CN107012161A - 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用 - Google Patents

利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107012161A
CN107012161A CN201710215458.2A CN201710215458A CN107012161A CN 107012161 A CN107012161 A CN 107012161A CN 201710215458 A CN201710215458 A CN 201710215458A CN 107012161 A CN107012161 A CN 107012161A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
corynebacterium glutamicum
genes
butanedioic acid
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710215458.2A
Other languages
English (en)
Inventor
王智文
毛雨丰
常志帅
陈涛
赵学明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201710215458.2A priority Critical patent/CN107012161A/zh
Publication of CN107012161A publication Critical patent/CN107012161A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03001—Citrate (Si)-synthase (2.3.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01017—Xylulokinase (2.7.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/03—CoA-transferases (2.8.3)
    • C12Y208/03008—Acetate CoA-transferase (2.8.3.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用，方法为：(1)在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中敲除副产物乙酸、乳酸生成途径相关基因；引入强启动子过表达染色体上的回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶以及磷酸戊糖途径转酮醛酶和转酮醇酶；在染色体上引入木糖转运基因；(2)再在步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中表达丙酮酸羧化酶、琥珀酸输出蛋白和柠檬酸合酶以及木糖异构酶和木酮糖激酶；本发明菌能够共利用秸秆水解液中的葡萄糖和木糖混合糖，经过22.5h，厌氧生产98.6gL‑1的琥珀酸，得率为0.98g琥珀酸/g总糖。琥珀酸的终浓度、得率和产率均达到了较高水平，具有良好工业化潜力。

Description

利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用。
背景技术
2004年，琥珀酸(又名丁二酸)被美国能源部列为十二个最有价值的平台化合物之一，又因其被广泛地用作可降解塑料、食品的鲜味剂和医药中间体的合成原料，所以一直被当作一种高附加值产品而被广大研究者研究。当前，化学法仍是琥珀酸合成的主要工艺，但随着传统化工产业对环境危害的不断加重，利用微生物发酵法转化可再生资源受到了越来越多的关注。微生物发酵法具有原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好以及能够吸收固定二氧化碳缓解温室效应等优点。目前对于微生物宿主的选择是多种多样的，包括天然分泌琥珀酸的厌氧微生物以及基因工程菌。研究最多的是：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes，产琥珀酸曼氏杆菌Mannheimiasucciniciproducens，产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillumsucciniciproducens，大肠杆菌Escherichia coli，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae以及谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum。
木质纤维素是公认的自然界中含量最丰富的天然可再生生物资源，利用木质纤维素转化生物质能源和生物基化学品是当前研究的前沿和热点，对解决气候变化、环境危机和能源资源等全球性问题具有重要的战略意义，对人类的可持续发展至关重要。木质纤维素水解主要组成成分为葡萄糖和常见的戊糖，其中木糖作为木质纤维素水解液中除葡萄糖外含量最多的单糖(占5％-20％),其利用水平的高低将显著影响木质纤维素生物质转化效率。
谷氨酸棒杆菌是一种兼性厌氧、生长快速的革兰氏阳性菌,作为一株成熟的工业规模氨基酸生产菌株，近年来活跃于各种化学品、生物材料(二元胺、二羧酸、二元醇以及高分子聚合物等)以及生物燃料(乙醇、高级醇等)的生物转化过程中。
在厌氧条件下，谷氨酸棒杆菌的细胞生长受到抑制，但是细胞仍有能力进行糖代谢，并大量积累比如L-乳酸，琥珀酸和乙酸等有机酸。江南大学通过基因工程改造得到的谷氨酸棒状杆菌Δldh-pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌通过好氧培养-厌氧高密度发酵，在厌氧阶段积累了75g L-1琥珀酸，并且循环利用菌体三次，产酸能力不变(张伟国，刘学胜，钱和等.一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌及其构建方法。申请号CN201310080870.X)。但没有针对副产品乙酸生成途径进行改造琥珀酸得率较低，不利于工业规模放大。野生型的谷氨酸棒杆菌不能利用木糖，而通过代谢工程手段异源表达木糖利用基因：xylA(木糖异构酶)和xylB(木酮糖激酶)能够赋予菌株木糖利用能力。南京工业大学的蔡恒课题组[参考文献1]通过敲除乳酸脱氢酶以及异源表达来自大肠杆菌的木糖异构酶和木酮糖激酶，构建出工程菌株C.glutamicumNC-2，厌氧阶段能够利用玉米秸秆水解液(55g L-1木糖和4g L-1葡萄糖)在48小时生产40.8g L-1琥珀酸。但没有针对菌株的木糖代谢能力进行进一步改造，较低的木糖消耗速率导致琥珀酸生产速率也较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种能高效率地利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌的构建。
本发明的第三个目的是提供一种能高效率地利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌的应用。
本发明的技术方案概述如下：
利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、乙酸生成途径actA基因以及乳酸生成途径ldh基因；在染色体上的回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子，再在染色体上的回补途径丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子；再在染色体上的磷酸戊糖途径转酮醛酶tkt基因的起始密码子前引入Psod强启动子，再在染色体上的磷酸戊糖途径转酮醇酶tal基因的起始密码子前引入Psod强启动子；再在染色体上乳酸脱氢酶ldh位点插入Ptuf强启动子过表达的阿拉伯糖转运蛋白基因araE；
(2)使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pECXK99E连接丙酮酸羧化酶基因pyc、琥珀酸输出蛋白基因sucE和柠檬酸合酶基因gltA得到pEC-pycsucEgltA；使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19连接木糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB得到pX-xylAB；将pEC-pycsucEgltA和pX-xylAB导入步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。
上述方法构建的利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。
上述利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌在生产琥珀酸中的用途。
有益效果
本发明的利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌能够共利用秸秆水解液中的葡萄糖和木糖混合糖，经过22.5h的厌氧发酵，积累98.6gL-1的琥珀酸，得率为0.98g琥珀酸/g总糖。琥珀酸的终浓度、得率和产率均达到了较高水平，具有良好工业化潜力。
附图说明
图1为pD-sacB敲除载体的图谱。
图2为谷氨酸棒杆菌无痕敲除原理示意图。
图3为pD-pta-ackA敲除载体的图谱。
图4为pD-actA敲除载体的图谱。
图5为pD-ldh敲除载体的图谱。
图6为pD-Psod-ppc整合载体的图谱。
图7为pD-Psod-pyc整合载体的图谱。
图8为pD-Psod-tkt整合载体的图谱。
图9为pD-Psod-tal整合载体的图谱
图10为pD-Ptuf-araE整合载体的图谱
图11为pX-xylAB表达载体的图谱。
图12为pEC-pycsucEgltA表达载体的图谱。
图13为菌株CGL10厌氧条下分批摇瓶发酵示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的原始菌株Corynebacterium glutamicum ATCC 13032来源为ATCC(The Global Bioresource Center，http://www.atcc.org/),购买于2012年10月，原始菌株B.subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)，原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestrispv.campestris8004来源为BNCC(BeNa Culture collection,www.bncc.org.cn)。重组质粒pK18mobsacB，表达质粒pXMJ19和pECXK99E购买于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)。
所用琥珀酸标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买，所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。秸秆水解液来自河南慧宝源生物医药科技有限公司。
木糖的转运是细胞吸收利用木糖的关键之一，而来自枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的阿拉伯糖转运蛋白AraE能够有效转运木糖到胞内，因此对其进行过表达。木糖在进入胞内后经过木糖异构酶和木酮糖激酶的作用下能够生成5-磷酸木酮糖进入非氧化磷酸戊糖途径，因此对其进行过表达。转酮醛酶和转酮醇酶是非氧化磷酸戊糖途径的关键酶，影响着木糖代谢的速率，因此对其进行过表达。经检索，目前未见有使用相同代谢工程改造谷氨酸棒杆菌及其利用秸秆水解液厌氧条件下生产琥珀酸的报道。
实施例1：pD-sacB敲除载体构建以及谷氨酸棒杆菌无痕敲除操作
(1)pD-sacB敲除载体构建
首先以HindIII切割后的pK18mobsacB线性片段作为模板，用引物sacB1/sacB2扩增sacB基因，约1.6kb。
将MunI/EcoRV双酶切的sacB基因连接到EcoRI/SmaI双酶切的pECXK99E上面，然后用如下的引物trcsacB1/trcsacB2，以pECXK99E-sacB质粒作为模板扩增含有trc启动子的trcsacB片段,约1.8kb。用引物pD1/pD2，以pK18mobsacB质粒作为模板扩增含有含有卡那霉素抗性和大肠杆菌复制子的pD片段,约2.6kb。最后将AatII酶切的片段trcsacB和pD进行连接得到pD-sacB。最终的pD-sacB质粒图谱如图1所示。
(2)谷氨酸棒杆菌无痕敲除操作
①基于sacB蔗糖致死原理的无痕敲除，如图2所示：
1.将构建好的敲除载体，如pD-sacB-AC质粒(AC代指欲敲除基因的上游PCR片段A和下游PCR片段C的融合而得的PCR片段AC)，通过电极转化到谷氨酸棒杆菌后,涂布于BHIS-Kan15(Kan15，指代培养基中含有终浓度为15ug/mL的卡那霉素)固体平板上，30℃培养48h左右。
2.待菌落长至可挑取大小(直径2-4mm)，对点LB-Kan25-Suc100(Kan25，指代培养基中含有终浓度为25ug/mL的卡那霉素，下同；Suc100，指代培养基中含有终浓度为100g/L的蔗糖，下同)与LB-Kan25平板，30℃培养12h，选取不在LB-Kan25-Suc100平板上面生长而在LB-Kan25上面长势良好的菌落挑至无抗LB试管中于30℃，220rpm，过夜培养(12h以上)。
3.无抗LB试管中的菌液稀释50倍，分别取20μL、40μL、60μL、80μL涂布于LB-Suc100平板。同时取稀释50倍菌液的80μL涂布于LB-Kan25-Suc100平板。最后取稀释5000倍的菌液50μL涂布于LB-Kan25平板。30℃培养24h。
4.观察平板长势，只有当LB-Kan25平板上长势良好而LB-Kan25-Suc100平板上却几乎不长时，才可进行下步筛选。从所有LB-Suc100平板上，选取50个单菌落，挑菌至试管培养后进行菌液PCR，电泳检验PCR片段长度，验证正确的重新挑菌至液体LB-Kan25试管中培养验证。
5.抽提无抗LB试管中菌液的基因组，再次进行PCR验证，片段长度与AC相符的即为成功突变的菌株，于-80℃冰箱保存。本发明对谷氨酸棒杆菌无痕敲除操作不做限定，参考文献1中公开了相关方法
其中，BHIS固体培养基：7.4g脑心浸粉与4g琼脂溶于100ml双蒸水，18.2g山梨糖溶于100mL双蒸水；脑心浸粉和山梨糖分开进行0.1Mpa压力下灭菌20min，使用时再等体积混匀。
LB液体培养基配方为：蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L),NaCl(10g/L)，调节pH至7.0。0.1Mpa压力下灭菌20min。LB液体培养基中添加20g/L的琼脂LB固体培养基。
实施例2：副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、副产物乙酸生成途径actA基因与副产物乳酸生产途径ldh基因的敲除
(1)敲除乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子的具体操作如下：
利用pta1、pta2和pta3、pta4两对引物，以C.glutamicum ATCC 13032为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为870bp和929bp的上下游同源臂。经切胶回收后利用引物pta5、pta6，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的约1.6kb的拼接产物。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestXbaI/SalI双酶切，经连接、转化后得到pta-ackA基因操纵子敲除载体pD-pta-ackA(见图3)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，按照实施例1中所述方法得到pta-ackA基因操纵子敲除菌株CGL1。
(2)敲除乙酸生成途径actA基因的具体操作如下：
利用act1、act2和act3、act4两对引物，以C.glutamicum ATCC 13032为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为802bp和900bp的上下游同源臂。经切胶回收后利用引物act5、act6，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的约1.7kb的拼接产物。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestXbaI/SalI双酶切，经连接、转化后得到actA基因敲除载体pD-actA(见图4)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL1中，按照实施例1中所述方法得到actA基因敲除菌株CGL2。
(3)敲除乳酸生成途径ldh基因的具体操作如下：
利用ldh1、ldh2和ldh3、ldh4两对引物，以C.glutamicum ATCC 13032为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为723bp和784bp的上下游同源臂。经切胶回收后利用引物ldh1、ldh4，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的约1.5kb的拼接产物。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestEcoRI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到ldh基因敲除载体pD-ldh(见图5)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL2中，按照实施例1中所述方法得到ldh基因敲除菌株CGL3。
实施例3：染色体上回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子、染色体上丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子(和001的说法不同)
(1)染色体上回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。sodppc1和sodppc2用于扩增基因ppc的上游片段(557bp)。sodppc3和sodppc4用于扩增sod基因的启动子(192bp)。sodppc5和sodppc6用于扩增基因ppc的起始片段(563bp)。分别将3个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用sodppc1和sodppc6作为引物，扩增得到三个片段的融合产物(1.3kb)。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到载体pD-Psod-ppc(见图6)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL3中，按照实施例1中所述方法得到染色体ppc基因的起始密码子前引入强启动子Psod的菌株CGL4。
(2)染色体上丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。sodpyc1和sodpyc2用于扩增基因pyc的上游片段(522bp)。sodpyc3和sodpyc4用于扩增sod基因的启动子(192bp)。sodpyc5和sodpyc6用于扩增基因pyc的起始片段(512bp)。分别将3个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用sodpyc1和sodpyc6作为引物，扩增得到三个片段的融合产物(1.3kb)。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到pyc基因插入染色体强启动子Psod载体pD-Psod-pyc(见图7)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL4中，按照实施例1中所述方法得到染色体pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子菌株CGL5。
实施例4：染色体上的磷酸戊糖途径转酮醛酶tkt基因的起始密码子前引入Psod强启动子、染色体上的磷酸戊糖途径转酮醇酶tal基因的起始密码子前引入Psod强启动子
(1)染色体上的磷酸戊糖途径转酮醛酶tkt基因的起始密码子前引入Psod强启动子的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。sodtkt1和sodtkt2用于扩增基因tkt的上游片段(501bp)。sodtkt3和sodtkt4用于扩增sod基因的启动子(192bp)。sodtkt5和sodtkt6用于扩增基因tkt的起始片段(538bp)。分别将3个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用sodtkt1和sodtkt6作为引物，扩增得到三个片段的融合产物(1.2kb)。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestBamHI/SalI双酶切，经连接、转化后得到tkt基因插入染色体强启动子Psod载体pD-Psod-tkt(见图8)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL5中，按照实施例1中所述方法得到染色体tkt基因插入强启动子Psod菌株CGL6。
(2)染色体上的磷酸戊糖途径转酮醇酶tal基因的起始密码子前引入Psod强启动子的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。sodtal1和sodtal2用于扩增基因tal的上游片段(511bp)。sodtal3和sodtal4用于扩增sod基因的启动子(192bp)。sodtal5和sodtal6用于扩增基因tal的起始片段(552bp)。分别将3个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用sodtal1和sodtal6作为引物，扩增得到三个片段的融合产物(1.2kb)。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestEcoRI/SalI双酶切，经连接、转化后得到tal基因插入染色体强启动子Psod载体pD-Psod-tal(见图9)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL6中，按照实施例1中所述方法得到染色体tal基因插入强启动子Psod菌株CGL7。
实施例5：染色体上乳酸脱氢酶ldh位点插入Ptuf强启动子过表达的阿拉伯糖转运蛋白基因araE
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。Ptuf-araE1和Ptuf-araE2用于扩增tuf基因的启动子(200bp)。以B.subtilis168基因组为模板，Ptuf-araE3和Ptuf-araE4用于扩增araE基因(1.5kb)。分别将2个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用Ptuf-araE1和Ptuf-araE4作为引物，扩增得到两个片段的融合产物(1.7kb)。然后将融合产物和pD-ldh质粒使用Thermo Fast digest SalI/NdeI双酶切，经连接、转化后得到araE基因插入染色体强启动子Ptuf载体pD-Ptuf-araE(见图10)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL7中，按照实施例1中所述方法得到染色体上乳酸脱氢酶ldh位点插入Ptuf强启动子过表达的阿拉伯糖转运蛋白基因araE菌株CGL8。
实施例6：使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19连接木糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB得到pX-xylAB
以野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrispv.Campestris 8004基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-xylAB1和p-xylAB2用于扩增基因xylA片段(约1.3kp)，p-xylAB3和p-xylAB4用于扩增xylB基因(1.5kb)。分别将2个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用p-xylAB1和p-xylAB4作为引物，扩增得到两个片段的融合产物(2.8kb)。然后将片段和pXMJ19质粒使用Thermo Fast digest HindIII/XbaI双酶切，经连接、转化后得到xylA基因、xylB基因的表达载体pX-xylAB(见图11),测序检测无误。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL8中，得到pXMJ19过表达木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的CGL9。
实施例7：使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pECXK99E连接丙酮酸羧化酶基因pyc、琥珀酸输出蛋白基因sucE和柠檬酸合酶基因gltA得到pEC-pycsucEgltA
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-pyc1和p-pyc2用于扩增基因pyc片段(约3kp)。然后将片段和pECXK99E质粒使用Thermo Fastdigest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到pyc基因表达载体pEC-pyc,测序检测无误。以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-sucE1和p-sucE2用于扩增基因sucE以及其本身启动子的片段(约2.2kp)。然后将片段和pEC-pyc质粒使用Thermo Fast digest XbaI/SbfI双酶切，经连接、转化后得到pyc、sucE基因表达载体pEC-pycsucE,测序检测无误。以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-gltA1和p-gltA2用于扩增基因gltA片段(约1.3kp)。然后将片段和pEC-pycsucE质粒使用Thermo Fast digest SbfI单酶切，经连接、转化后得到pyc、sucE和gltA基因表达载体pEC-pycsucEgltA(见图12),将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL9中，得到pECXK99E过表达丙酮酸羧化酶基因pyc、琥珀酸输出蛋白基因sucE和柠檬酸合酶基因gltA的菌株CGL10。
本发明中的菌株代号如CGL1～CGL10等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。
表1 菌株构建所用引物序列
实施例6：利用构建的菌株进行两阶段高密度分批摇瓶厌氧发酵
琥珀酸发酵采用两阶段操作法:
第一阶段，取一管CGL10菌株-80℃保藏的对数期种子培养液冰上融化后全部接入装有50mL CGIII液体培养基的500mL锥形瓶中。30℃，220rpm过夜培养，按照10％接种量转接至装有400mlCGXII种子培养基的1000ml锥形瓶,30℃，220rpm振荡培养至后对数期，此时OD600约等于20。
第二阶段，把CGXII培养液无菌转入到预冷的400mL离心管中，4℃，5000g离心15分钟。用4℃预冷的CGXII培养基冲洗回收的菌体一次，再用3ml预冷的CGXII培养基重新悬浮菌体，然后将菌体离心转入到50ml小型厌氧血清瓶(发酵装液量25ml),添加300mMNaHCO3(NaHCO3采用秸秆水解液溶解)提供羧化反应所需要的CO2，用秸秆水解液补齐体积,30℃，220rpm进行厌氧阶段发酵。发酵初始OD600约等于100，秸秆水解液发酵的初始葡萄糖浓度约为71g L-1，初始木糖浓度约为30g L-1。经22.5h发酵之后，琥珀酸浓度达到98.6g L-1，平均琥珀酸得率为0.98g(g sugar)-1，平均琥珀酸产率为4.4g L-1h-1。副产物乙酸浓度为2.4gL-1(见图13)。
CGIII培养基配方为:葡萄糖(30g L-1),蛋白胨(10g L-1),酵母抽提物(10g L-1),NaCl(10g L-1),3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)(21g L-1)(pH 7.0)。
CGXII培养基配方为:葡萄糖(30g L-1),(NH4)2SO4(5g L-1),urea(5g L-1),KH2PO4(1g L-1),K2HPO4(1g L-1),MgSO4·7H2O(0.25g L-1),CaCl2(10mg L-1),FeSO4·7H2O(10mg L-1),MnSO4·H2O(0.1mg L-1),ZnSO4·7H2O(1mg L-1),CuSO4·5H2O(0.2mg L-1),NiCl2·6H2O(20μg L-1),biotin(0.4mg L-1),MOPS(21g L-1)(pH 7.0)。
从发酵结果可以看出，本发明所构建的利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株能同时共利用葡萄糖和木糖以较高的生产速率和得率生产琥珀酸，并积累很少的副产物，具有很好的应用前景。
本发明构建的菌株，其基因型为C.glutamicum 13032ΔldhΔpta-ackAΔactA；Psod-pycPsod-ppcPsod-tktPsod-talPtuf-araEpEC-pycsucEgltA pX-xylAB，KanR CmR。其可以利用葡萄糖生产较高浓度较高得率的琥珀酸。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
参考文献1 Wang,C.,et al.,Succinic Acid Production from Corn CobHydrolysates by Genetically Engineered Corynebacteriumglutamicum.AppliedBiochemistry and Biotechnology,2013:p.1-11.
参考文献2A,Tauch A,W,Kalinowski J,Thierbach G,Pühler A(1994)Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E.coliplasmids pK18and pK19:selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacteriumglutamicum.Gene 145:69–73.
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用
<130>
<160> 60
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgtgccaatt ggataaagca ggcaagacct a 31
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgtgcgatat cccatcggca ttttcttttg cgt 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agctctgacg tcttatcatc gactgcacgg tgca 34
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agctctgacg tccccatcgg cattttcttt tgcgt 35
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
agctctgacg tcaaccccag agtcccgctc agaagaa 37
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agctctgacg tcatgatcct ccagcgcggg gatctcat 38
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ccacgaacct tccagatcag 20
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ggaggcatcg gtggaaatca gaatccatcg aagctgcggt 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
accgcagctt cgatggattc tgatttccac cgatgcctcc 40
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tgagtgaatc ccgcatccga 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
aggctctaga gactcaccga aatccccaca 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atgcgtcgac actcacgcaa ctcctcaaca 30
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
aaggaatcgc agaaccgcca 20
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
agccgttctt agccaggttg ccggagaaac caaccttgtc 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gacaaggttg gtttctccgg caacctggct aagaacggct 40
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
gctgcggctg attttgctga 20
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
atgcgtcgac gatcatcttc gccgcttcgt 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
aggctctaga tcacgggaat ttcgcggttg 30
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
atcggaattc ccaaggtgcc gacactaat 29
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
cggtgatttc gcaactccaa catctcctg 29
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
ttggagttgc gaaatcaccg accacgaga 29
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
ccggaagctt gcttccagac ggtttcatc 29
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
agataagctt aaatccgtga agctggcacc 30
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
cccggaataa ttggcagcta taactacttt aaacactctt tcac 44
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
gtgaaagagt gtttaaagta gttatagctg ccaattattc cggg 44
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
gtcatcgcgt aaaaaatcag tcatgggtaa aaaatccttt cgta 44
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
tacgaaagga ttttttaccc atgactgatt ttttacgcga tgac 44
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
agattctaga atgcgacggc ggatgttctt 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gataaagctt gctgtggcag tgaccaaccg 30
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
tagctgccaa ttattccggg 20
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
cccggaataa ttggcagcta tagagtaatt attcctttca acaagagacc 50
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gaagatgtgt gagtcgacat gggtaaaaaa tcctttcgta 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
tacgaaagga ttttttaccc atgtcgactc acacatcttc 40
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
gagctctaga ggcaactgcc ttcacaaaga 30
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
gagccggatc ccaaaactcg cgcggaacca gacctt 36
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
gggtcacaag cccggaataa ttggcagcta tccttcctgg gttaaaccgg ga 52
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
tagctgccaa ttattccggg 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
gggtaaaaaa tcctttcgta g 21
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc atgaccacct tgacgctgt 49
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
gccaggtcga ctctagcaga agcaatgacg tagatgtg 38
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
catgcgaatt cgaaacccca gatgtgatcc tcatgg 36
<210> 42
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
gggtcacaag cccggaataa ttggcagcta ccttaaaaga attgttcttg aactg 55
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
tagctgccaa ttattccggg 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
gggtaaaaaa tcctttcgta g 21
<210> 45
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc atgtctcaca ttgatgatct tgcac 55
<210> 46
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
gccaggtcga ctctagctgc ttgatgccct cgatgaac 38
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
cttcagtcga cgccgttacc ctgcgaatgt cc 32
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
atcagtcgac gagctccgat aggatccagg tatctagatg tatgtcctcc tggacttcg 59
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
acgcttctag aaaaggagga caaccatgaa gaatactcca actc 44
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
cgactcatat gtataaacag cccttcccgt ag 32
<210> 51
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
ccggaagctt aaaggaggac aaccatgtcg actcacacat cttcaac 47
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
ctagtctaga ctttaggaaa cgacgacgat caagt 35
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 53
cgcgtctaga accaagaccg ctgttgcagt ga 32
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
agatcctgca ggtgcgctta aggggtcaat gc 32
<210> 55
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 55
atatcctgca ggccgtaatc cggaagagtt t 31
<210> 56
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 56
atatcctgca ggctaaattt agcgctcctc gc 32
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 57
tgtaagctta aaggaggaca accatgagca acaccgtttt catcgg 46
<210> 58
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 58
cgctcatggt tgtcctcctt tggtaccaca tcaacgcgtc aggtact 47
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
accaaaggag gacaaccatg agcgtgtacg taggact 37
<210> 60
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 60
ctgtctagac cttggtactg ggggagtgat gaat 34

Claims (3)

1.利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、乙酸生成途径actA基因以及乳酸生成途径ldh基因；在染色体上的回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子，再在染色体上的回补途径丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子；再在染色体上的磷酸戊糖途径转酮醛酶tkt基因的起始密码子前引入Psod强启动子，再在染色体上的磷酸戊糖途径转酮醇酶tal基因的起始密码子前引入Psod强启动子；再在染色体上乳酸脱氢酶ldh位点插入Ptuf强启动子过表达的阿拉伯糖转运蛋白基因araE；
(2)使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pECXK99E连接丙酮酸羧化酶基因pyc、琥珀酸输出蛋白基因sucE和柠檬酸合酶基因gltA得到pEC-pycsucEgltA；使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19连接木糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB得到pX-xylAB；将pEC-pycsucEgltA和pX-xylAB导入步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。
2.权利要求1所述的方法构建的利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。
3.权利要求2所述的利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌在生产琥珀酸中的用途。
CN201710215458.2A 2017-04-03 2017-04-03 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用 Pending CN107012161A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710215458.2A CN107012161A (zh) 2017-04-03 2017-04-03 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710215458.2A CN107012161A (zh) 2017-04-03 2017-04-03 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107012161A true CN107012161A (zh) 2017-08-04

Family

ID=59446635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710215458.2A Pending CN107012161A (zh) 2017-04-03 2017-04-03 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107012161A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402158A (zh) * 2018-09-14 2019-03-01 江苏大学 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN110551648A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 天津大学 发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途
CN112458108A (zh) * 2020-11-24 2021-03-09 华东理工大学 一种在谷氨酸棒状杆菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路径的构建方法
CN112481265A (zh) * 2020-12-09 2021-03-12 江南大学 枯草芽孢杆菌人工终止子及其应用
WO2023142862A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种生产苏氨酸的重组微生物及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102066553A (zh) * 2008-06-17 2011-05-18 财团法人地球环境产业技术研究机构 具有改进的d-木糖利用能力的棒状杆菌转化体
CN104845923A (zh) * 2014-02-14 2015-08-19 中国科学院微生物研究所 生产l-组氨酸的方法及其专用重组菌
CN105441372A (zh) * 2015-10-30 2016-03-30 清华大学 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
CN106047916A (zh) * 2016-06-03 2016-10-26 天津大学 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102066553A (zh) * 2008-06-17 2011-05-18 财团法人地球环境产业技术研究机构 具有改进的d-木糖利用能力的棒状杆菌转化体
CN104845923A (zh) * 2014-02-14 2015-08-19 中国科学院微生物研究所 生产l-组氨酸的方法及其专用重组菌
CN105441372A (zh) * 2015-10-30 2016-03-30 清华大学 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
CN106047916A (zh) * 2016-06-03 2016-10-26 天津大学 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李桂莹: "高效利用戊糖产琥珀酸谷氨酸棒杆菌的构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110551648A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 天津大学 发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途
CN110551648B (zh) * 2018-05-30 2022-03-15 天津大学 发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途
CN109402158A (zh) * 2018-09-14 2019-03-01 江苏大学 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN109402158B (zh) * 2018-09-14 2022-01-11 江苏大学 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN112458108A (zh) * 2020-11-24 2021-03-09 华东理工大学 一种在谷氨酸棒状杆菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路径的构建方法
CN112481265A (zh) * 2020-12-09 2021-03-12 江南大学 枯草芽孢杆菌人工终止子及其应用
CN112481265B (zh) * 2020-12-09 2022-11-01 江南大学 枯草芽孢杆菌人工终止子及其应用
WO2023142862A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种生产苏氨酸的重组微生物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107012161A (zh) 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用
Liu et al. Production of poly-β-hydroxybutyrate on molasses by recombinant Escherichia coli
Pérez-García et al. Fermentative production of L‐pipecolic acid from glucose and alternative carbon sources
CN107012160A (zh) 高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法及应用
Gokarn et al. Expression of pyruvate carboxylase enhances succinate production in Escherichia coli without affecting glucose uptake
Chistoserdova Applications of methylotrophs: can single carbon be harnessed for biotechnology?
CN103215286B (zh) 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
Liu et al. Industrial production of L-lysine in Corynebacterium glutamicum: Progress and prospects
CN104878034B (zh) L-赖氨酸基因工程生产菌
CN104278003B (zh) 生产d-乳酸的重组大肠杆菌及其应用
CN103881954A (zh) 一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法
CN109321590A (zh) 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN102154339A (zh) 一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法
JP6410731B2 (ja) 代謝的に操作されたプロピオン酸菌を用いるｎ−プロパノールおよびプロピオン酸を生成するためのプロセス
CN102533626A (zh) 利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法
Xia et al. Direct conversion of cheese whey to polymalic acid by mixed culture of Aureobasidium pullulans and permeabilized Kluyveromyces marxianus
Hu et al. Efficient production of d-1, 2, 4-butanetriol from d-xylose by engineered Escherichia coli whole-cell biocatalysts
CN108441525A (zh) 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN105062938A (zh) 一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产d-乳酸的工程菌及其构建和应用
Heyndrickx et al. Fermentation of D-xylose by Clostridium butyricum LMG 1213t1 in chemostats
CN103509747B (zh) 一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌及其构建方法
CN112280725B (zh) 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法
CN106884001B (zh) 一种重组嗜碱芽孢杆菌及其制备方法和应用以及制备d-乳酸的方法
Ayodele et al. Microbial protein production using lignocellulosic biomass (switchgrass) and klebsiella oxytoca M5A1—A nitrogen fixer
CN103937733B (zh) 一株利用蔗糖产丁二酸基因工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170804

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication