID: BAD85595）通过PCR获取，使用引物350-F：5´- AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatggtgaacgtttccaatgccgttg-3´和351-R：5´- cgaaggtaccaaacagtttgcccatTTTGAATTCCTCCTTTtcagtcaagtcccttccacttgacc-3´；耐热葡萄糖磷酸变位酶编码基因pgm（NCBI-ProteinID: BAD85297）通过PCR获取，使用引物352-F：5´- ggtcaagtggaagggacttgactgaAAAGGAGGAATTCAAAatgggcaaactgtttggtaccttcg-3´和353-R：5´- GAAAGCGAGTATCCAGACGCAGCATTTTGAATTCCTCCTTTTTAacctttcagtgcttcttccagc-3´；耐热葡萄糖磷酸异构酶编码基因pgi（NCBI-ProteinID: AAS82052）通过PCR获取，使用引物354-F：5´- gctggaagaagcactgaaaggtTAAAAAGGAGGAATTCAAAATGCTGCGTCTGGATACTCGCTTTC-3´和355-R：5´- TTTTCAGCGGATGTTCGGTGTTCATTTTGAATTCCTCCTTTTCAACCAGCCAGGCGTTTACGAGTC-3´；耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶编码基因tpe（NCBI-ProteinID: B044_RS0101530）通过PCR获取，使用引物356-F：5´- GACTCGTAAACGCCTGGCTGGTTGAAAAGGAGGAATTCAAAATGAACACCGAACATCCGCTGAAAA-3´和357-R：5´- ACCGCGATCGCTTTCGGCTTGAACATTTTGAATTCCTCCTTTttaAATCAGTTTGAATTCACCGCTG-3´；耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶编码基因tpp（NCBI-ProteinID: AAB90791）通过PCR获取，使用引物358-F：5´- CAGCGGTGAATTCAAACTGATTtaaAAAGGAGGAATTCAAAATGTTCAAGCCGAAAGCGATCGCGGT-3´和359-R：5´- gcttgagctcgactctagaggatccTTAACGCAGCAGGCCCAGAAACTGCA-3´；pMA5-Pylb线性骨架使用通过PCR获取，使用引物；360-F：5´- TGCAGTTTCTGGGCCTGCTGCGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagc-3´和361-R：5´- caacggcattggaaacgttcaccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´。
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）回收目的片段用于重组表达载体的构建。
然后使用POE-PCR组装耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因片段、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因片段、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因片段、耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶基因片段和pMA5-Pylb载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pMA5-Pylb线性骨架，200 ng；纯化后的耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因片段131 ng、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因片段131 ng、耐热葡萄糖磷酸异构酶基因片段131 ng、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶基因片段131 ng、耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶基因片段131 ng；2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (大连宝生物，中国)，25 μL，加水补足50 μL。POE-PCR条件为98℃变性2 min，按如下参数循环30次：98℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸3.5 min，最后72℃延伸5 min。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP重组共表达载体，质粒图谱如图7所示。
实施例6 重组工程菌的构建
将构建的重组表达载体pMA5-Pylb-aGP、pMA5-Pylb-PGM、pMA5-Pylb-PGI、pMA5-Pylb-TPE、pMA5-Pylb-TPP、pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP分别转化入枯草芽孢杆菌工程菌SCK8-ST3，LB试管培养过夜，质粒抽提试剂盒抽提质粒，将正确的克隆子SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGM、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGI、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPE、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPP和SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP保存。
实施例7 重组工程菌全细胞的制备
分别挑取重组工程菌SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGM、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGI、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPE、SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPP和SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP接种于含有奇霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1%的接种量转接于新鲜的含有奇霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，5500 rpm离心10 min，弃去上清，获得表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的全细胞以及共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的全细胞。
实施例8 共表达全细胞催化淀粉制备塔格糖
将实施例7中制备的共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的全细胞使用50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）洗涤1次，5500 rpm离心10 min，弃去上清，向沉淀中加入50mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液，重悬菌体至OD600 = 300左右。将重悬的菌体在75℃热处理90min。
在1 L反应体系中，分别加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM 磷酸钠缓冲液（pH7.5）以及热处理的全细胞，使OD600 = 20左右。在70℃水浴摇床反应46h，取样进行高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC检测条件如下：色谱柱为Bio-Rad HPX-87H；流速为0.6 mL/min；柱温为60℃；检测器为示差折光检测器；进样量为20 μL。
共计进行了三次平行重复试验，图8显示出了塔格糖的产量随反应时间变化过程曲线图，70℃水浴摇床反应46h后，HPLC测试结果显示塔格糖产量达到50 g/L，产率可达50%。
实施例9 全细胞混合物催化淀粉制备塔格糖
将实施例7中制备的表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的全细胞分别使用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）洗涤1次，5500 rpm离心10 min，弃去上清，分别向沉淀中加入50 mM磷酸钠缓冲液（pH7.5），重悬菌体至OD600 = 300左右。将重悬的菌体75℃热处理90 min。
在1 L反应体系中，加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）以及以上四种热处理的全细胞使OD600 = 20左右，表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的全细胞的加入比例为1:1:1:1。在70℃水浴摇床反应46h，取样进行HPLC分析。共计进行了三次平行重复试验，HPLC检测条件同实施例8。70℃水浴摇床反应46h后，HPLC测试结果显示塔格糖产量达到73 g/L，产率可达73%。
实施例10 固定化全细胞催化淀粉制备塔格糖
用1 L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）重悬共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的透性全细胞，使得OD600 = 400左右，加入1 g蒙脱土，搅拌均匀。加入40 ml 5% (w/v)聚乙烯亚胺水溶液于室温条件下絮凝，在加入20 ml 50%戊二醛水溶液于室温交联3 h。然后抽滤得到滤饼层，滤饼用去离子水洗涤后挤压制备成颗粒，干燥后得到固定化全细胞。
在1 L反应体系中，分别加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM 磷酸钠缓冲液（pH7.5）以及固定化全细胞，使OD600 = 20左右，在70oC水浴摇床反应。反应结束后反应液于4oC离心，进行高效液相色谱（HPLC）分析塔格糖含量；收集固定化颗粒，经缓冲液洗涤进行下一批次反应。实验结果如图9所示，结果表明，固定化全细胞连续催化淀粉生产塔格糖过程中，初始产物得率最高可达50%，随着连续催化反应批次的增加，产物得率逐渐降低，连续催化50批次后，产物得率可维持36%左右。
实施例11 固定化全细胞混合物催化淀粉制备塔格糖
用1L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）按照比例1:1:1:1:1重悬表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的透性全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的透性全细胞、表达耐热葡萄糖磷酸异构酶的透性全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶的透性全细胞、表达耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶的透性全细胞，使得OD600 = 300左右，加入0.8 g蒙脱土，搅拌均匀。加入35 ml 5% (w/v)聚乙烯亚胺水溶液于室温条件下絮凝，在加入18 ml 50%戊二醛水溶液于室温交联3 h。然后抽滤得到滤饼层，滤饼用去离子水洗涤后挤压制备成颗粒，干燥后得到固定化全细胞混合物。
在1 L反应体系中，分别加入终浓度为100 g/L淀粉、50 mM 磷酸钠缓冲液（pH7.5）以及固定化全细胞，使OD600 = 20左右，在70oC水浴摇床反应。反应结束后反应液于4 oC离心，进行高效液相色谱（HPLC）分析塔格糖含量；收集固定化颗粒，经缓冲液洗涤进行下一批次反应。实验结果如图10所示，结果表明，连续催化60批次，产物得率均大于50%，最高可达73%以上。实验结果如图10所示，结果表明，固定化全细胞混合物连续催化反应时，初始产物得率最高可达73%以上，随着连续催化反应的进行，产物得率逐渐降低，连续催化60批次后，产物得率仍可维持在52%。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaaacaaca aagggggaga tttgtatggt gaacgtttcc aatgccgttg 50
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcttgagctc gactctagag gatcctcagt caagtccctt ccacttgacc a 51
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtcaagtg gaagggactt gactgaggat cctctagagt cgagctcaag c 51
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caacggcatt ggaaacgttc accatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agaaacaaca aagggggaga tttgtatggg caaactgttt ggtaccttcg 50
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agcttgagct cgactctaga ggatccttaa cctttcagtg cttcttccag c 51
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctggaagaa gcactgaaag gttaaggatc ctctagagtc gagctcaagc t 51
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgaaggtacc aaacagtttg cccatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaaacaaca aagggggaga tttgtatgct gcgtctggat actcgctttc 50
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agcttgagct cgactctaga ggatccttaa ccagccaggc gtttacgagt c 51
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gactcgtaaa cgcctggctg gttaaggatc ctctagagtc gagctcaagc t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agaaacaaca aagggggaga tttgtatgaa agtttggctg gttggtgcct 50
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agcttgagct cgactctaga ggatccttat ttcaggttgc tataccattc t 51
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agaatggtat agcaacctga aataaggatc ctctagagtc gagctcaagc t 51
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aggcaccaac cagccaaact ttcatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaaagcgagt atccagacgc agcatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agaaacaaca aagggggaga tttgtatgtt caagccgaaa gcgatcgcgg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agcttgagct cgactctaga ggatccttaa cgcagcaggc ccagaaactg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cagtttctgg gcctgctgcg ttaaggatcc tctagagtcg agctcaagct 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgcgatcgc tttcggcttg aacatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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agaaacaaca aagggggaga tttgtatggt gaacgtttcc aatgccgttg 50
<210> 22
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgaaggtacc aaacagtttg cccattttga attcctcctt ttcagtcaag tcccttccac 60
ttgacc 66
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtcaagtgg aagggacttg actgaaaagg aggaattcaa aatgggcaaa ctgtttggta 60
ccttcg 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaaagcgagt atccagacgc agcattttga attcctcctt tttaaccttt cagtgcttct 60
tccagc 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctggaagaa gcactgaaag gttaaaaagg aggaattcaa aatgctgcgt ctggatactc 60
gctttc 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttttcagcgg atgttcggtg ttcattttga attcctcctt ttcaaccagc caggcgttta 60
cgagtc 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
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gactcgtaaa cgcctggctg gttgaaaagg aggaattcaa aatgaacacc gaacatccgc 60
tgaaaa 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
accgcgatcg ctttcggctt gaacattttg aattcctcct ttttaaatca gtttgaattc 60
accgctg 67
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<213> 人工序列
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cagcggtgaa ttcaaactga tttaaaaagg aggaattcaa aatgttcaag ccgaaagcga 60
tcgcggt 67
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gcttgagctc gactctagag gatccttaac gcagcaggcc cagaaactgc a 51
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<213> 人工序列
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tgcagtttct gggcctgctg cgttaaggat cctctagagt cgagctcaag c 51
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
caacggcatt ggaaacgttc accatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50

Claims (21)

1.一种产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是共表达α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌、或者是分别表达α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌的混合物。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的出发菌株为敲除蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中包括共表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的表达载体，或者为包含α-葡聚糖磷酸化酶的表达载体的基因工程菌、包含葡萄糖磷酸变位酶的表达载体的基因工程菌、包含葡萄糖磷酸异构酶的表达载体的基因工程菌、包含6-磷酸塔格糖差向异构酶的表达载体的基因工程菌和包含6-磷酸塔格糖磷酸酶的表达载体的基因工程菌的混合物。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶分别为耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述耐热是指在40℃以上具有酶的活性。
6.如权利要求1至5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中内源性的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，α-淀粉酶基因，孢子形成RNA 聚合酶 σF因子基因，和表面活性肽合成酶亚基3基因均被失活或敲除。
7.一种表达载体，其特征在于，其包含α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因，并能够实现这些基因的共表达。
8.利用如权利要求1至6任一项所述的基因工程菌的全细胞催化淀粉制备生产塔格糖的方法，其包括下述步骤：
(1) 将所述枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵获得全细胞；
(2) 将步骤（1）获得的枯草芽孢杆菌全细胞进行细胞膜通透性处理，获得透性全细胞；
(3) 利用步骤（2）获得的透性全细胞催化淀粉制备塔格糖，其中对于共表达的枯草芽孢杆菌工程菌全细胞直接用于催化，对于分别表达各种酶的枯草芽孢杆菌工程菌全细胞，则进行混合用于催化。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括将步骤（2）中获得的枯草芽孢杆菌透性全细胞进行固定化处理，获得固定化全细胞，或者固定化全细胞混合物，然后再用于催化。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的全细胞的制备是通过适于表达外源蛋白的发酵方法获得的。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的细胞膜通透性处理是通过热处理、添加有机溶剂和/或添加表面活性剂处理获得。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自丙酮、乙腈；所述表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、Tween-80。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述热处理的温度为45-100℃，热处理时间为10-100 min；处理时细胞浓度为OD600 = 10-300。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述热处理的温度为70-80℃，热处理时间为50-70 min；处理时细胞浓度为OD600 = 30-150。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述热处理是在选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液的缓冲液中进行。
16.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中催化的反应体系中，底物淀粉的浓度为50-300 g/L；反应条件为：在pH 5.0-8.0、40-80℃下反应0.5-96 h。
17.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中催化的反应体系中，底物淀粉的浓度为100-200 g/L；反应条件为：pH 6.5-7.5、45-75℃下反应12-60 h。
18.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中催化的反应是在选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液的缓冲液中进行的。
19.如权利要求8所述的方法，其特征在于，对于分别表达各种酶的枯草芽孢杆菌工程菌透性全细胞，其混合物是将表达α-葡聚糖磷酸化酶的透性全细胞、表达葡萄糖磷酸变位酶的透性全细胞、表达葡萄糖磷酸异构酶的透性全细胞、表达6-磷酸塔格糖差向异构酶的透性全细胞、表达6-磷酸塔格糖磷酸酶的透性全细胞按比例为(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)进行混合。
20.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述透性全细胞固定化处理方法为：用磷酸钠或磷酸钾缓冲液重悬所述透性全细胞，加入无机土，搅拌均匀；随后加入聚乙烯亚胺水溶液进行絮凝，再加入交联剂进行交联；然后抽滤得到滤饼层，滤饼用去离子水洗涤后挤压制备成颗粒，干燥后得到固定化全细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述无机土选自蒙脱土、硅藻土、高岭土和膨润土；所述交联剂选自戊二醛、三羟甲基磷、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、环氧氯丙烷和京尼平。
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