CN109402158B

CN109402158B - 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法

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Publication number: CN109402158B
Application number: CN201811072267.6A
Authority: CN
Inventors: 崔凤杰; 满再伟; 孙文敬
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-09-14
Also published as: CN109402158A

Abstract

本发明涉及一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术等领域；本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达从头合成岩藻糖基乳糖途径所需的编码GDP‑甘露糖‑6‑脱氢酶、GDP‑岩藻糖合成酶、乳糖通透酶和α‑1,2‑岩藻糖转移酶或α‑1,3‑岩藻糖转移酶的基因，构建重组谷氨酸棒杆菌，以实现2’‑岩藻糖基乳糖或3‑岩藻糖基乳糖的合成；并通过过表达重组谷氨酸棒杆菌中编码磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，获得岩藻糖基乳糖的高产；本发明方法得到的工程菌可利用葡萄糖或甘油合成岩藻糖基乳糖，具有生长快、安全性高等优势，工业化生产的潜力明显。

Description

一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法

技术领域

本发明涉及一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术等领域。

背景技术

2’-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2’-FL）和3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）是人乳中含量最丰富的一类岩藻糖基低聚糖。研究表明，哺乳阶段和地理区域分布显著影响乳汁中分泌的2’-FL浓度。如经10个国家的435名妇女的调查发现，78%的中国育儿母亲乳汁中含有分泌的2’-FL，而菲律宾仅46%育儿母亲乳汁中含有分泌的2’-FL。目前，美国、欧盟和中国等管理部门已对人乳寡糖的安全性、适用性以及使用剂量等进行规范。

一般人乳寡糖可通过分离纯化或者体外合成法生产。但因其含量低、原料来源不足以及步骤繁琐等问题，无法实现其从母乳中直接分离纯化制备。体外合成人乳寡糖主要包括化学合成法、酶法合成（包括化学-酶法）以及生物法等。其中，化学法需要精确地选择性保护不同羟基以及去保护等反应，过程复杂，副反应和副产物比例高，无法实现高效率合成。目前国内外研究较多的是采用酶法合成（化学-酶法）人乳寡糖。作为化学合成法的有效替代途径，可根据糖基供体与受体的构型筛选合适的酶类，可以减少化学法中存在的严谨的设计保护基团及立体异构性等要求。然而，供体核糖苷价格昂贵，酶催化活性低，每批次合成量仅为毫克级，无法实现规模化和工业化生产的迫切需要。近5年来，利用系统生物学、代谢工程和途径工程等技术手段构建大肠杆菌基因工程菌生产人乳寡糖（特别是2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖）的研究持续受到关注。然而，大肠杆菌发酵过程易积累乙酸等副产物，严重抑制菌体生长、底物转化率和产物产量；另外，大肠杆菌培养过程中需要添加一定浓度的抗生素以及产内毒素等均严重限制了人乳寡糖作为营养强化剂在婴幼儿产品开发和应用的领域。

目前尚未发现有通过重组菌来发酵生产人乳寡糖的报道。

发明内容

本发明的目的是提供高效生产岩藻糖基乳糖的手段。具体的，本发明的目的在于提供一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法。

本发明公开了一种通过在谷氨酸棒杆菌中表达GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG和乳糖通透酶基因lacY，以及α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC或α-1,2-岩藻糖转移酶wbgL合成2’-岩藻糖基乳糖，或α-1,3-岩藻糖转移酶futA合成3-岩藻糖基乳糖（详见图1），并通过强化谷氨酸棒杆菌中编码磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶（ManB）和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶（ManC）基因的表达量，构建而成的高效合成2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的重组谷氨酸棒杆菌及生产方法，为安全高效生产营养强化剂人乳寡糖提供行之有效的解决策略和途径。所构建的重组菌能以葡萄糖和甘油等为底物分别合成2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。

本发明提供一种重组表达质粒载体，所述重组表达质粒载体包含超氧化物歧化酶编码基因sod启动子与由所述sod启动子调控表达的微生物来源的基因融合形成的基因，所述微生物来源的基因包括编码GDP-甘露糖-6-脱氢酶（Gmd）、GDP-岩藻糖合成酶（WcaG）、乳糖通透酶（lacY）、α-1,2-岩藻糖转移酶（FutC）或α-1,3-岩藻糖转移酶（FutA）中任一种或多种的基因。

所述重组表达质粒载体是采用重叠延伸PCR将所述sod启动子序列与编码GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、乳糖通透酶、α-1,2-岩藻糖转移酶或α-1,3-岩藻糖转移酶中的任一种或多种的基因克隆到表达载体上融合形成，所述的表达载体包括pXMJ19。

进一步的，所述重组表达质粒载体还包括超氧化物歧化酶编码基因sod启动子与编码磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶（ManB）和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶（ManC）中的任一种或多种的基因融合形成的基因。

进一步的，所述重组表达质粒载体是采用重叠延伸PCR将所述sod启动子序列与编码磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶（ManB）和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶（ManC）中的任一种或多种的基因克隆到表达载体上融合形成，所述的表达载体包括pEC-XK99E。

本发明还提供一种产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌，其特征在于，所述工程菌是采用上述重组表达质粒载体，转化宿主细菌得到。所述宿主细菌为谷氨酸棒杆菌。

本发明还提供所述产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌用于生产2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖。

本发明还提供一种岩藻糖基乳糖的生产方法，采用所述谷氨酸棒杆菌代谢工程菌，以乳糖和葡萄糖或甘油为底物生产，所述方法包括如下步骤：

（1）配制发酵培养基和种子培养基，其碳源为葡萄糖或粗甘油中的一种或两种，浓度为5.0~100.0 g/L；

（2）培养上述工程菌，在培养基中活化工程菌种子液，并在相应规模的发酵罐中逐级放大制备种子培养液；

（3）将工程菌种子液以1.0%-5.0%的接种量接种到含有发酵培养基的摇瓶中，加入10.0-100.0 g/L乳糖。

所述发酵罐培养条件：25℃-37℃，通气量0.5-2.0 vvm，搅拌转速100 -600 rpm，培养36-100h；所述摇瓶条件为：25 -37℃，转速160 -500 rpm，培养36-100h。

使用该方法发酵重组谷氨酸棒杆菌可得发酵液中2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产量在10.0-70.0 g/L 以上。

优选的，所述GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因（gmd）来源于大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）、粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）中任意一种等。

进一步优选的，所述GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因（gmd）来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。

优选的，所述GDP-岩藻糖合成酶基因（wcaG）来源于以下任意一种：大肠杆菌（Escherichia coli），诺氏菌（Plasmodium knowlesi），茶翅蝽（Halyomorpha halys），内华达古白蚁（Zootermopsis nevadensis），海豆芽（Lingula anatina），秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）等。

进一步优选的，所述GDP-岩藻糖合成酶基因（wcaG）来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。

优选的，所述用于合成2’-岩藻糖基乳糖的α-1,2-岩藻糖转移酶基因（futC）来源于以下任意一种：幽门螺旋菌（Helicobacter pylori），胆型螺旋杆菌（Helicobacter bilis），大肠杆菌（Escherichia coli），卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus），栖瘤胃普雷沃菌（Prevotella ruminicola），单形拟杆菌（Bacteroides uniformis），蓝细菌（Thermosynechococcus elongatus）等。

进一步优选的，所述用于合成2’-岩藻糖基乳糖的α-1,2-岩藻糖转移酶基因（futC）来源于幽门螺旋菌（Helicobacter pylori）。

优选的，所述用于合成3-岩藻糖基乳糖的α-1,3-岩藻糖转移酶基因（futA）来源于以下任意一种：幽门螺旋菌（Helicobacter pylori），Helicobacter trogontum，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），大肠杆菌（Escherichia coli），鲐鱼类(斑马鱼)（Danio rerio (zebrafish) ），灰仓鼠（Cricetulus griseus）等。

进一步优选的，所述用于合成3-岩藻糖基乳糖的α-1,3-岩藻糖转移酶基因（futA）来源于幽门螺旋菌（Helicobacter pylori）。

优选的，所述用于转运乳糖用于合成2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的乳糖通透酶基因来源于以下任意一种：大肠杆菌（Escherichia coli），稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae），酵母菌（Kluyveromyces marxianus），瓶霉（Phialophora attae）等。

进一步优选的，所述用于转运乳糖用于合成2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的乳糖通透酶基因（lacY）来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。

优选的，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发宿主菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

谷氨酸棒杆菌为FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)生物安全菌，在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒杆菌是生产食品安全级人乳寡糖的有效途径。谷氨酸棒杆菌中自身存在磷酸甘露糖异构酶（ManA, mannose-6-phosphate isomerase）、磷酸甘露糖变位酶(ManB, phosphomannomutase)和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC, GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)编码基因，同时本身不存在乳糖代谢途径，无需敲除β-半乳糖苷酶基因（lacZ）即可在胞内累积底物乳糖。

本发明通过在“generally regarded as safe”(GRAS)生物安全菌谷氨酸棒杆菌中表达从头合成2’-岩藻糖基乳糖途径（de novo 2’- FL synthesis pathway）所需的Gmd编码基因gmd、WcaG编码基因wcaG、乳糖通透酶编码基因lacY和α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC或α-1,3-岩藻糖转移酶基因futA，并加强表达谷氨酸棒杆菌中自身存在ManA、ManB和ManC的表达量，以实现2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖在谷氨酸棒杆菌中的高效合成，使得重组菌株能积累高浓度的2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖，相关构建方法还未见相关报道。本发明的重组谷氨酸棒杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖，还具有培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、遗传稳定、表达水平高等诸多优势，具有明显的工业化生产的潜力。

附图说明

图1 为谷氨酸棒杆菌中构建从头合成2’-岩藻糖基乳糖/3-岩藻糖基乳糖的途径（de novo 2’- FL/3-FL synthesis pathway）。

图2为重组谷氨酸棒杆菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖产量结果。

图3为重组谷氨酸棒杆菌发酵生产3-岩藻糖基乳糖产量结果。

具体实施方式

以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实施例中使用的质粒、PCR 试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。但本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。

本发明实施例中所述的2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖测定方法为HPLC法。

具体为：发酵液经离心后(10000×g，4 ^oC，10 min)取上清用于HPLC测定。色谱柱：Luna C18 (2) 反相柱 (250 mm× 4.6 mm, 5 μm, Phenomenex, Germany)；流动相：溶液1（四氢呋喃1% (v/v)，磷酸0.425% (v/v) and 1-丁胺0.3% (v/v)）和溶液2（乙腈）；流速：1.0 mL/min，梯度洗脱（洗脱初期25min内97.5%溶液1和2.5%的溶液2；然后80%溶液1和20%的溶液2继续洗脱20min）；检测器：RF2000 荧光检测器；柱温：50 ℃；进样量：10 µL。

本实施例中涉及到的谷氨酸棒杆菌超氧化物歧化酶编码基因sod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2所示、GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG、乳糖通透酶基因lacY、α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC和α-1,3-岩藻糖转移酶基因futA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO .3、SEQ ID NO .4、SEQID NO .5、SEQ ID NO .6所示的序列。

实施例1 ：产2’-岩藻糖基乳糖谷氨酸棒杆菌重组工程菌的构建

采用谷氨酸棒杆菌自身存在的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）编码基因sod启动子表达各个基因（sod启动子、gmd基因、wcaG基因、lacY基因、futC基因），可以不用添加诱导剂即可实现表达。采用重叠延伸PCR将sod启动子序列与要表达的目的基因融合。

（1）以谷氨酸棒杆菌基因组（NCBI登录号：GCA_000011325.1）为模板，设计引物：

上游引物sod-gmdF1（SEQ ID NO .10）: AAAACTGCAGtagctgccaattattccggg

下游引物sodR（SEQ ID NO .11）: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG；

PCR扩增sod启动子序列。

以大肠杆菌BL21基因组（登录号：GCA_000833145.1）为模板，设计引物：

上游引物sod-gmdF2（SEQ ID NO .12）:

CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGTCAAAAGTCGCTCTCATC

下游引物sod-gmdR2（SEQ ID NO .13）:

ACGCGTCGACTTATGACTCCAGCGCGATCGC；

PCR扩增GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因（gmd）基因序列。

PCR产物经胶回收纯化获得sod启动子序列和gmd基因序列片段。将获得的sod启动子序列和gmd基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-gmdF1和sod-gmdR2引物对PCR扩增获得sod-gmd融合基因序列；PCR产物经胶回收纯化获得sod-gmd融合基因片段。

将获得的sod-gmd融合基因片段和pXMJ19质粒进行PstI/SalI双酶切，酶切产物经胶回收纯化。将纯化后的sod-gmd融合基因酶切片段和pXMJ19质粒酶切片段利用DNA 连接酶进行过夜连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，氯霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，得到构建成功的质粒pXMJ19-gmd。

（2）以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计引物：

上游引物sod-wcaGF1（SEQ ID NO .14）: ACGCGTCGACTAGCTGCCAATTATTCCGG

下游引物sodR（SEQ ID NO .11）: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG；

PCR扩增sod启动子序列。

以大肠杆菌BL21基因组为模板，设计引物：

sod-wcaGF2（SEQ ID NO .15）:

CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGAGTAAACAACGAGTTTTTATTG和下游引物

sod-wcagr2（SEQ ID NO .16）: CTAGTCTAGATTACCCCCGAAAGCGGTCTTG，

PCR扩增wcaG基因序列。

PCR产物经胶回收纯化获得sod启动子序列和wcaG基因序列片段。

将获得的sod启动子序列和wcaG基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-wcaGF1/sod-wcaGR2引物PCR扩增获得sod-wcaG融合基因序列。PCR产物经胶回收纯化获得sod-wcaG融合基因片段。

将获得的sod-wcaG融合基因片段和pXMJ19-gmd质粒进行SalI/XbaI双酶切，酶切产物经胶回收纯化。将纯化后的sod-wcaG融合基因酶切片段和pXMJ19-gmd质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，氯霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，得到构建成功的质粒pXMJ19-gmd- wcaG。

（3）sod-lacY融合基因片段获取方式同上。

以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计引物：

上游引物sod-lacYF1（SEQ ID NO .17）: CTAGTCTAGATAGCTGCCAATTATTCCGGG和

下游引物sodR（SEQ ID NO .11）: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG。

以大肠杆菌BL21基因组为模板，设计上游引物

sod-lacYF2（SEQ ID NO .18）:

CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGTACTATTTAAAAAACACAAAC和下游引物sod-lacYR2（SEQ ID NO .19）: TCCCCCCGGGTTAAGCGACTTCATTCACCTGACG。

PCR扩增sod启动子序列和lacY基因序列。

PCR产物经胶回收纯化获得sod启动子序列和lacY基因序列片段。

将获得的sod启动子序列和lacY基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-lacYF1/sod-lacYR2引物PCR扩增获得sod-lacY融合基因序列。PCR产物经胶回收纯化获得sod-lacY融合基因片段。

将获得的sod-lacY融合基因片段和pXMJ19-gmd-wcaG质粒进行XbaI/XmaI双酶切，酶切产物经胶回收纯化。将纯化后的sod-lacY融合基因酶切片段和pXMJ19-gmd-wcaG质粒酶切片段利用DNA ligase进行过夜连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，氯霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，得到构建成功的质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY。

（4）以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计引物：

上游引物sod-futCF1（SEQ ID NO .20）: TCCCCCCGGGTAGCTGCCAATTATTCCGGG和

下游引物sodR（SEQ ID NO .11）: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG；

以H. pylori基因组（登录号：GCA_000008525.1）为模板，设计上游引物sod-futCF2（SEQ ID NO .21）: CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGGCTTTTAAAGTGGTGCAAAT和下游引物 sod-futCR2（SEQ ID NO .22）: CGGGGTACCTTAAGCGTTATATTTTTGGG。

PCR扩增sod启动子序列和futC基因序列。PCR产物经胶回收纯化获得sod启动子序列和futC基因序列片段。

将获得的sod启动子序列和futC基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-futCF1/sod-futCR2引物PCR扩增获得sod-futC融合基因序列。PCR产物经胶回收纯化获得sod-futC融合基因片段。将获得的sod-futC融合基因片段和pXMJ19-gmd-wcaG-lacY质粒进行XmaI/KpnI双酶切，酶切产物经胶回收纯化。将纯化后的sod-futC融合基因酶切片段和pXMJ19-gmd-wcaG-lacY质粒酶切片段进行利用DNA连接酶进行过夜连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，氯霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，得到构建成功的质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY-futC。

（5）重组谷氨酸棒杆菌构建：

用液体LB 培养基过夜培养含有重组质粒的大肠杆菌JM109菌株，抽提质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY-futC。培养谷氨酸棒杆菌ATCC13032，制备感受态细胞，并电击转化质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY-futC进入该菌株，获得能产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株谷氨酸棒杆菌CgdGYC。

实施例2：以葡萄糖为碳源重组谷氨酸棒杆菌CgdGYC摇瓶发酵生产2’-岩藻糖基乳糖

（1）种子培养基为：葡萄糖5.0g/L，氮源和微量元素组成为：1.0 g/L 酵母提取物，2.0 g/L NH₄Cl，10.0 g/L Na₂HPO₄·7H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，0.25 g/LMgSO₄·7H₂O，15.0 mg/L CaCl₂·2H₂O，10 mg/L维生素B1。

发酵培养基为：葡萄糖50.0g/L，氮源和微量元素组成为：2.0 g/L 酵母提取物，2.0 g/L NH₄Cl，10.0 g/L Na₂HPO₄·7H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，0.25 g/LMgSO₄·7H₂O，15.0 mg/L CaCl₂·2H₂O，10 mg/L维生素B1， 0.1% (v/v) Triton-X 100。

（2）挑取重组菌株谷氨酸棒杆菌CgdGYC单菌落于装液量100mL的种子液中，30 ^oC、180 r/min回旋式摇床培养至OD₅₆₂≈10.0作为种子液。

（3）将重组菌株谷氨酸棒杆菌种子液以1.0 %的接种量接种到100mL发酵培养基/500mL摇瓶中，于OD_600nm约为5，加入终浓度为30.0 g/L的乳糖。摇瓶条件为：35℃，转速200rpm，继续培养36h，发酵结束后测定发酵液中2’-岩藻糖基乳糖产量在22.0 g/L 以上。

实施例3：强化表达谷氨酸棒杆菌中manA、manB和manC基因表达提升重组谷氨酸棒杆菌2’-岩藻糖基乳糖的产量

本实施例中涉及的增强合成2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖合成所需的磷酸甘露糖异构酶基因manA（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO .7所示）、磷酸甘露糖变位酶基因manB（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO .8所示）和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO .9所示）为谷氨酸棒杆菌自身基因组中所有。

（1）sod启动子序列和manA基因序列获取：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计上游引物sod-manAF1（SEQ ID NO .23）: TCCCCCGGGTAGCTGCCAATTATTCCGGG和下游引物sodR:GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG，PCR扩增sod启动子序列。

同样以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计上游引物sod-manAF2（SEQ ID NO .24）:CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGGAGCTATTGGAAGGCTCAC和下游引物sod-manAR2（SEQ ID NO.25）: TCCCCCGGGCTAAACCCTAGCGAGGAATAC，PCR扩增manA基因序列。

经胶回收纯化获得sod启动子序列和manA基因序列片段。

将sod启动子序列和manA基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-manAF1/sod-manAR2引物PCR扩增获得sod-manA融合基因序列。PCR产物经胶回收纯化获得sod-manA融合基因片段。将获得的sod-manA融合基因片段和pEC-XK99E质粒进行SmaI单酶切，酶切产物经胶回收纯化。sod-manA融合基因酶切片段和pEC-XK99E质粒酶切片段经DNA连接酶过夜连接后热激转化大肠杆菌JM109感受态，卡那霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，构建质粒pEC-XK99E-manA。

（2）sod-manB融合基因序列获取同上：

PCR扩增sod启动子序列所需引物为：

上游引物sod-manBF1（SEQ ID NO .26）: CGCGGATCCTAGCTGCCAATTATTCCGGG和

下游引物sodR: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG；

PCR扩增manB基因序列所需引物为：

上游引物sod-manBF2（SEQ ID NO .27）:

CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGCGTACCCGTGAATCTGTCAC和下游引物sod-manBR2（SEQID NO .28）: CGCGGATCCTTATGCGCGGATAATCCCTAGAATC。

PCR分别扩增sod启动子序列和manB基因序列。将经胶回收纯化获得sod启动子序列和manB基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-manBF1/ sod-manBR2引物PCR扩增获得sod-manB融合基因序列。sod-manB融合基因片段和pEC-XK99E-manA质粒进行BamHI单酶切，酶切产物经胶回收纯化后利用DNA连接酶进行过夜连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，卡那霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，构建质粒pEC-XK99E-manA-manB。

（3）sod-manC融合基因序列获取同上：

PCR扩增sod启动子序列所需引物为：

上游引物sod-manCF1（SEQ ID NO .29）: CTAGTCTAGATAGCTGCCAATTATTCCGGG和

下游引物sodR: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG。

PCR扩增manC基因序列所需引物为：

上游引物sod-manCF2（SEQ ID NO .30）:

CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGACTTTAACTGACAACAGC和

下游引物sod-manCR2（SEQ ID NO .31）:

CTAGTCTAGACTACTGATCAGACGAAAAACGAATTC。

PCR分别扩增sod启动子序列和manC基因序列。将经胶回收纯化获得sod启动子序列和manC基因序列片段各1 μL混合加入PCR反应体系中，以sod-manCF1/sod-manCR2引物PCR扩增获得sod-manC融合基因序列。sod-manC融合基因片段和pEC-XK99E-manA-manB质粒进行XbaI单酶切，酶切产物经胶回收纯化后利用DNA ligase进行过夜连接。连接产物经热激转化大肠杆菌JM109感受态，卡那霉素抗性平板筛选转化子并培养，进行质粒提取和酶切或PCR验证，构建质粒pEC-XK99E-manA-manB-manC。

（4）用液体LB 培养基过夜培养含有重组质粒的大肠杆菌JM109菌株，抽提质粒pEC-XK99E-manA-manB-manC。培养谷氨酸棒杆菌CgdGYC，制备感受态细胞，并电击转化质粒pEC-XK99E-manA-manB-manC进入该菌株，获得能产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株CgdGYCABC。

实施例4：葡萄糖为碳源重组谷氨酸棒杆菌CgdGYCABC发酵罐生产2’-岩藻糖基乳糖

发酵培养基为：葡萄糖50.0g/L，氮源和微量元素组成为：2.0 g/L 酵母提取物，2.0 g/L NH₄Cl，10.0 g/L Na₂HPO₄·7H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，0.25 g/LMgSO₄·7H₂O，15.0 mg/L CaCl₂·2H₂O，10 mg/L 维生素B1， 0.1% (v/v) Triton-X 100。

（2）挑取重组菌株CgdGYCABC单菌落于装液量100mL的种子液中，30 ^oC、180 r/min回旋式摇床培养至OD₅₆₂≈10.0作为种子液。

（3）将重组谷氨酸棒杆菌种子液60mL以2.0%的接种量接种到工作体积为7L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度30 ^oC，搅拌转速600 r/min，通气量1vvm，pH 7.0(补加氨水自动控制)。发酵8h后进入对数生长期，当发酵至24h（OD_600nm约为3.8）,进入稳定期，加入终浓度为50.0 g/L乳糖。继续培养至52h后，菌体OD_600nm达到4.6，乳糖含量显著下降至4.0g/L左右，待发酵结束经检测，产物2’-岩藻糖基乳糖的浓度可达35.0 g/L。

实施例5 ：产3-岩藻糖基乳糖谷氨酸棒杆菌重组工程菌的构建

采用谷氨酸棒杆菌自身存在的超氧化物歧化酶编码基因sod启动子表达各个基因（sod启动子、gmd基因、wcaG基因、lacY基因、futA基因），可以不用添加诱导剂即可实现表达。

其中，sod启动子序列分别与要表达的目的基因（gmd，wcaG和lacY）融合获得sod- gmd、sod-wcaG和sod-lacY等融合基因片段的步骤如实施例1中所述。

类似地，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计上游引物和下游引物PCR扩增sod启动子序列，这里引物采用同实施例1步骤（4）中设计的

上游引物sod-futCF1（SEQ ID NO .20）: TCCCCCCGGGTAGCTGCCAATTATTCCGGG和下游引物sodR: GGGTAAAAAATCCTTTCGTAGG。

以H. pylori基因组（登录号：GCA_000008525.1）为模板，设计上游引物sod-futAF2（SEQ ID NO .32）: CCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGTTCCAACCCCTATTAGACG

和下游引物sod-futAR2 sod-futAR2（SEQ ID NO .33）:

CGGGGTACCTTACAAACCCAATTTTTTAAC。

PCR扩增α-1,3-岩藻糖转移酶基因futA基因序列。

PCR产物经胶回收纯化获得sod启动子序列和futA基因序列片段。并按实施例1中所述步骤构建质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY-futA。

类似地，按照实施例1中所述步骤提取抽提质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY-futC。制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，并电击转化质粒pXMJ19-gmd-wcaG-lacY-futC进入该菌株，获得能3-岩藻糖基乳糖的重组菌株谷氨酸棒杆菌CgdGYA。

类似地，按照实施例3所述步骤，构建质粒pEC-XK99E-manA-manB-manC，培养谷氨酸棒杆菌CgdGYA，制备感受态细胞，并电击转化质粒pEC-XK99E-manA-manB-manC进入该菌株，获得产3-岩藻糖基乳糖的重组菌株CgdGYAABC，强化表达谷氨酸棒杆菌中manA、manB和manC基因表达提升重组谷氨酸棒杆菌3-岩藻糖基乳糖的产量。

实施例6：葡萄糖为碳源重组谷氨酸棒杆菌CgdGYAABC发酵罐生产3-岩藻糖基乳糖

（2）挑取重组菌株CgdGYAABC单菌落于装液量100mL的种子液中，30 ^oC、180 r/min回旋式摇床培养至OD₅₆₂≈10.0作为种子液。

（3）将重组谷氨酸棒杆菌种子液60mL以2.0%的接种量接种到工作体积为7L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度30 ^oC，搅拌转速600 r/min，通气量1vvm，pH 7.0(补加氨水自动控制)。发酵8h后进入对数生长期，当发酵至24h（OD_600nm约为3.8）,进入稳定期，加入终浓度为60.0 g/L乳糖。继续培养至52h后，菌体OD_600nm达到4.9，乳糖含量显著下降至5.0g/L左右，待发酵结束经检测，产物3-岩藻糖基乳糖的浓度可达40.0 g/L左右。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌及其构建方法

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60

ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120

gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180

gattttttac cc 192

<210> 2

<211> 1122

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgtgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctccaac ctgacacgca ttttgcgtga agtgcagccg 240

gatgaagtgt ataacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccggaa 300

tataccgcag acgttgatgc gatgggtacg ctgcgcctgc tcgaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaacccg tttttatcag gcttccacct ctgaactgta cggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga aactacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgcgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggtattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggtg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa tatcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccatgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcaacagg aacagccgga agatttcgtt attgctaccg gcgttcagta ctccgtacgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagttg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggt 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgccgt tgacccgcgt tacttccgtc cggcagaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 3

<211> 966

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc tgccatcagg 60

cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120

ctgttggaca gccgcgcggt gcatgatttc tttgccagcg aacgcattga ccaggtctat 180

ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gctaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240

taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300

aaactgctgt ttctcggatc gtcctgtatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360

gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420

atcgccggga tcaaactgtg cgaatcttac aatcgccagt acggacgaga ttaccgttca 480

gtcatgccga ccaacctgta cgggccgcac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540

atcccagcat tgctgcgccg cttccacgag gcgacggcac agaatgcacc ggacgtggtg 600

gtatggggca gcggtacacc gatgcgtgaa ttcctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660

agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgctg 720

tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcaccatcc gtgaactggc gcaaaccatc 780

gccaaagtgg tgggttacaa aggtcgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggtacg 840

ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900

ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960

gggtaa 966

<210> 4

<211> 1254

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 4

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254

<210> 5

<211> 903

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 5

atggctttta aagtggtgca aatttgtggg gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60

ttcgctaaaa gtttgcaaaa acaccttaat acgcccgtgc tattagacac tacttctttt 120

gattggagca ataggaaaat gcaattagag cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgaat 180

gcaaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa catctcccca agttagtaag agatgcactc 240

aaatacatag gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctaaattg 300

ttaaagccaa gccgtttgac ttattttttt ggctatttcc aagatccacg atattttgat 360

gctatatcct ctttaatcaa gcaaaccttc actctacccc ccccccccga aaataataaa 420

aataataata aaaaagagga agaataccag cgcaagcttt ctttgatttt agccgctaaa 480

aacagcgtat ttgtgcatat aagaagaggg gattatgtgg ggattggctg tcagcttggt 540

attgattatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaagc gcgtgccaaa catggagctt 600

tttgtgtttt gcgaagactt aaaattcacg caaaatcttg atcttggcta ccctttcacg 660

gacatgacca ctagggataa agaagaagag gcgtattggg atatgctgct catgcaatct 720

tgcaagcatg gcattatcgc taatagcact tatagctggt gggcggctta tttgatggaa 780

aatccagaaa aaatcattat tggccccaaa cactggcttt ttgggcatga aaatattctt 840

tgtaaggaat gggtgaaaat agaatcccat tttgaggtaa aatcccaaaa atataacgct 900

taa 903

<210> 6

<211> 1278

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 6

atgttccaac ccctattaga cgcctttata gaaagcgctt ccattgaaaa aatggcctct 60

aaatctcccc ccccccccct aaaaatcgct gtggcgaatt ggtggggaga tgaagaaatt 120

aaagaattta aaaagagcgt tctttatttt atcctaagcc aacgctacgc aatcaccctc 180

caccaaaacc ccaatgaatt ttcagatcta gtttttagca atcctcttgg agcggctaga 240

aagattttat cttatcaaaa cactaaacga gtgttttaca ccggtgaaaa cgaatcacct 300

aatttcaacc tctttgatta cgccataggc tttgatgaat tggattttaa tgatcgttat 360

ttgagaatgc ctttgtatta tgcccatttg cactataaag ccgagcttgt taatgacacc 420

actgcgccct acaaactcaa agacaacagc ctttatgctt taaaaaaacc ctctcatcat 480

tttaaagaaa accaccctaa tttgtgcgca gtagtgaatg atgagagcga tcttttaaaa 540

agagggtttg ccagttttgt agcgagcaac gctaacgctc ctatgaggaa cgctttttat 600

gacgctctaa attccataga gccagttact gggggaggaa gtgtgagaaa cactttaggc 660

tataaggttg gaaacaaaag cgagttttta agccaataca agttcaatct ctgttttgaa 720

aactcgcaag gttatggcta tgtaaccgaa aaaatccttg atgcgtattt tagccatacc 780

attcctattt attgggggag tcccagcgtg gcgaaagatt ttaaccctaa aagttttgtg 840

aatgtgcatg atttcaacaa ctttgatgaa gcgattgatt atatcaaata cctgcacacg 900

cacccaaacg cttatttaga catgctctat gaaaaccctt taaacaccct tgatgggaaa 960

gcttactttt accaagattt gagttttaaa aaaatcctag atttttttaa aacgatttta 1020

gaaaacgata cgatttatca caaattctca acatctttca tgtgggagta cgatctgcat 1080

aagccgttag tatccattga tgatttgagg gttaattatg atgatttgag ggttaattat 1140

gaccggcttt tacaaaacgc ttcgccttta ttagaactct ctcaaaacac cacttttaaa 1200

atctatcgca aagcttatca aaaatccttg cctttgttgc gcgcggtgag aaagttggtt 1260

aaaaaattgg gtttgtaa 1278

<210> 7

<211> 1185

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 7

atggagctat tggaaggctc actgcgcacc tacccatggg gttcaagaac actgatcgct 60

gatctcaaag gcgaagaatc accatcgtct cgcccagagg ccgaagtctg gttcggtgcc 120

cacccaggat caccatcaac catcggtgga aacgcactca acgaagtcat cgcagcgaac 180

cccgaagaag cattgggcac gcgtgttgcc gaagcgtttg aaaatgagct tccattcctc 240

ctcaaaatcc tcgcagcggg agcaccccta tcactgcagg cccacccatc gctggaacag 300

gcccgtgaag gattcgcccg cgaaaactca gcaggaattg acctcggcgc accgaaccgc 360

aactaccgcg acccaaacca caagccagag ctgatcgttg ctctcacgga attcatcgcg 420

atggcaggct tccgcccact gcggaacacc ctcaccattt tcgacgccct cgcctgcgaa 480

cccctcgacc gctaccgcag catgctcacc gtcgacaacg aggaagaatc cctccgcgca 540

ctgtttacca cctggatcac catccccatc ggtaaacgac acgaactcat cgatgccctc 600

atcagcaacg cccacaccta ccttgaggca agcgatcgtg acgaggacat cgcattcgtg 660

ctctcacaca tcatcgagct caacgaacag taccccggcg atgtcggcgt tctgggtgct 720

ctgctgttga acttctacaa acttgcccca ggcgaagccc tctacctcga cgccgcaaac 780

cttcacgcat acatcagcgg cctcggcgta gagatcatgg cgaactccga caacgtgctc 840

cgcggtggac tgacatccaa atacgtcgac gtcccggagc ttgtgcgcgt gttggatttc 900

aactctttgg aaaacgctcg cgtggacgtt gaagaagacg gtgcaacgac ccactaccca 960

gttccaatca acgaattcca actcgatcgc gttgcagttc agggcgaagc agaagccaac 1020

cacgatggtc ccatgattgt tctgtgcacc tccggaactg tttccttgga agcaggggag 1080

aagaccctcg aagtagcagc aggtcacgcc gcatgggttc cagcaaacga cccaaccatt 1140

gcgatgcgtt ctgaggacgc agaagtattc ctcgctaggg tttag 1185

<210> 8

<211> 1377

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 8

atgcgtaccc gtgaatctgt cacagctgta attaaggcgt atgacgtccg tggtgttgtt 60

ggtgtcgata ttgatgctga tttcatttct gagactggcg ctgcctttgg tcggctcatg 120

cgtagtgagg gtgaaaccac cgttgctatt ggccatgaca tgcgtgattc ctcccctgaa 180

ttggccaagg cgtttgccga tggcgtgact gcacagggtt tggatgttgt tcatttggga 240

ctgacttcta ctgatgagct gtactttgcg tccggaacct tgaagtgtgc tggtgcgatg 300

tttactgcgt cgcataaccc cgctgagtac aacggcatca agttgtgtcg tgcgggtgct 360

cgtccggtcg gtcaggattc tggtttggcc aacatcattg atgatctggt tgagggtgtt 420

ccagcgtttg atggtgagtc aggttcggtt tctgagcagg atttgctgag cgcatatgcc 480

gagtacctca atgagcttgt tgatctgaag aacatccgcc cgttgaaggt tgctgtggat 540

gcggcaaacg gcatgggtgg gttcactgtc cctgaggtat tcaagggtct gccacttgat 600

gttgcgccac tgtattttga gcttgacggc aatttcccca accatgaggc caatcctctg 660

gagcctgcca acctggttga tttgcagaag tttaccgtag agaccggatc tgatatcggt 720

ttggcgttcg acggcgatgc ggatcgttgc ttcgtggtcg atgagaaggg ccagccagtc 780

agcccttcgg cgatctgtgc gatcgtagcg gagcgttact tggagaagct tccgggttcc 840

accatcatcc acaacctgat tacctctaag gctgtgcctg aggtgattgc tgaaaacggt 900

ggcactgcgg tgcgtactcg cgtgggtcac tccttcatca aggcgaagat ggcagagacc 960

ggtgcggcct ttggtggcga gcactctgcg cactactact tcactgagtt cttcaatgcg 1020

gactccggca ttttggctgc gatgcacgtg ctggctgcgc tgggaagcca ggaccagcca 1080

ctcagtgaga tgatggctag gtataaccgg tacgttgctt caggcgagtt gaactcccgt 1140

ttggctaatg cagaggcgca gcaagagcgc acccaggctg tgctcgatgc gttcgctgat 1200

cgcaccgagt ccgtggacac ccttgacggc gtgactgtgg aactcaagga cacctccgcg 1260

tggttcaacg tgcgtgcgtc caacaccgag ccgctgcttc gcctcaatgt tgaagctgca 1320

tcgaaggaag aagtcgatgc gttggtagcg gagattctag ggattatccg cgcataa 1377

<210> 9

<211> 1089

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 9

atgactttaa ctgacaacag caaaaacgtt gatgctgtca tcttggtcgg tggcaaaggt 60

acccgactgc gccccctgac cgtcaatact ccaaagccaa tgctgccaac tgctggccac 120

ccattcttga cccacctttt ggcccgcatc aaggccgcag gcatcacaca cgtcgtgctg 180

ggaacgtcat tcaaagctga agtcttcgag gaatacttcg gagatggctc cgaaatgggc 240

ttggaaattg aatatgtcgt cgaggatcag cctttgggca ctggtggtgg catccgaaac 300

gtctacgaca agctgcgtca cgatactgcg attgtgttca acggcgatgt gctctccggt 360

gcggatctca acagcattct ggacacccac cgcgaaaagg acgcagatct gaccatgcat 420

ctcgtgcgcg tagctaaccc tcgtgcgttt ggttgcgtcc ccaccgatga ggatggtcgc 480

gtcagcgaat tccttgaaaa gaccgaagat ccaccaaccg atcagatcaa cgccggctgc 540

tacgtgttca agaaggaact catcgagcag atcccggcag gccgagcagt ttccgtcgag 600

cgcgaaacct tccctcagct gttggaagaa ggcaagcgag tcttcggcca cgtcgacgct 660

tcctactggc gcgacatggg caccccaagc gacttcgtcc gcggctcggc tgacctggtc 720

cgcggcattg cgtactcccc attgctcgaa ggcaaaacag gagagtcgct tgtcgacgcc 780

tccgccggcg ttcgcgacgg cgtcctgctg ctcggcggaa ccgtagtcgg ccgcggcact 840

gagatcggtg ccggctgccg cgttgacaac actgttattt tcgacggcgt caccattgaa 900

ccaggtgcgg tcattgaaaa ttccatcatt tcctcgggag cacgcatcgg tgctaatgcg 960

cacatctccg gttgcatcat tggcgagggc gcacaggttg gtgctcggtg tgaactcaac 1020

gcagggatgc gcgtcttccc aggcgttgtg atcccagaca gcggaattcg tttttcgtct 1080

gatcagtag 1089

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaactgcag tagctgccaa ttattccggg 30

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggtaaaaaa tcctttcgta gg 22

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctacgaaag gattttttac ccatgtcaaa agtcgctctc atc 43

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgcgtcgac ttatgactcc agcgcgatcg c 31

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgcgtcgac tagctgccaa ttattccgg 29

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctacgaaag gattttttac ccatgagtaa acaacgagtt tttattg 47

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctagtctaga ttacccccga aagcggtctt g 31

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctagtctaga tagctgccaa ttattccggg 30

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctacgaaag gattttttac ccatgtacta tttaaaaaac acaaac 46

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tccccccggg ttaagcgact tcattcacct gacg 34

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tccccccggg tagctgccaa ttattccggg 30

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cctacgaaag gattttttac ccatggcttt taaagtggtg caaat 45

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cggggtacct taagcgttat atttttggg 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcccccgggt agctgccaat tattccggg 29

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cctacgaaag gattttttac ccatggagct attggaaggc tcac 44

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcccccgggc taaaccctag cgaggaatac 30

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcggatcct agctgccaat tattccggg 29

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<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cctacgaaag gattttttac ccatgcgtac ccgtgaatct gtcac 45

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgcggatcct tatgcgcgga taatccctag aatc 34

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctagtctaga tagctgccaa ttattccggg 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctacgaaag gattttttac ccatgacttt aactgacaac agc 43

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctagtctaga ctactgatca gacgaaaaac gaattc 36

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctacgaaag gattttttac ccatgttcca acccctatta gacg 44

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cggggtacct tacaaaccca attttttaac 30

Claims

1.一种重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体包含谷氨酸棒杆菌超氧化物歧化酶编码基因sod启动子与由所述sod启动子调控表达的微生物来源的基因融合形成的基因，所述微生物来源的基因包括编码GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd、GDP-岩藻糖合成酶WcaG、乳糖通透酶lacY、α-1,2-岩藻糖转移酶FutC；

所述重组表达质粒载体还包括超氧化物歧化酶编码基因sod启动子与编码磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC的基因融合形成的基因；

所述sod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体是采用重叠延伸PCR将所述sod启动子序列与编码GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、乳糖通透酶、α-1,2-岩藻糖转移酶的基因克隆到表达载体上融合形成，所述的表达载体为pXMJ19。

3.根据权利要求1所述的重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体是采用重叠延伸PCR将所述sod启动子序列与编码磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC的基因克隆到表达载体上融合形成，所述的表达载体为pEC-XK99E。

4.一种重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体包含谷氨酸棒杆菌超氧化物歧化酶编码基因sod启动子与由所述sod启动子调控表达的微生物来源的基因融合形成的基因，所述微生物来源的基因包括编码GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd、GDP-岩藻糖合成酶WcaG、乳糖通透酶lacY、α-1,3-岩藻糖转移酶FutA的基因；

所述sod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体是采用重叠延伸PCR将所述sod启动子序列与编码GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、乳糖通透酶、α-1,3-岩藻糖转移酶的基因克隆到表达载体上融合形成，所述的表达载体为pXMJ19。

6.根据权利要求4所述的重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体是采用重叠延伸PCR将所述sod启动子序列与编码磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC的基因克隆到表达载体上融合形成，所述的表达载体为pEC-XK99E。

7.一种产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌，其特征在于，所述工程菌是采用权利要求1所述的重组表达质粒载体，转化宿主细菌得到，所述宿主细菌为谷氨酸棒杆菌。

8.一种产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌，其特征在于，所述工程菌是采用权利要求4所述的重组表达质粒载体，转化宿主细菌得到，所述宿主细菌为谷氨酸棒杆菌。

9.权利要求7所述的产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

10.权利要求8所述的产岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌代谢工程菌在生产3-岩藻糖基乳糖中的应用。

11.一种岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）配制发酵培养基和种子培养基，其碳源为葡萄糖，浓度为5.0~100.0 g/L；

（2）培养权利要求7或8所述的工程菌，在培养基中活化工程菌种子液，并在相应规模的发酵罐中逐级放大制备种子培养液；

12.根据权利要求11所述的生产方法，其特征在于，所述发酵罐培养条件：25℃-37℃，通气量0.5-2.0 vvm，搅拌转速100 -600 rpm，培养36-100h；所述摇瓶条件为：25 -37℃，转速160 -500 rpm，培养36-100h。